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[摘要] 目的 采用异硫氰酸荧光素标识Ⅳ型胶原单克隆抗体，为直接或间接荧光方法检测人体肝脏或血液中Ⅳ型胶原含量奠定基础。 方法 采用直接透析方法进行荧光素标识，标识后通过Sephadex G25凝胶过滤，除去多余的荧光素和其他杂质，获得标识荧光抗体纯品。经SDS-PAGE和双向免疫扩散凝胶电泳，对标识抗体进行纯度，荧光特性，抗体特异性进行检测鉴定。 结果 经全自动化学发光荧光图像分析仪检测SDS-PAGE电泳结果，激发波490nm，发射波510nm，在150KD处有一条黄绿荧光带，其他处未见条带出现，凝胶图像分析仪检测纯度达96%；免疫琼脂双向扩散电泳结果显示，标识抗体与未标识抗体与抗原之间均有乳白色沉淀线，且沉淀物含量一致，荧光分析仪检测标识抗体与中心孔之间有黄绿色荧光条带。 结论 采用本研究方法制备的荧光抗体具有纯度高、荧光性好、特异性强等特点，为临床检测人体Ⅳ型胶原含量提供便利。
[关键词] Ⅳ型胶原；荧光抗体；荧光素；FITC
[中图分类号] R392 [文献标识码] A [文章编号] 2095-0616（2015）01-37-03
[Abstract] Objective To lay the foundation of detecting the content of Ⅳ type collagen in human liver or blood through direct or indirect fluorescent method， Identifying monoclonal antibody of collagen typeⅣ by using the fluorescein isothiocyanate. Methods Using a direct dialysis method to identification of fluorescein. The purity of the identifying fluorescent antibody were obtained by Sephadex G-25 gel filtration column， which remove excess fluorescein and other impurities. The purity， fluorescence characteristic and specificity of antibody were measured with SDS-PAGE and double immune diffusion gel electrophoresis. Results The results of SDS-PAGE electrophoresis were measured by fully automatic chemiluminescence fluorescence image analyzer. Eexcitation wave 490nm and emission wave 510nm. The purified of antibody were shown only one strap of yellow with green fluorescence and the molecular weight （MW） of them were estimated to be approximately 150kD， its purity was 96%， there were not any other strap. The result of double agar gel immune-diffusion test showed that both identify antibodies and not identify antibody were combination with antigen， all of product were formed milky white precipitation lines of antigen-antibody complexes with antigen. And the sediment content was consistent. There was a strap of yellow with green fluorescence in the center hole by fluoroanalyzer. Conclusion In this study， the fluorescent antibody against human collagen type Ⅳ with high purity and strong specificity was produced by separation and purification methods， which provide convenience for clinical detection of the human body Ⅳ type collagen.
[Key words] Collagen type Ⅳ； Fluorescent antibody； Fluorescein isothiocyanate； FITC
