【摘 要】
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目的探讨人表皮生长因子受体2(ERBB2)的p.Pro780_Tyr781insGSP插入突变对诱导Lapatinib耐药的机制研究。方法采用聚合酶链反应(PCR)、酶切、连接等方法构建对照组pHelper.CopGFP、野生组pHelper.GV358-ERBB2、突变组pHelper.GV492-ERBB2质粒转染293T细胞，收集上清并包装慢病毒，检测滴度为108，在融合率为70%～80%的
【机 构】
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浙江中医药大学第二临床医学院，杭州 310022,中国科学院大学附属肿瘤医院乳腺科，杭州 310022
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目的探讨人表皮生长因子受体2(ERBB2)的p.Pro780_Tyr781insGSP插入突变对诱导Lapatinib耐药的机制研究。
方法采用聚合酶链反应(PCR)、酶切、连接等方法构建对照组pHelper.CopGFP、野生组pHelper.GV358-ERBB2、突变组pHelper.GV492-ERBB2质粒转染293T细胞，收集上清并包装慢病毒，检测滴度为108，在融合率为70%～80%的MCF-7细胞中进行转染，并在1 mg/L的嘌呤霉素中进行药筛构建稳转株，通过免疫荧光及蛋白印迹法(Western blot)检测转染效率，实验分3组：ERBB2-NC、ERBB2-WT和ERBB2-MT组。通过细胞增殖细胞计数试剂盒(CCK-8)法检测拉帕替尼作用48 h后MCF-7细胞的半数最大抑制浓度(IC50)，Western blot检测在拉帕替尼作用下，ERBB2相关信号通路蛋白的表达变化，并测定拉帕替尼对细胞周期变化和细胞凋亡反应的影响。两组间样本均数比较采用t检验，多组间样本采用方差分析。
结果成功构建载体并且测序正确，野生型ERBB2(ERBB2-WT)及突变型ERBB2(ERBB2-MT)稳转株构建成功。细胞增殖抑制实验结果显示ERBB2-MT组的细胞对拉帕替尼的IC50值为(90.41±7.47) μmol/L，明显高于ERBB2-WT组IC50(43.94±9.84) μmol/L，ERBB2-MT组与其他两组比较，对拉帕替尼产生显著抗性(F＝55.530，P<0.01)，通过增加/蛋白激酶B(Akt)的磷酸化水平促进细胞的生长，引起了ERBB2-MT组[(326.00±36.16)个]细胞克隆较ERBB2-WT组[(201.00±10.03)个]增多(t＝7.478，P<0.05)，并通过抑制晚期细胞的凋亡(WT：22.29±1.53，MT：10.89±2.42，t＝6.905，P<0.01)和增强细胞增殖能力(WT：18.95±0.73，MT：33.05±2.69，t＝8.774，P<0.01)对拉帕替尼产生耐药性。
结论结果表明ERBB2-MT的插入突变为促癌性突变，通过激活Akt信号通路磷酸化而对拉帕替尼的治疗产生抗性。
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