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摘 要：为明确国内木薯花叶病毒病（cassava mosaic virus disease）的危害情况、田间症状及其病原类型，本研究于2018—2019年调查了该病在国内的分布情况、症状特征及种质来源等数据，采集了8省（区）19地的384份样品，利用特异性引物检测2种木薯花叶病毒侵染引起的症状类型，并通过序列比对明确其病原特点。结果表明：木薯花叶病毒病已经在我国发生，种茎调运是该病远距离传播的主要原因;国内木薯花叶病毒病病原有斯里兰卡木薯花叶病毒株系（Sri Lankan cassava mosaic virus， SLCMV）和木薯普通花叶病毒（Cassava common mosaic virus， CsCMV）2种病毒，可分为单独感染、复合感染，其中SLCMV的检出率为21.1%，CsCMV的检出率为36.5%，SLCMV-CsCMV复合侵染率为15.1%;检测到的SLVMV与东南亚SLCMV序列同源性为99.4%～99.7%，检测到的CsCMV与拉丁美洲的CsCMV序列相似性为91%～96%。推测国内木薯花叶病毒病主要由2种病毒侵染引起，且普通花叶病毒有产生序列变异的可能性。
关键词：木薯;斯里兰卡木薯花叶病毒（SLCMV）;木薯普通花叶病毒（CsCMV）;检测;复合侵染
中图分类号：S435.33 文献标识码：A
Distribution and Pathogen Detection of Cassava Mosaic Virus Disease in China
WANG Guofen1， LI Chaoping1， SHI Tao1， ZHOU Sishan2， LI Boxun1， CAI Jimiao1， LIN Zhaowei1，
HUANG Guixiu1
1. Environment and Plant Protection Institute， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences / Laboratory of Integrated Pest Management on Tropical Grops， Ministry of Agriculture and Rural Affairs， China / Hainan Key Laboratory for Monitoring and Control of Tropical Agricultural Pests， Haikou， Hainan 571101， China; 2. College of Plant Protection， Hainan University， Haikou， Hainan 570228， China
Abstract： To clarify the disease situation， symptom types and pathogens of cassava mosaic virus disease in China， 19 locations in 8 provinces were investigated in 2018-2019， and 384 narcissus samples were collected. Data analysis results showed that cassava mosaic virus disease had already occurred in China Stem transportation was the main reason for the long-distance transmission of the disease. Specific primers of Sri Lankan cassava mosaic virus （SLCMV） and Cassava common mosaic virus （CsCMV） were used to detect the 384 samples. The results showed that SLCMV and CsCMV were detected in 21.1% and 36.5% samples， respectively. 15.1% samples were mix-infected by the two viruses. The sequence similarity between the detected SLVMV and Southeast Asian SLCMV was 99.4%-99.7%， and the sequence similarity between CsCMV and Latin America was 91%-96%. It indicates that domestic cassava mosaic disease is mainly caused by these two viruses， and the Common mosaic virus may have some sequence mutation.
