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【摘要】目的 建立简便的酶比色法测定血中同型半胱氨酸的方法，并与传统的酶循环法相比较，评价同型半胱氨酸酶比色法临床检测的可行性。方法 通过精密度试验、线性、干扰实验，考察方法的可靠性，最后采用加样回收的方法比较两种方法的准确性，并对临床30份血液样品进行了酶比色法检测。结果 酶比色法具有很高的精密度，较宽的线性范围，抗干扰能力较强，更高的回收率。结论 同型半胱氨酸酶比色法原理检测试剂与目前常用的酶循环法检测试剂相比，酶比色法具有更高的准确性，可用于临床同型半胱氨酸的检测。
【关键词】酶比色法； 酶循环法；同型半胱氨酸；临床检测
同型半胱氨酸（Homocysteine， Hcy），即2-氨酸-4巯基丁酸，是一种体内蛋氨酸代谢过程中产生的中间产物。众多的临床研究与细胞实验已经证实高同型半胱氨酸血症与冠状动脉疾病、脑血管疾病、外周血管疾病等多种血管相关性疾病息息相关。研究也发现同型半胱氨酸与糖尿病肾病等疾病相关。血浆中Hcy测定已成为国外诊断维生素B12及叶酸缺乏、早期心脑血管疾病监控疗效的常规方法。检测同型半胱氨酸常用方法包括放射酶分析法、酶联免疫法、气相色谱-质谱（GC-MS）联用法、HPLC法、酶比色法、循环酶法、荧光偏振免疫分析法、高效毛细管电泳法及颗粒增强免疫比浊法。但放射酶分析法存在放射性，操作繁琐；气相色谱-质谱联用法和HPLC法操作繁琐，耗时长，仪器价格昂贵；荧光偏振免疫法需要特殊仪器；高效毛细管电泳法，灵敏度相对偏低；酶比色法和循环酶法是临床最常用的同型半胱氨酸，操作方便，耗时较短，不需要衍生等复杂操作。本研究通过对比酶比色法与循环酶法两种同型半胱氨酸检测方法的结果的比较，评价两种检测方法的临床适用性，研究时间2013年6月～9月，报告如下。
1 仪器与试剂
1.1 仪器
MS205型分析天平（瑞士，梅特勒-托利多），日立7180全自动生化分析仪（日本，株式会社日立制作所）。
1.2 试剂
同型半胱氨酸检测试剂盒（酶比色法，重庆中元生物技术有限公司生产）；同型半胱氨酸检测试剂盒检测试剂（循环酶法，四川省迈克科技有限公司）；Hcy（美国，Sigma公司）；乳糜（西安立邦制药有限公司）；血红蛋白（牛血红蛋白，北京经科宏达生物公司）；胆红素（北京经科宏达生物公司）；抗坏血酸等其他试剂均为国产分析纯。试剂均于4℃下低温保存。
1.3 血清样本
选择30份2013年6 月～9月于我院就诊的患者，空腹采血后，加入肝素抗凝后，离心分离血浆，-20℃冷冻保存，并用同型半胱氨酸检测试剂盒（酶比色法和酶循环法）在日立7180全自动生化分析仪进行测定。
2 方法
2.1 操作方法
酶比色法试剂盒和酶循环法试剂盒测定参数设置和操作严格按照试剂盒厂家说明书规定进行。
2.2 评价方法
按产品执行标准及《临床化学体外诊断试剂盒质量检验总则》对试剂的精密度、线性范围、抗干扰性进行评价，最后采用加样回收的方法比较两种方法的准确性，并对临床30份血液样品进行了酶比色法检测。
2.3 精密度实验
取高、中、低浓度的Hcy质控液各1份，用酶比色法连续测定20次，分别测定质控液的日内和日间重复性。
2.4 线性和范围
选择50.00μmol/L的Hcy质控液，用缓冲溶液逐倍稀释成6个不同浓度的标本，用酶比色法重复测定3次，将测定值（Y）与理论值（X）进行线性回归分析。
2.5 干扰实验
以12.0μmol/L的Hcy质控液为基础，加入不同浓度的乳糜、血红蛋白、胆红素和抗坏血酸进行干扰实验，用酶比色法测定后计算结果偏差。
2.6 回收率