免疫荧光技术是免疫检测技术中的一种。这种技术是将荧光示踪物质与抗体结合，利用抗原抗体反应的特异性，进行组织、细胞或体液内抗原物质的检测[1]。免疫荧光技术现已广泛应用于生物医学的检测中[2]。Ⅳ型胶原（ColⅣ）主要存在于各器官的基底膜中，是基底膜的微量成分，很多具有增生性质的疾病，ColⅣ含量与病变程度呈正相关；特
别是在肝纤维化的诊断和分型方面，ColⅣ在体内和组织中含量的检测更为重要[3-4]。本研究采用异硫氰酸荧光素（FITC）标识Ⅳ型胶原单克隆抗体，同时对标识后抗体的荧光性及特异性进行鉴定分析[5]，为建立直接荧光和间接荧光检测方法奠定基础，现报道如下。 1 材料与方法
1.1 主要仪器
X100冷冻高速离心机（HITACHI）、LP型低压层析系统（BIO-RAD）、2000C微量紫外可见光检测仪（Thermoscientific）、F-4600荧光分光光度计（Hitachi）、2500+蓝光凝胶分析仪（上海天能）、5500multi+RGB全自动化学发光荧光图像分析仪（上海天能公司）。
1.2 主要试剂
Ⅳ型胶原抗体（本实验室制备）、Sephadex G25凝胶填料（GE）、异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）（Sigma公司）、其他试剂均为国产试剂。
1.3 FITC标记Ⅳ型胶原抗体的制备和纯化
采用透析法标记、凝胶过滤法纯化[6-7]。取抗体溶液10mL，抗体含量为9mg，充分溶解。15000g/min，4℃，离心20min。弃上清，沉淀溶解于4mL pH9.8 NaHCO3缓冲液中，吹打混匀，溶液置透析袋中对上述缓冲液，4℃，透析6h，期间3次更换透析外液，透析过程在轻柔搅拌中进行。透析结束，透析内液5000g/min，4℃离心20min。取上清，微量紫外分光光度计检测抗体含量为1.62mg/mL。上清装入透析袋，置荧光标识液（200mL pH 9.8NaHCO3缓冲液+FITC 20mg至终浓度为0.1mg/L），避光4℃透析过夜。置透析袋于PBS中，终止反应透析10h，期间数次更换PBS至检测480nm吸光值为零。取葡聚糖凝胶（SephadexG-25）10g，溶于去离子水中12h后装柱。柱长1.5×30cm，200mL PBS平衡柱，将标识抗体溶液应用于SephadexG-25层析柱，流速0.2mL/min，馏分体积5mL/tube，紫外280nm监测，收集第一峰，体积为15mL；抗体浓度为0.51mg/mL。分装后-80℃保存备用。
1.4 荧光抗体的鉴定
1.4.1 标识抗体的荧光特性及纯度测定 采用SDS-PAGE电泳及凝胶分析仪、凝胶荧光分析仪鉴定标识抗体的荧光特性[8]。SDS-PAGE非还原性凝胶电泳（样品缓冲液中不添加β-巯基乙醇），分离胶10%，浓缩胶3%，恒压200V电泳2h。剥离胶板，蒸馏水浸洗2min，RGB多色荧光分析仪检测。荧光检测结束后，胶板用R-250考马斯亮蓝（0.25%）染色后，凝胶成像仪观察。
1.4.2 标识的荧光抗体特异性测定 采用凝胶免疫双向电泳检测法[9]。0.9%盐水琼脂糖制备琼脂板；待琼脂凝固后，打孔器打孔，孔径3mm，孔距10mm；加样，1孔加纯化后荧光抗体溶液（0.3mg/mL）、2孔加入未标识抗体溶液（0.3mg/mL）、3孔加入生理盐水对照、中心孔加入Ⅳ型胶原（0.5mg/mL）；每孔加样品20μL；琼脂板玻片置37℃温箱中12h。
2 结果
2.1 荧光抗体荧光特性和纯度
5500multi+RGB全自动化学发光荧光图像分析仪检测电泳结果，激发波490nm，发射波510nm，标识抗体在150KD有一条黄绿色荧光带，其他的位置未见条带出现；凝胶经染色后，凝胶成像仪检测可见标识、未标识抗体在150KD处均有一条带，其他处有染色较浅的散在条带（图1）。凝胶分析仪分析标识抗体纯度为96%。
3 讨论
免疫荧光技术是利用荧光素对抗体（抗原）进行标记，之后用于免疫检测。近年来，免疫荧光技术迅速发展，以其灵敏度高，准确性强等特点，广泛应用于生物医学和临床诊断[10]。抗体的荧光标识效果决定了荧光检测结果的准确性，决定标识效果的因素除了荧光素偶联的程度，更重要的是标识抗体的纯度[11]。本研究采用透析标识法连接荧光素和抗体。采用Sephadex G25柱层析去除未标记的荧光素和杂质，经反复试验确定其层析流速为0.2mL/min。SDS-PAGE电泳结果显示标记抗体纯度达到96%。经RGB多色荧光分析仪分析结果，标识后的抗体，在激发荧光490nm，发射波510nm处可见黄绿色荧光，符合FITC荧光素的荧光特性[12]。采用免疫双向凝胶电泳方法检测标识荧光抗体的特异性，结果显示1孔和2孔与中心孔之间均有沉淀线形成，且线的粗细程度基本相同。经荧光分析仪检测，可见1孔与中心孔之间有黄绿色线状荧光。
综上所述，本方法在常规透析标识后经Sephadex G25凝胶过滤层析后，可有效去除未连接的荧光素和其他杂质，进而保证了标识后抗体的纯度。标识后抗体的特异性从双向扩散免疫电泳结果分析，基本没有损失。实验结果证明经本方法可获得纯度高，特异性强的Ⅳ型胶原荧光抗体。为临床采用直接和间接荧光法检测人体Ⅳ型胶原，提供了方便条件，为临床早期诊断肝纤维化奠定了基础。
[参考文献]
[1] 吕雪峰，李忠勋，李志慧，等.小鹅瘟免疫荧光抗体的制备及检测方法研究[J].中国动物保健，2012，14（2）：13-15.
