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【摘 要】 目的：建立椭圆叶花锚HPLC指纹图谱，为黔产椭圆叶花锚药材质量评价提供实验基础。方法：取黔产椭圆叶花锚药材甲醇提取物，分析采用Camesil C18色谱柱（250×4.6 mm，5 μm）;以25%甲醇溶液-乙腈为流动相，梯度洗脱，流速：1.0 mL;检测波长258 nm，柱温：40 ℃。结果：建立的HPLC指纹图谱中有14个共有峰，采用“中药色谱指纹图谱相相似度评价系统（2012版）”进行分析，12批样品相似度均大于0.90。通过与对照品保留时间及UV吸收光谱比较，确定12号峰为齐墩果酸。结论：建立的方法简便易行，重复性好，可系统、全面的评价黔产椭圆叶花锚药材质量。
【关键词】
黔产椭圆叶花锚;HPLC指纹图谱;质量评价
【中图分类号】R282 【文献标志码】 A 【文章编号】1007-8517（2021）19-0046-04
Establishment of HPLC Fingerprints of Halenia Elliptica D.Don in Guizhou Province
HE Yu XING Canqiong
Bijie inspection and testing center of administration for maeket supervision， Bijie 551700， China
Abstract：
Objective To establish chromatographic fingerprints by HPLC of Halenia elliptica D.Don，so as to provide scientific basis for the Halenia elliptica D.Don in Guizhou province. Method Analysis was performed on Camesil C18 column （5 μm，250 nm×4.6 nm） with gradient mobile phase of 25% Methanol solution-acetonitrile，Flow phase gradient change.The flow rate was 1mL/min and column temperature was 40℃.The detection wavelength was set 258 nm. Results 14 common peaks were confirmed in HPLC fingerprints from 12 batches Halenia elliptica D.Don in Guizhou province.Use similarity evaluation system of traditional Chinese medicine（2012 edition）for analysis，The similarity of all 12 samples are greater than 0.90.Comparison with standard substance retention time and UV absorption spectroscopy， confirm that peak 12 is oleanolic acid.Conclusion The method established is simple and easy to repeat， can systematically and comprehensively evaluate the quality of the Halenia elliptica D.Don in Guizhou province.
Key words：
Halenia Elliptica D.Don in Guizhou Province; HPLC Fingerprints; Evaluate the Quality
橢圆叶花锚为龙胆科植物椭圆叶花锚Halenia elliptica D.Don的干燥全草。为我省少数民族用药，收载于《贵州省中药材、民族药材质量标准》（2003 版），贵州习称黑耳草[1]、阿小根、龙胆、青鱼胆、肝炎药、黑节苦草、鸡脚莲、花锚、甲地然果、四棱草、小儿肿消、花脸锚等。据文献记载[2-3]，我国花锚植物共2种1变种，即椭圆叶花锚Halenia elliptica D.Don（包括原变种卵萼花锚H.elliptica var.elliptica及变种大花花锚H.elliptica var.grandiflora）和花锚H.corniculata（Linn）Comaz。花锚H.corniculata（Linn）Comaz主要分布于内蒙东北部、华北地区[8];椭圆叶花锚Halenia elliptica D. Don主产于西藏、青海、云南、陕西、甘肃、四川、云南、贵州省等。根文献报道[4-11]：椭圆叶花锚含有多种化学成分，主要有酮类、酮苷类、黄酮苷类、裂环烯醚萜类、三萜类以及甾体类成分。较多文献报道对其中的齐墩果酸进行含量测定[5]，仅测定单一成分的含量，并不能有效的对其质量进行全面评价，因此，本文拟建立HPLC指纹图谱，以便更加全面的评价黔产椭圆叶花锚的质量。