取已知含量的血浆9份，分别加入含量为12.0、24.0、36.0μmol/L的Hcy质控液，每个浓度各三份。用酶比色法和酶循环法分别测定后，计算回收率。
2.7 临床样品测定 采用酶比色法对临床30份样品进行Hcy浓度测定，每个样品重复测定3次。
3 结果
3.1 精密度实验通过 高、中、低浓度精密度结果比较，结果表明，本方法的日间精密度的RSD值为2.1%～2.7%，日内精密度为1.7～2.5%，RSD值均小于5%，表明方法精密度良好。
3.2线性和范围通过理论值与实测值的回归方程，结果表明，理论值和实测值之间的回归方程为y=0.9857x+0.4528，相关系数（r）为0.9974，表明线性范围为1.56～50μmol/L。
3.3 干扰实验经过酶比色法测定血浆Hcy的抗干扰实验结果，由干扰实验可知，乳糜、血红蛋白、胆红素和抗坏血酸均会对实验测定结果产生影响，但总体影响不大，均能达到《临床化学体外诊断试剂盒质量检验总则》的要求。
3.4 回收率
酶比色法的平均回收率为99.3%，酶循环法平均回收率为93.2%，且酶循环法每一份样品的回收率都偏小。当样品含量较小的时候，如2μmol/L 时，测定结果可能偏小，甚至低于检测线性范围。所以酶比色法具有更高的准确性，更适合临床样品的检测，特别是健康人群的同型半胱氨酸的测定。
3.5 临床样品检验结果 采用建立的酶比色法对临床样品进行含量测定，测得的结果。
4 结论
由于同型半胱氨酸具有重要的临床意义，对多种疾病的具有重要的指示作用，随着其检测技术的发展，对其研究也逐渐深入。本研究通过精密度试验、线性、干扰实验，考察酶比色法的可靠性，最后采用加样回收的方法比较酶比色法和酶循环法的准确性，最后对临床30份血液样品进行了酶比色法检测，结果表明同型半胱氨酸酶比色法原理检测试剂与目前常用的酶循环法检测试剂，酶比色法具有更高的准确性，可用于临床同型半胱氨酸的检测。
参考文献：
[1] 王鸿利.同型半胱氨酸的检测及其应用[J]. 诊断学理论与实践， 2002，1（4）： 257-261.
[2] 陈琦玲，王及华等. 同型半胱氨酸对高血压脑卒中患者血脂和颈动脉斑块的影响[J].中国动脉硬化杂志，2002，10（4）
【关键词】酶比色法； 酶循环法；同型半胱氨酸；临床检测
同型半胱氨酸（Homocysteine， Hcy），即2-氨酸-4巯基丁酸，是一种体内蛋氨酸代谢过程中产生的中间产物。众多的临床研究与细胞实验已经证实高同型半胱氨酸血症与冠状动脉疾病、脑血管疾病、外周血管疾病等多种血管相关性疾病息息相关。研究也发现同型半胱氨酸与糖尿病肾病等疾病相关。血浆中Hcy测定已成为国外诊断维生素B12及叶酸缺乏、早期心脑血管疾病监控疗效的常规方法。检测同型半胱氨酸常用方法包括放射酶分析法、酶联免疫法、气相色谱-质谱（GC-MS）联用法、HPLC法、酶比色法、循环酶法、荧光偏振免疫分析法、高效毛细管电泳法及颗粒增强免疫比浊法。但放射酶分析法存在放射性，操作繁琐；气相色谱-质谱联用法和HPLC法操作繁琐，耗时长，仪器价格昂贵；荧光偏振免疫法需要特殊仪器；高效毛细管电泳法，灵敏度相对偏低；酶比色法和循环酶法是临床最常用的同型半胱氨酸，操作方便，耗时较短，不需要衍生等复杂操作。本研究通过对比酶比色法与循环酶法两种同型半胱氨酸检测方法的结果的比较，评价两种检测方法的临床适用性，研究时间2013年6月～9月，报告如下。
1 仪器与试剂
1.1 仪器
MS205型分析天平（瑞士，梅特勒-托利多），日立7180全自动生化分析仪（日本，株式会社日立制作所）。
1.2 试剂