Keywords： Manihot esculenta; Sri Lankan cassava mosaic virus （SLCMV）; Cassava common mosaic virus （CsCMV）; detection; mixed infection
DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2021.06.023
木薯（Manihot esculenta）為大戟科多年生作物，主要种植在热带亚热带国家和地区，是世界上第六大粮食作物，在我国华南及中部多个省（区）都有种植，相关产业在农业经济中占有重要地位。木薯花叶病毒病对木薯产业具有毁灭性危害，全球范围内每年因花叶病影响可造成2500万t木薯产量损失，影响到5亿多人口的粮食安全[1]。20世纪90年代，木薯花叶病毒病在乌干达大爆发，许多地区的种植户被迫放弃种植木薯[2]。Thresh等[3]估算非洲地区花叶病发生后，田间病株平均产量约损失30%～40%，产量损失最高达86%。2015年，由斯里兰卡木薯花叶病毒株系引起的花叶病在柬埔寨东部和越南南部交界地区发生并迅速向周边地区蔓延[4]，2018年6月，相继在柬埔寨、越南和泰国的多个省都发现了该病的危害[5]。3 a内，病害从柬埔寨东部桔井省和上丁省的单个种植园，发展到了覆盖该地区及其周边10%的种植地。受病害影响，柬埔寨2017年鲜薯价格比2016年涨了2～3倍，但单产从2016年的18 t/hm2，减至2017年的15 t/hm2[6]。我国已将非洲木薯花叶病毒列入进境植物检疫性有害生物名录[7]，2018年8月，木薯花叶病毒病在我国海南、福建发现并报道[8-9]。该病传播速度快，对木薯产业危害严重，病害在国内的发生，立即引起了国内木薯主产区薯农及科研人员的高度重视。 世界范围内，木薯的重要病毒病主要有3个类群：第一种为双生病毒引起的木薯双生病毒花叶病（cassava mosaic disease， CMD），病原为联体病毒科（Geminivieidae），菜豆金黄色花叶病毒（Begomovirus）;第二种为甘薯病毒引起的木薯褐条病（cassava brown streak disease， CBSD），病原为马铃薯Y病毒科（Potyviridae），甘薯病毒（Ipomovirus）;第三种为马铃薯X病毒引起的木薯普通花叶病（cassava common mosaic disease， CsCMD），病原为马铃薯X病毒组（Potexvirus），马铃薯X病毒（Potato virus X）。在东南亚及国内发现的重大危险性入侵木薯花叶病毒病，主要为第一种类型，由双生病毒引起的木薯花叶病毒病，强致病株系为斯里兰卡木薯花叶病毒株系（Sri Lankan cassava mosaic virus， SLCMV）;木薯褐条病目前仅在非洲中东部地区危害[10];多年来，木薯普通花叶病毒病（CsCMD）仅在拉丁美洲发现，我国台湾于1981年有过报道[11]。
为进一步明确引起国内木薯花叶病毒病的病毒种类及其危害情况，2018—2019年，本团队研究人员集中对国内木薯主栽区的木薯花叶病毒病疫情进行调查，并对病毒株系进行鉴定，为明确国内花叶病种类，提高木薯病毒病的监测预警，避免罹病种茎的调运，保证木薯的健康生產提供必要的检测技术。
1 材料与方法
1.1 田间调查和样品采集
参考《外来入侵物种普查及其安全性考察技术方案》中的病害田间调查方法，于2018年8月至2019年8月，分别对我国海南、广东、广西、福建、江西、湖南、贵州和云南8省（区）的19个木薯品种或种质保存基地进行调查，同时对广西2地农户自行种植地进行考察。实地监测木薯叶片是否黄化、花叶、皱缩、褪绿，大小是否有变化，植株是否矮化等;对各地木薯花叶病突发原因进行调查，走访种茎来源，调查病害发生时间和对可能传入的途径进行分析。
采集样品384份，分批整理后保存于–80 ℃冰箱中备用，阳性对照为带有目标病毒核酸序列的质粒，健康对照为防虫温室培育的健康木薯叶片。
1.2 改良CTAB一步法制备核酸
所有的试剂、枪头及EP管均需RNAase处理。取50～100 mg幼嫩叶片，在液氮中研磨成粉末，加入65 ℃预热的CTAB-巯基乙醇缓冲液600 μL（2% CTAB，20 mmol/L EDTA，100 mmol/L Tris- HCl 8.0，1.4 mol/L NaCl，1% PVP40，使用前加入20%β-巯基乙醇），充分震荡混匀;65 ℃水浴锅中恒温水浴30～60 min;12 000 r/min离心5 min，上清液经2次600 μL氯仿萃取后，加入等体积预冷异丙醇，于4 ℃冰箱沉淀核酸30 min;离心，用1 mL预冷70%乙醇清洗2次，干燥后的核酸用无RNAase的ddH2O充分溶解，进行电泳及浓度检测后分装，一部分直接用于PCR，另一部分进行反转录，用获得的cDNA进行PCR扩增。DNA及cDNA于–20 ℃冰箱中保存备用。