2 方法与结果
2.1 材料
2.1.1 仪器与试药 Waters e2695高效液相色谱仪;AY-120型电子分析天平（日本岛津公司）;DK-98-Ⅱ电热恒温水浴锅（天津泰斯特仪器有限公司）;乙醇、磷酸为分析纯，甲醇、乙腈为色谱纯，试验用水为纯化水;齐墩果酸对照品（中国食品药品检定研究院 批号：110709-201808）。 2.1.2 样品信息 椭圆叶花锚采自贵州省各地区，经贵州省药品检验所中药学专家李杨老师鉴定为为龙胆科植物椭圆叶花锚Halenia elliptica D. Don，样品除去泥沙，晒干，粉碎，过四号筛，备用。 样品详情见表1。
2.2 试验与结果
2.2.1 色谱条件 Camesil C18色谱柱（250×4.6 mm，5 μm）;以25%甲醇为流动相A，乙腈为流动相B，按下表进行梯度洗脱;流速：1.0 mL;检测波长258 nm，柱温：40 ℃。（见表2）
2.2.2 对照品溶液的制备 取齐墩果酸对照品对照品适量，加甲醇制成每1 mL含0.1 mg的溶液，即得。
2.2.3 供试品溶液的制备 取椭圆叶花锚细粉1 g，置具塞锥形瓶中，精密加甲醇25 mL，称定重量，水浴加热回流2 h，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，用0.45 μm的微孔滤膜，即得。
2.2.4 精密度考察 取同一药材粉末（S1）约1 g，按2.2.3项下方法制成供试品溶液，按2.2.1项下的色谱条件进样测定，测得各共有色谱峰相对保留时间和相对峰面积RSD（%）分别为1.05%与1.24%（n=6），表明仪器精密度良好。
2.2.5 重复性考察 取同一药材粉末（S1）6份，每份约1 g，按2.2.3项下方法制成供试品溶液，按2.2.1项下的色谱条件进样测定，测得各共有色谱峰相对保留时间和相对峰面积RSD（%）分别为1.59%与1.38%（n=6），表明本方法的重复性良好。
2.2.6 稳定性考察 取同一药材粉末（S1）约1 g，按2.2.3项下方法制成供试品溶液，按2.2.1项下的色谱条件进样测定，于0、2、4、8、12、24、48 h分别依次进样测定，测得各共有色谱峰相对保留时间和相对峰面积的RSD（%）分别为1.42%与1.61%，均小于2.0%，达到规定要求，表明供试品溶液在48 h内稳定。
2.2.7 特征峰的确定 根据12批黔产椭圆叶花锚药材的HPLC图谱的测定结果，共分离出23个色谱峰，将样品的HPLC图谱导入“中药色谱指纹图谱相相似度评价系统（2012版）”进行分析，多点校正，时间窗宽度为0.1，对照图谱生成为中位数，生成黔产椭圆叶花锚药材HPLC对照指纹图谱，共指认了14个共有色谱峰。根据齐墩果酸对照品与样品的HPLC色谱图及对应色谱峰的保留时间及UV光谱图进行对比分析，确认12号峰为齐墩果酸峰，且均达到了基线分离，峰信号较强。如图1所示。
2.2.8 相似度计算及结果分析 将生成的对照图谱与12批样品的HPLC色谱图分别导入“中药色谱指纹图谱相相似度评价系统（2012版）”进样分析，计算相似度，结果见表3。
12批黔产椭圆叶花锚药材的相似度均在0.90以上，说明各品种之间相似度较高，样品质量比较稳定，所建立的HPLC指纹图谱具有一定的代表性与实用性。
2.3 讨论与小结
2.3.1 检测波长的选择 采用Waters PDA检测器在200～400 nm的波长范围内进行全波段扫描，结果在258 nm的波长处时，HPLC色谱图信息量较大，峰形较好，对照品与相邻杂质峰之间均达到基线分离，空白溶液无干扰。
2.3.2 流动相的选择 分别考察了甲醇-水，甲醇-0.2%磷酸溶液，乙腈-水，乙腈-0.2%磷酸溶液，25%甲醇-乙腈等流动相体系，经反复优化调整后梯度洗脱比例，结果25%甲醇-乙腈做流动时相色谱图分离效果最佳。
2.3.3 样品溶液提取方法选择 样品分别采用不同浓度的甲醇和乙醇作溶剂水浴回流1～3 h不等，经试验发现，甲醇作溶剂时，杂质峰干扰较小，水浴回流2h，供试品成分提取较完全，色谱峰信息量较大，故选择用甲醇作溶剂，水浴回流2h进行供试品溶液的制备。
2.3.4 相似度评价 建立HPLC指纹图谱，并对12批样品进行相似度评价，结果12批样品的相似度均在0.90以上，采用龙胆科植物其他属种的药材进行相互验证，结果相似度较低，表明该指纹图谱能系统地阐明黔产椭圆叶花黔锚药材内在的品质特征，以期能为该药材的质量控制提供参考。
参考文献
[1]贵州省药品监督管理局.贵州省中药、民族药材质量标准[M].贵阳：贵州科技出版社，2003：280.