[2] 孙册，朱正美，顾天爵，等.糖复合生化研究技术[M].杭州：浙江大学出版社，1999：501-504.
[3] 姚敏捷，黄汉朝，李艳，等.两种检测Ⅳ型胶原蛋白ELIS法相关分析[J].细胞与分子免疫杂志，2000，16（6）：536-537.
[4] 吴鹏，李博达，徐军.人胎盘来源Ⅳ型胶原蛋白的提取与纯化[J].中国医药科学，2013，3（19）：56-58.
[5] 车风琴，徐国柱，王传峰.兔抗鸡IgG荧光抗体的制备和应用[J].新疆畜牧业，2011（1）：34-36.
[6] 郝淑美，岳秒姝，苏建青，等.犬瘟热病毒荧光抗体的制备及其鉴定[J].中国兽医学报，2008，28（9）：1008-1010.
[7] 苏建青，褚秀玲，杨松涛，等.抗犬瘟热病毒荧光标记单抗的制备和初步鉴定[J].安徽农业科学，2009，37（8）：3552-3554.
[8] 赵守山，颜世敢，朱丽萍，等.R-phycoerythrin标记抗猪病毒荧光抗体的制备及其FITC荧光抗体检测的比较研究[J].西南农业学报，2011，24（2）：1962-1966.
[9] 吴鹏，王英娇，高诗博，等.Ⅳ型胶原多克隆抗体的制备及性质研究[J].中国医药科学，2014，4（10）：27-29.
[10] 丁如.临床检验中免疫荧光技术的应用[J].实用医技杂志，2013，20（12）：1325-1326.
[11] 颜世敢，朱丽萍，张玉忠，等.藻红蛋白标记抗鸡IgG荧光抗体的高效制备[J].中国预防兽医学报，2009，31（2）：127-131.
[12] 朱正美，刘辉.简明免疫技术[M].北京：科学出版社，2002：152-153.
（收稿日期：2014-10-21）
[关键词] Ⅳ型胶原；荧光抗体；荧光素；FITC
[中图分类号] R392 [文献标识码] A [文章编号] 2095-0616（2015）01-37-03
[Abstract] Objective To lay the foundation of detecting the content of Ⅳ type collagen in human liver or blood through direct or indirect fluorescent method， Identifying monoclonal antibody of collagen typeⅣ by using the fluorescein isothiocyanate. Methods Using a direct dialysis method to identification of fluorescein. The purity of the identifying fluorescent antibody were obtained by Sephadex G-25 gel filtration column， which remove excess fluorescein and other impurities. The purity， fluorescence characteristic and specificity of antibody were measured with SDS-PAGE and double immune diffusion gel electrophoresis. Results The results of SDS-PAGE electrophoresis were measured by fully automatic chemiluminescence fluorescence image analyzer. Eexcitation wave 490nm and emission wave 510nm. The purified of antibody were shown only one strap of yellow with green fluorescence and the molecular weight （MW） of them were estimated to be approximately 150kD， its purity was 96%， there were not any other strap. The result of double agar gel immune-diffusion test showed that both identify antibodies and not identify antibody were combination with antigen， all of product were formed milky white precipitation lines of antigen-antibody complexes with antigen. And the sediment content was consistent. There was a strap of yellow with green fluorescence in the center hole by fluoroanalyzer. Conclusion In this study， the fluorescent antibody against human collagen type Ⅳ with high purity and strong specificity was produced by separation and purification methods， which provide convenience for clinical detection of the human body Ⅳ type collagen.