1.3 引物设计与合成
烟粉虱传双生病毒简并引物PA/PB[12]，扩增双生病毒共同区及外壳蛋白保守区域，目的片段约500 bp，用于粉虱传双生病毒引起的木薯花叶病病原检测。参考文献[8]合成斯里兰卡木薯花叶病毒DNA-A特异引物AF/AR，并通过合成背靠背引物扩增DNA-A全长序列，合成斯里兰卡木薯花叶病毒DNA-B特异引物BF/BR，扩增双生病毒DNA-B组份;参考文献[13]合成普通木薯普通花叶病毒特异引物CsCMV-3269-F/CsCMV- 3896-R，各引物序列见表1。所有引物均委托深圳华大基因科技有限公司合成。
1.4 病毒检测
1.4.1 SLCMV检测 先通过双生病毒的通用简并引物PA/PB对检测样品DNA进行PCR扩增，然后用SLCMV DNA-A特异性引物AF/AR和SLCMV DNA-B链特异引物BF/BR进行验证。
1.4.2 CsCMV检测 按照cDNA试剂盒说明书合成cDNA第一链，于-20 ℃保存，用RNA病毒特异性引物CsCMV-3269-F/CsCMV-3896-R进行PCR检测。PCR扩增条件及PCR体系均参考文献[8， 12-13]的方法进行。
1.5 序列分析
以上PCR产物用1.0%琼脂糖（1.0×TAE）电泳检测，BioRad凝胶成像仪观察，记录结果。选择代表性样品进行测序，根据序列比对的结果进行分析。序列的编辑和分析借助DNAMAN 8、DNAStarLasergene 7.1和MEGA 7.0等3个软件完成。
2 结果与分析
2.1 国内木薯花叶病的分布情况
目前国内已审定的木薯品种共36个，各地保存的木薯材料多为各属地保存、引进或者通过多种途径创制的种质材料，尚未进行审定，以统一的字母或者编号区分种质来源，一般情况下各地种植的种质数量远大于品种数量。本研究调查统计了各种植区（地）出现花叶症状的木薯品种（种质）（表2），从数量上看，2018年和2019年的品种（种质）发病率分别为5.2%和9.4%，广西贵港、北海和海南白沙2018年尚未发现感病植株，2019年由于种植了从发病区调运的种茎，导致病害发生;品种（种质）上看，主栽品种出现了花叶症状植株，2018年调查的7省13地，感病的主栽品种有‘华南9号’和‘南植199’，其他新种质如P系列、‘27-4’和‘39-2’等;2019年调查的8省19地，显症植株包括2018年的所有已知品种和新引进食用品种TCGRI系列。调查中，农户的种植地（表中编号20和编号21）均无木薯花叶病毒病显症植株，木薯花叶病毒病还仅发生于调查所涉及到的品种（种质）保存基地。 2.2 国内木薯花叶病的症状类型
田间调查发现，出现花叶病症状的木薯植株，可分为3种症状类型：第一种表现为叶片皱缩畸形，植株矮化，感病植株首先在叶片上出现褪绿的小斑点，随后逐渐扩大并与正常绿色形成典型花叶状，受侵染叶片背面有时可见突起，叶片普遍变小，叶片中部和基部常收缩成蕨叶状（图1A）;第二种表现为叶片花叶变形，植株矮化，感病植株首先在嫩叶上出现典型花叶，逐渐在老叶及整株叶片上形成花叶症状（图1B）;第三种表现为植株嫩叶褪绿、花叶症状，叶片以褪绿的小斑点向外蔓延，边界不清晰，大部分仅在上层叶片表现症状，不影响植株生长（图1C）。
在气温较低的冷凉地区，第一、第二种症状的植株呈现典型花叶或畸形症状后，长势严重削弱，叶片皱缩且不能正常展开，植株常矮化，不能正常结薯，严重时整株枯萎死亡。海南、广西等地区，春季和秋末季节气温较低，植株的“花叶”症状明显，夏天封行以后，叶片上的花叶症状减弱，可能是由于高温天气不利于症状的形成，生长中后期由于气温下降，受侵染植株症状会再度呈现。
2.3 木薯花叶病毒的检测及其感染情况
将3种花叶症状类型的木薯叶片分别进行总核酸提取，用SLCMV和CsCMV特异引物进行PCR及RT-PCR扩增，以含有病毒序列的载体作为阳性对照。结果表明，与Wang等[8]的结果一致，双生病毒的通用引物PA/PB对木薯花叶病毒无有效的扩增条带。第一种症状类型样品仅能扩增到SLCMV的特异条带，引物AF/AR-PCR产物大小0.7 kb（图2A），无CsCMV的扩增片段，表明该症状类型由斯里兰卡木薯花叶病毒株系单独感染引起;第二种症状类型，表现出叶片花叶和植株矮化的样品不仅能扩增到SLCMV的特异性条带，也能扩增到CsCMV的特异片段，表明该种症状类型由斯里兰卡木薯花叶病毒和木薯普通花叶病毒2个株系复合感染引起;第三种症状类型（图2B），仅出现叶片花叶褪绿症状的植株样品，无SLCMV扩增产物，只能扩增到CsCMV的特异性片段，引物CsCMV-3269-F/CsCMV-3896-R产物大小0.6 kb，表明该类型由木薯普通花叶病毒株系侵染形成。与斯里兰卡木薯花叶病毒侵染形成的典型花叶症状相比，普通木薯花叶病毒株系病叶上“正常绿色”部分和“变色或黄化”部位之间界限不清晰，叶片无皱缩变形。