[2]中華人民共和国卫生部药典委员会.中华人民共和国卫生部药品标准·藏药（第一册）[M].1995：45.
[3]王国强.全国中草药汇编（卷二）[M].北京：人民卫生出版社，2014：1031-1032.
[4]杨红澎，薛会清.椭圆叶花锚中挥发油化学成分的GC-MS分析[J].天津农学院学报，2008，15（3）：11-14.
[5]杨慧玲，刘建全.不同地区和生长物候期藏药花锚有效成分齐墩果酸的含量变化研究[J].中国药学杂质，2004，39（9）：659.
[6]纪兰菊，吉文鹤，陈桂琛，等.藏药椭圆叶花锚中抗肝炎有效成分的含量测定[J].武汉植物学研究，2004，22（5）：473-476.
[7]高光跃，李鸣，冯毓秀，等.11种獐牙菜及近缘植物中有效成分的高效液相色谱法测定[J]. 药学学报，1994，29（12）：910-914.
[8]中国科学院植物研究所.中国植物志，六十二卷[M].北京：科学出版社，1988：291.
[9]纪兰菊，丁晨旭，陈桂琛.反高效液相色谱法测定野生与栽培花锚药材及其制剂中的花锚苷和去甲氧基花锚苷[J].色谱，2004，22（1）：38-40.
[10]张经明，鲍文莲，高海平，等.花锚治疗肝炎的有效成分探讨[J].青海医学院学报，1984，1（12）：11-14.
[11]中国科学院植物研究所.中国植物志，六十二卷[M].北京：科学出版社，1988：291.
[12]王振旺，邬国栋.龙胆科三种地格达类蒙药材的显微鉴别研究[J].北方药学，2013，10（3）：6-7.
[13]道日娜.蒙药材花锚的生药鉴定[J].中国民族医药杂志，2014，8（8）：16.
[14]阳勇，钟国跃，武小斌，等.常用藏药“蒂达（藏茵陈）”各品种的薄层色谱鉴别研究[J].中国中药杂志，2013，38（5）：757-760.
（收稿日期：2021-03-02 编辑：刘斌）
【关键词】
黔产椭圆叶花锚;HPLC指纹图谱;质量评价
【中图分类号】R282 【文献标志码】 A 【文章编号】1007-8517（2021）19-0046-04
Establishment of HPLC Fingerprints of Halenia Elliptica D.Don in Guizhou Province
HE Yu XING Canqiong
Bijie inspection and testing center of administration for maeket supervision， Bijie 551700， China
Abstract：
Objective To establish chromatographic fingerprints by HPLC of Halenia elliptica D.Don，so as to provide scientific basis for the Halenia elliptica D.Don in Guizhou province. Method Analysis was performed on Camesil C18 column （5 μm，250 nm×4.6 nm） with gradient mobile phase of 25% Methanol solution-acetonitrile，Flow phase gradient change.The flow rate was 1mL/min and column temperature was 40℃.The detection wavelength was set 258 nm. Results 14 common peaks were confirmed in HPLC fingerprints from 12 batches Halenia elliptica D.Don in Guizhou province.Use similarity evaluation system of traditional Chinese medicine（2012 edition）for analysis，The similarity of all 12 samples are greater than 0.90.Comparison with standard substance retention time and UV absorption spectroscopy， confirm that peak 12 is oleanolic acid.Conclusion The method established is simple and easy to repeat， can systematically and comprehensively evaluate the quality of the Halenia elliptica D.Don in Guizhou province.