[Key words] Collagen type Ⅳ； Fluorescent antibody； Fluorescein isothiocyanate； FITC
免疫荧光技术是免疫检测技术中的一种。这种技术是将荧光示踪物质与抗体结合，利用抗原抗体反应的特异性，进行组织、细胞或体液内抗原物质的检测[1]。免疫荧光技术现已广泛应用于生物医学的检测中[2]。Ⅳ型胶原（ColⅣ）主要存在于各器官的基底膜中，是基底膜的微量成分，很多具有增生性质的疾病，ColⅣ含量与病变程度呈正相关；特
别是在肝纤维化的诊断和分型方面，ColⅣ在体内和组织中含量的检测更为重要[3-4]。本研究采用异硫氰酸荧光素（FITC）标识Ⅳ型胶原单克隆抗体，同时对标识后抗体的荧光性及特异性进行鉴定分析[5]，为建立直接荧光和间接荧光检测方法奠定基础，现报道如下。 1 材料与方法
1.1 主要仪器
X100冷冻高速离心机（HITACHI）、LP型低压层析系统（BIO-RAD）、2000C微量紫外可见光检测仪（Thermoscientific）、F-4600荧光分光光度计（Hitachi）、2500+蓝光凝胶分析仪（上海天能）、5500multi+RGB全自动化学发光荧光图像分析仪（上海天能公司）。
1.2 主要试剂
Ⅳ型胶原抗体（本实验室制备）、Sephadex G25凝胶填料（GE）、异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）（Sigma公司）、其他试剂均为国产试剂。
1.3 FITC标记Ⅳ型胶原抗体的制备和纯化
采用透析法标记、凝胶过滤法纯化[6-7]。取抗体溶液10mL，抗体含量为9mg，充分溶解。15000g/min，4℃，离心20min。弃上清，沉淀溶解于4mL pH9.8 NaHCO3缓冲液中，吹打混匀，溶液置透析袋中对上述缓冲液，4℃，透析6h，期间3次更换透析外液，透析过程在轻柔搅拌中进行。透析结束，透析内液5000g/min，4℃离心20min。取上清，微量紫外分光光度计检测抗体含量为1.62mg/mL。上清装入透析袋，置荧光标识液（200mL pH 9.8NaHCO3缓冲液+FITC 20mg至终浓度为0.1mg/L），避光4℃透析过夜。置透析袋于PBS中，终止反应透析10h，期间数次更换PBS至检测480nm吸光值为零。取葡聚糖凝胶（SephadexG-25）10g，溶于去离子水中12h后装柱。柱长1.5×30cm，200mL PBS平衡柱，将标识抗体溶液应用于SephadexG-25层析柱，流速0.2mL/min，馏分体积5mL/tube，紫外280nm监测，收集第一峰，体积为15mL；抗体浓度为0.51mg/mL。分装后-80℃保存备用。
1.4 荧光抗体的鉴定
1.4.1 标识抗体的荧光特性及纯度测定 采用SDS-PAGE电泳及凝胶分析仪、凝胶荧光分析仪鉴定标识抗体的荧光特性[8]。SDS-PAGE非还原性凝胶电泳（样品缓冲液中不添加β-巯基乙醇），分离胶10%，浓缩胶3%，恒压200V电泳2h。剥离胶板，蒸馏水浸洗2min，RGB多色荧光分析仪检测。荧光检测结束后，胶板用R-250考马斯亮蓝（0.25%）染色后，凝胶成像仪观察。