在2018年和2019年的384份测试样品中，斯里兰卡木薯花叶病毒株系（SLCMV）单独侵染的检出率为21.1%，分别来自海南、广东、云南、广西、贵州和福建6个省（区）的样品;木薯普通花叶病毒（CsCMV）单独侵染的检出率为78.8%，包括所有8个省（区）的样品;SLCMV-CsCMV复合侵染率为33.0%，主要来自海南、广西、广东和贵州4个省（区）的样品。由表3所示，CsCMV的检测仅随机选取了其中的179个样品，其感染率为78.8%，其中2019年每个采样点均只随机选取了3个样品进行检测，只有1个为阴性，其余样品均为阳性，据此推测若是将所有的样品进行检测，CsCMV的感染应该是普遍存在的。
2.4 木薯花叶病毒的鉴定
选取2019年海南儋州（DG1922）和贵州望谟（GZ1924）2个斯里兰卡木薯病毒阳性检测样品，经测序获得DNA-A和DNA-B全基因组序列，在Genbank的登录号为MN688214-MN688217。经BLAST比对表明，DG1922和GZ1924的DNA-A序列与已经报道的斯里兰卡木薯病毒株系柬埔寨分离物SLCMV-Cambodia（KT861468）[4]、越南分离物SLCMV-VTN6（LC312131）[14]、泰国分离物SLCMV-Surin1（MN544647）和中国分离物SLCMV-HN7（MH891840）[8]的序列同源性都在99%以上。为进一步明确国内木薯花叶病毒的归类，从Genbank下载11个木薯花叶病毒株系共37个不同分离物的DNA-A序列，与DG1922和GZ1924的DNA-A序列进行聚类分析，以番茄斑驳病毒序列（L14460）为树根，应用MEGA 7.0-ClastalW聚类，构建NJ（Neighbor-Joining）树。结果如图3所示，37个分离物均可严格地聚到各自所属的不同株系分枝中，DG1922和GZ1924序列均与斯里兰卡木薯花叶病毒株系聚在同一分枝，进一步表明，引起国内木薯花叶病毒病的双生病毒主要为斯里兰卡木薯花叶病毒株系。
同样，选择3个地点共5个木薯普通花叶病毒阳性检测样品分离物海南儋州（NX23，NX28）、广东开平（GD）和江西东乡（JX1，JX3）目的条带进行测序，经BLAST比对显示，目标序列与已经报道的拉丁美洲多个木薯普通花叶病毒分离物CsCMV-Arg104（KT002434）、CsCMV-Bra456（KT002429）和CsCMV-Arg128（KT002427）的依赖于RNA的RNA多聚酶基因（RdRp）序列同源性在91%～96%之间。引起木薯普通花叶病毒病的马铃薯X病毒组（Potexvirus）有5个株系，主要分布在阿根廷、巴西和哥伦比亚[15]，分别下载这些株系的24个拉丁美洲木薯普通花叶病毒分离物RdRp基因序列，以非洲花叶病毒株系为树根，聚类分析表明，国内木薯普通花叶病毒株系与已经报道的多个株系序列相似性较远，自为一个分枝，而且各个序列之间也有差异（图4）。表明国内的普通花叶病毒株系产生了较大的变异，形成独立分枝，有进化出新株系的可能性。
3 讨论
自从2016年在国内首次发现木薯花叶病毒病（本研究室内部资料）和2018年正式报道以来[4， 9]，陆续在国内多个木薯种植地发现该病害。本研究通过对国内多地木薯花叶病毒病的田间调查、症状分析和病原鉴定，表明国内已发生木薯花叶病毒病，但范围还仅限于品种（种质）保存基地，尚未传播到生产一线。由双生病毒引起的木薯花叶病的传毒媒介为烟粉虱，主要引起木薯花叶病毒病短距离的传播危害，远距离传播主要通过罹病种茎和带毒薯类产品的调运和农产品交易等[1]，本研究团队于2016年首次发现木薯花叶病毒病为害的品种‘东莞紅尾’，是种植了从引种隔离圃中调运出来的种茎;2017年在海南文昌发现的2个出现症状的品种‘SC10’和‘SC205’，是由于前期种植了从东南亚引进的感病种质，导致部分植株被感染;而在本研究中的调查发现，2018年和2019年各地出现症状的种质，几乎都来源于调运的种茎，而当地的主栽品种，由于缺乏抗性，部分品种也出现了感病情况。这些数据表明，种植引进和调运的罹病种茎是2018年、2019年各省（区）出现病害的主要原因。2015年时涛等[16]通过有害生物风险性分析（PRA）程序评估木薯花叶病毒病在国内的综合风险值R为2.42，属于高度危险的病害，而且国内的大部分主栽品种均不具备对该病的抗性[17-19]。综上所述，加强病害监测，禁止从疫区调运种茎，是预防病害传播、保障木薯产业健康发展的重要举措。 本研究通过对国内多地木薯花叶病症状和病原的鉴定调查，发现目前引起国内木薯产生花叶症状的有3种情况，即由SLCMV单独感染引起的木薯斯里兰卡花叶病毒病、SLCMV和CsCMV共同侵染引起的复合感染以及由CsCMV单独侵染引起的木薯普通花葉病毒病。从采集样品检测的结果来看，海南、广东、云南、广西、贵州和福建6个省（区）都有斯里兰卡木薯花叶病毒和普通花叶病毒的感染，而江西和湖南则以木薯普通花叶病毒感染为主。