Key words：
Halenia Elliptica D.Don in Guizhou Province; HPLC Fingerprints; Evaluate the Quality
橢圆叶花锚为龙胆科植物椭圆叶花锚Halenia elliptica D.Don的干燥全草。为我省少数民族用药，收载于《贵州省中药材、民族药材质量标准》（2003 版），贵州习称黑耳草[1]、阿小根、龙胆、青鱼胆、肝炎药、黑节苦草、鸡脚莲、花锚、甲地然果、四棱草、小儿肿消、花脸锚等。据文献记载[2-3]，我国花锚植物共2种1变种，即椭圆叶花锚Halenia elliptica D.Don（包括原变种卵萼花锚H.elliptica var.elliptica及变种大花花锚H.elliptica var.grandiflora）和花锚H.corniculata（Linn）Comaz。花锚H.corniculata（Linn）Comaz主要分布于内蒙东北部、华北地区[8];椭圆叶花锚Halenia elliptica D. Don主产于西藏、青海、云南、陕西、甘肃、四川、云南、贵州省等。根文献报道[4-11]：椭圆叶花锚含有多种化学成分，主要有酮类、酮苷类、黄酮苷类、裂环烯醚萜类、三萜类以及甾体类成分。较多文献报道对其中的齐墩果酸进行含量测定[5]，仅测定单一成分的含量，并不能有效的对其质量进行全面评价，因此，本文拟建立HPLC指纹图谱，以便更加全面的评价黔产椭圆叶花锚的质量。
2 方法与结果
2.1 材料
2.1.1 仪器与试药 Waters e2695高效液相色谱仪;AY-120型电子分析天平（日本岛津公司）;DK-98-Ⅱ电热恒温水浴锅（天津泰斯特仪器有限公司）;乙醇、磷酸为分析纯，甲醇、乙腈为色谱纯，试验用水为纯化水;齐墩果酸对照品（中国食品药品检定研究院 批号：110709-201808）。 2.1.2 样品信息 椭圆叶花锚采自贵州省各地区，经贵州省药品检验所中药学专家李杨老师鉴定为为龙胆科植物椭圆叶花锚Halenia elliptica D. Don，样品除去泥沙，晒干，粉碎，过四号筛，备用。 样品详情见表1。
2.2 试验与结果
2.2.1 色谱条件 Camesil C18色谱柱（250×4.6 mm，5 μm）;以25%甲醇为流动相A，乙腈为流动相B，按下表进行梯度洗脱;流速：1.0 mL;检测波长258 nm，柱温：40 ℃。（见表2）
2.2.2 对照品溶液的制备 取齐墩果酸对照品对照品适量，加甲醇制成每1 mL含0.1 mg的溶液，即得。
2.2.3 供试品溶液的制备 取椭圆叶花锚细粉1 g，置具塞锥形瓶中，精密加甲醇25 mL，称定重量，水浴加热回流2 h，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，用0.45 μm的微孔滤膜，即得。
2.2.4 精密度考察 取同一药材粉末（S1）约1 g，按2.2.3项下方法制成供试品溶液，按2.2.1项下的色谱条件进样测定，测得各共有色谱峰相对保留时间和相对峰面积RSD（%）分别为1.05%与1.24%（n=6），表明仪器精密度良好。
2.2.5 重复性考察 取同一药材粉末（S1）6份，每份约1 g，按2.2.3项下方法制成供试品溶液，按2.2.1项下的色谱条件进样测定，测得各共有色谱峰相对保留时间和相对峰面积RSD（%）分别为1.59%与1.38%（n=6），表明本方法的重复性良好。
2.2.6 稳定性考察 取同一药材粉末（S1）约1 g，按2.2.3项下方法制成供试品溶液，按2.2.1项下的色谱条件进样测定，于0、2、4、8、12、24、48 h分别依次进样测定，测得各共有色谱峰相对保留时间和相对峰面积的RSD（%）分别为1.42%与1.61%，均小于2.0%，达到规定要求，表明供试品溶液在48 h内稳定。