1.4.2 标识的荧光抗体特异性测定 采用凝胶免疫双向电泳检测法[9]。0.9%盐水琼脂糖制备琼脂板；待琼脂凝固后，打孔器打孔，孔径3mm，孔距10mm；加样，1孔加纯化后荧光抗体溶液（0.3mg/mL）、2孔加入未标识抗体溶液（0.3mg/mL）、3孔加入生理盐水对照、中心孔加入Ⅳ型胶原（0.5mg/mL）；每孔加样品20μL；琼脂板玻片置37℃温箱中12h。
2 结果
2.1 荧光抗体荧光特性和纯度
5500multi+RGB全自动化学发光荧光图像分析仪检测电泳结果，激发波490nm，发射波510nm，标识抗体在150KD有一条黄绿色荧光带，其他的位置未见条带出现；凝胶经染色后，凝胶成像仪检测可见标识、未标识抗体在150KD处均有一条带，其他处有染色较浅的散在条带（图1）。凝胶分析仪分析标识抗体纯度为96%。
3 讨论
免疫荧光技术是利用荧光素对抗体（抗原）进行标记，之后用于免疫检测。近年来，免疫荧光技术迅速发展，以其灵敏度高，准确性强等特点，广泛应用于生物医学和临床诊断[10]。抗体的荧光标识效果决定了荧光检测结果的准确性，决定标识效果的因素除了荧光素偶联的程度，更重要的是标识抗体的纯度[11]。本研究采用透析标识法连接荧光素和抗体。采用Sephadex G25柱层析去除未标记的荧光素和杂质，经反复试验确定其层析流速为0.2mL/min。SDS-PAGE电泳结果显示标记抗体纯度达到96%。经RGB多色荧光分析仪分析结果，标识后的抗体，在激发荧光490nm，发射波510nm处可见黄绿色荧光，符合FITC荧光素的荧光特性[12]。采用免疫双向凝胶电泳方法检测标识荧光抗体的特异性，结果显示1孔和2孔与中心孔之间均有沉淀线形成，且线的粗细程度基本相同。经荧光分析仪检测，可见1孔与中心孔之间有黄绿色线状荧光。
综上所述，本方法在常规透析标识后经Sephadex G25凝胶过滤层析后，可有效去除未连接的荧光素和其他杂质，进而保证了标识后抗体的纯度。标识后抗体的特异性从双向扩散免疫电泳结果分析，基本没有损失。实验结果证明经本方法可获得纯度高，特异性强的Ⅳ型胶原荧光抗体。为临床采用直接和间接荧光法检测人体Ⅳ型胶原，提供了方便条件，为临床早期诊断肝纤维化奠定了基础。
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[6] 郝淑美，岳秒姝，苏建青，等.犬瘟热病毒荧光抗体的制备及其鉴定[J].中国兽医学报，2008，28（9）：1008-1010.
[7] 苏建青，褚秀玲，杨松涛，等.抗犬瘟热病毒荧光标记单抗的制备和初步鉴定[J].安徽农业科学，2009，37（8）：3552-3554.
[8] 赵守山，颜世敢，朱丽萍，等.R-phycoerythrin标记抗猪病毒荧光抗体的制备及其FITC荧光抗体检测的比较研究[J].西南农业学报，2011，24（2）：1962-1966.
[9] 吴鹏，王英娇，高诗博，等.Ⅳ型胶原多克隆抗体的制备及性质研究[J].中国医药科学，2014，4（10）：27-29.
[10] 丁如.临床检验中免疫荧光技术的应用[J].实用医技杂志，2013，20（12）：1325-1326.
[11] 颜世敢，朱丽萍，张玉忠，等.藻红蛋白标记抗鸡IgG荧光抗体的高效制备[J].中国预防兽医学报，2009，31（2）：127-131.
[12] 朱正美，刘辉.简明免疫技术[M].北京：科学出版社，2002：152-153.
（收稿日期：2014-10-21）