同型半胱氨酸检测试剂盒（酶比色法，重庆中元生物技术有限公司生产）；同型半胱氨酸检测试剂盒检测试剂（循环酶法，四川省迈克科技有限公司）；Hcy（美国，Sigma公司）；乳糜（西安立邦制药有限公司）；血红蛋白（牛血红蛋白，北京经科宏达生物公司）；胆红素（北京经科宏达生物公司）；抗坏血酸等其他试剂均为国产分析纯。试剂均于4℃下低温保存。
1.3 血清样本
选择30份2013年6 月～9月于我院就诊的患者，空腹采血后，加入肝素抗凝后，离心分离血浆，-20℃冷冻保存，并用同型半胱氨酸检测试剂盒（酶比色法和酶循环法）在日立7180全自动生化分析仪进行测定。
2 方法
2.1 操作方法
酶比色法试剂盒和酶循环法试剂盒测定参数设置和操作严格按照试剂盒厂家说明书规定进行。
2.2 评价方法
按产品执行标准及《临床化学体外诊断试剂盒质量检验总则》对试剂的精密度、线性范围、抗干扰性进行评价，最后采用加样回收的方法比较两种方法的准确性，并对临床30份血液样品进行了酶比色法检测。
2.3 精密度实验
取高、中、低浓度的Hcy质控液各1份，用酶比色法连续测定20次，分别测定质控液的日内和日间重复性。
2.4 线性和范围
选择50.00μmol/L的Hcy质控液，用缓冲溶液逐倍稀释成6个不同浓度的标本，用酶比色法重复测定3次，将测定值（Y）与理论值（X）进行线性回归分析。
2.5 干扰实验
以12.0μmol/L的Hcy质控液为基础，加入不同浓度的乳糜、血红蛋白、胆红素和抗坏血酸进行干扰实验，用酶比色法测定后计算结果偏差。
2.6 回收率
取已知含量的血浆9份，分别加入含量为12.0、24.0、36.0μmol/L的Hcy质控液，每个浓度各三份。用酶比色法和酶循环法分别测定后，计算回收率。
2.7 临床样品测定 采用酶比色法对临床30份样品进行Hcy浓度测定，每个样品重复测定3次。
3 结果
3.1 精密度实验通过 高、中、低浓度精密度结果比较，结果表明，本方法的日间精密度的RSD值为2.1%～2.7%，日内精密度为1.7～2.5%，RSD值均小于5%，表明方法精密度良好。
3.2线性和范围通过理论值与实测值的回归方程，结果表明，理论值和实测值之间的回归方程为y=0.9857x+0.4528，相关系数（r）为0.9974，表明线性范围为1.56～50μmol/L。
3.3 干扰实验经过酶比色法测定血浆Hcy的抗干扰实验结果，由干扰实验可知，乳糜、血红蛋白、胆红素和抗坏血酸均会对实验测定结果产生影响，但总体影响不大，均能达到《临床化学体外诊断试剂盒质量检验总则》的要求。
3.4 回收率
酶比色法的平均回收率为99.3%，酶循环法平均回收率为93.2%，且酶循环法每一份样品的回收率都偏小。当样品含量较小的时候，如2μmol/L 时，测定结果可能偏小，甚至低于检测线性范围。所以酶比色法具有更高的准确性，更适合临床样品的检测，特别是健康人群的同型半胱氨酸的测定。
3.5 临床样品检验结果 采用建立的酶比色法对临床样品进行含量测定，测得的结果。
4 结论
由于同型半胱氨酸具有重要的临床意义，对多种疾病的具有重要的指示作用，随着其检测技术的发展，对其研究也逐渐深入。本研究通过精密度试验、线性、干扰实验，考察酶比色法的可靠性，最后采用加样回收的方法比较酶比色法和酶循环法的准确性，最后对临床30份血液样品进行了酶比色法检测，结果表明同型半胱氨酸酶比色法原理检测试剂与目前常用的酶循环法检测试剂，酶比色法具有更高的准确性，可用于临床同型半胱氨酸的检测。
参考文献：
[1] 王鸿利.同型半胱氨酸的检测及其应用[J]. 诊断学理论与实践， 2002，1（4）： 257-261.
[2] 陈琦玲，王及华等. 同型半胱氨酸对高血压脑卒中患者血脂和颈动脉斑块的影响[J].中国动脉硬化杂志，2002，10（4）