研究人员根据双生病毒结构和序列的差异及其主要发生的地区，将木薯花叶病毒（CMV）分为11个株系和1个重组株系：即非洲木薯花叶病毒株系（African cassava mosaic virus， ACMV），木薯花叶病毒马达加斯加株系（cassava mosaic Madagascar virus， CMMGV），东非木薯花叶病毒株系（East African cassava mosaic virus， EACMV），东非木薯花叶病毒乌干达变种（East African cassava mosaic-Ugandan variant， EACMV-
UG），东非木薯花叶病毒喀麦隆株系（East African cassava mosaic Cameroon virus， EACMCV），东非木薯花叶病毒肯尼亚株系（East African cassava mosaic Kenya virus， EACMKV），东非木薯花叶病毒马拉维株系（East African cassava mosaic Malawi virus， EACMMV），东非木薯花叶病毒桑给巴尔株系（East African cassava mosaic Zanzibar virus， EACMZV），南非木薯花叶病毒株系（South African cassava mosaic virus， SACMV），非洲木薯花叶布基纳法索病毒（African cassava mosaic Burkina Faso virus， ACMBFV），印度木薯花叶病毒株系（Indian cassava mosaic virus， ICMV）和斯里兰卡木薯花叶病毒株系（Sri Lankan cassava mosaic virus， SLCMV）[20]。引起木薯普通花叶病的马铃薯X病毒组（Potexvirus）的5个株系则主要危害南美洲地区阿根廷、巴西和哥伦比亚的木薯。由于病毒结构简单，而且需要适应环境和品种的更替，常与寄主和其他病毒产生重组，从而变异成不同的株系。非洲强致病力的重组株系时有报道，目前在乌干达和加纳地区的强致病力病毒株系EACMV-UG，为东非木薯花叶病毒株系和非洲花叶病毒株系的重组体[21]。木薯普通花叶病毒病主要发生在拉丁美洲地区，尚未在非洲和东南亚发现，尽管多数文献报道南美洲的木薯普通花叶病毒对木薯的产量影响较小，但Venturini等[22]研究表明，巴西CsCMV的发生导致木薯品种‘BRS Kiriris’和‘BRS Jari’的产量损失达30%～60%。目前国内外均未见双生病毒和普通花叶病毒共同侵染木薯的报道，本研究检测到国内多地木薯同时携带2种病毒的情况属首次报道。
国内木薯花叶病毒病由斯里兰卡木薯花叶病毒株系引起，与2015年来影响柬埔寨、越南和泰国木薯产业的病毒株系有非常高的序列相似性，表明目前国内的木薯病毒与东南亚的株系有着很高的同源性，也可能直接或者间接来源于薯类农产品的边境或者国际贸易。木薯普通花叶病毒引起的花叶症状不典型，不具备扭曲畸形的特征，田间观察容易被忽视。聚类分析显示国内的CsCMV与南美洲多个株系序列相似性在96%以下，推测木薯普通花叶病毒株系已长期侵染国内多个木薯品种，存在序列重组变异的可能，须通过全基因组序列测定及变异率分析进行证明。国内的木薯产业及其育种在“一带一路”和国际合作的带动下，早期从哥伦比亚的国际热带农业研究中心（CIAT）引进了一些国外的优良种质[23]，也为病害的引入和传播提供了可能，但目前国内尚无因该病害而导致木薯产量和品质下降的报道，也是该病害没有得到足够重视的重要原因之一。
基于实际应用的需要，木薯病毒的检测技术在近年得到了快速发展。2019年Boykin等[24]通过结合PDQeX DNA纯化技术与MinION和MinIT移动测序设备，建立了便携式的林间试验室（Tree Lab）系统，用于对非洲木薯花叶病毒的现场早期诊断，突破了传统鉴定方法对大型设备的需求以及数据联网分析等程序，为技术人员在田间对病害的准确诊断提供了可能。Minato等[5]采用PCR技术对柬埔寨和越南的6480个木薯花叶病毒病疑似样品进行检测，结果表明样品感染率为7.6%，且发现14%的阳性样品无木薯花叶病毒病的典型症状。2015年Otti等[25]应用高通量多重实时PCR技术，可同时有效检测非洲的2种木薯重要病毒，即花叶病毒（ACMV）和褐条病毒（UCBSV），也分同属于DNA病毒和RNA病毒;Uke等[26]通过PCR和图像识别技术检测到引起印度木薯花叶的2种病毒印度木薯花叶病毒（ICMV）和斯里兰卡木薯花叶病毒（SLCMV），但无法对2种病毒进行有效区分。除了双生病毒引起的花叶病，国际上还有木薯褐条病、蛙皮病和多种潜在病毒性病害，由于国内首次发现该病的感染，其检测的方向多为双生病毒，除了存在普通花叶病毒的复合感染之外，是否还存在其他病毒的侵染，需要配合更多的检测技术进行深入分析。而作为分子生物学技术检测的基础，高效率的核酸抽提，以及微量病毒的有效提纯最为关键，很多假阴性的结果都与病毒核酸的抽提效率相关，同时作为最为便利的样品来源，以叶片作为靶标样品是否最有效也需要作进一步验证[27]。