2.2.7 特征峰的确定 根据12批黔产椭圆叶花锚药材的HPLC图谱的测定结果，共分离出23个色谱峰，将样品的HPLC图谱导入“中药色谱指纹图谱相相似度评价系统（2012版）”进行分析，多点校正，时间窗宽度为0.1，对照图谱生成为中位数，生成黔产椭圆叶花锚药材HPLC对照指纹图谱，共指认了14个共有色谱峰。根据齐墩果酸对照品与样品的HPLC色谱图及对应色谱峰的保留时间及UV光谱图进行对比分析，确认12号峰为齐墩果酸峰，且均达到了基线分离，峰信号较强。如图1所示。
2.2.8 相似度计算及结果分析 将生成的对照图谱与12批样品的HPLC色谱图分别导入“中药色谱指纹图谱相相似度评价系统（2012版）”进样分析，计算相似度，结果见表3。
12批黔产椭圆叶花锚药材的相似度均在0.90以上，说明各品种之间相似度较高，样品质量比较稳定，所建立的HPLC指纹图谱具有一定的代表性与实用性。
2.3 讨论与小结
2.3.1 检测波长的选择 采用Waters PDA检测器在200～400 nm的波长范围内进行全波段扫描，结果在258 nm的波长处时，HPLC色谱图信息量较大，峰形较好，对照品与相邻杂质峰之间均达到基线分离，空白溶液无干扰。
2.3.2 流动相的选择 分别考察了甲醇-水，甲醇-0.2%磷酸溶液，乙腈-水，乙腈-0.2%磷酸溶液，25%甲醇-乙腈等流动相体系，经反复优化调整后梯度洗脱比例，结果25%甲醇-乙腈做流动时相色谱图分离效果最佳。
2.3.3 样品溶液提取方法选择 样品分别采用不同浓度的甲醇和乙醇作溶剂水浴回流1～3 h不等，经试验发现，甲醇作溶剂时，杂质峰干扰较小，水浴回流2h，供试品成分提取较完全，色谱峰信息量较大，故选择用甲醇作溶剂，水浴回流2h进行供试品溶液的制备。
2.3.4 相似度评价 建立HPLC指纹图谱，并对12批样品进行相似度评价，结果12批样品的相似度均在0.90以上，采用龙胆科植物其他属种的药材进行相互验证，结果相似度较低，表明该指纹图谱能系统地阐明黔产椭圆叶花黔锚药材内在的品质特征，以期能为该药材的质量控制提供参考。
参考文献
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[5]杨慧玲，刘建全.不同地区和生长物候期藏药花锚有效成分齐墩果酸的含量变化研究[J].中国药学杂质，2004，39（9）：659.
[6]纪兰菊，吉文鹤，陈桂琛，等.藏药椭圆叶花锚中抗肝炎有效成分的含量测定[J].武汉植物学研究，2004，22（5）：473-476.
[7]高光跃，李鸣，冯毓秀，等.11种獐牙菜及近缘植物中有效成分的高效液相色谱法测定[J]. 药学学报，1994，29（12）：910-914.
[8]中国科学院植物研究所.中国植物志，六十二卷[M].北京：科学出版社，1988：291.
[9]纪兰菊，丁晨旭，陈桂琛.反高效液相色谱法测定野生与栽培花锚药材及其制剂中的花锚苷和去甲氧基花锚苷[J].色谱，2004，22（1）：38-40.
[10]张经明，鲍文莲，高海平，等.花锚治疗肝炎的有效成分探讨[J].青海医学院学报，1984，1（12）：11-14.
[11]中国科学院植物研究所.中国植物志，六十二卷[M].北京：科学出版社，1988：291.
[12]王振旺，邬国栋.龙胆科三种地格达类蒙药材的显微鉴别研究[J].北方药学，2013，10（3）：6-7.
[13]道日娜.蒙药材花锚的生药鉴定[J].中国民族医药杂志，2014，8（8）：16.
[14]阳勇，钟国跃，武小斌，等.常用藏药“蒂达（藏茵陈）”各品种的薄层色谱鉴别研究[J].中国中药杂志，2013，38（5）：757-760.
（收稿日期：2021-03-02 编辑：刘斌）