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責任编辑：谢龙莲
关键词：木薯;斯里兰卡木薯花叶病毒（SLCMV）;木薯普通花叶病毒（CsCMV）;检测;复合侵染
中图分类号：S435.33 文献标识码：A
Distribution and Pathogen Detection of Cassava Mosaic Virus Disease in China
WANG Guofen1， LI Chaoping1， SHI Tao1， ZHOU Sishan2， LI Boxun1， CAI Jimiao1， LIN Zhaowei1，
HUANG Guixiu1
1. Environment and Plant Protection Institute， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences / Laboratory of Integrated Pest Management on Tropical Grops， Ministry of Agriculture and Rural Affairs， China / Hainan Key Laboratory for Monitoring and Control of Tropical Agricultural Pests， Haikou， Hainan 571101， China; 2. College of Plant Protection， Hainan University， Haikou， Hainan 570228， China
Abstract： To clarify the disease situation， symptom types and pathogens of cassava mosaic virus disease in China， 19 locations in 8 provinces were investigated in 2018-2019， and 384 narcissus samples were collected. Data analysis results showed that cassava mosaic virus disease had already occurred in China Stem transportation was the main reason for the long-distance transmission of the disease. Specific primers of Sri Lankan cassava mosaic virus （SLCMV） and Cassava common mosaic virus （CsCMV） were used to detect the 384 samples. The results showed that SLCMV and CsCMV were detected in 21.1% and 36.5% samples， respectively. 15.1% samples were mix-infected by the two viruses. The sequence similarity between the detected SLVMV and Southeast Asian SLCMV was 99.4%-99.7%， and the sequence similarity between CsCMV and Latin America was 91%-96%. It indicates that domestic cassava mosaic disease is mainly caused by these two viruses， and the Common mosaic virus may have some sequence mutation.
Keywords： Manihot esculenta; Sri Lankan cassava mosaic virus （SLCMV）; Cassava common mosaic virus （CsCMV）; detection; mixed infection
DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2021.06.023
木薯（Manihot esculenta）為大戟科多年生作物，主要种植在热带亚热带国家和地区，是世界上第六大粮食作物，在我国华南及中部多个省（区）都有种植，相关产业在农业经济中占有重要地位。木薯花叶病毒病对木薯产业具有毁灭性危害，全球范围内每年因花叶病影响可造成2500万t木薯产量损失，影响到5亿多人口的粮食安全[1]。20世纪90年代，木薯花叶病毒病在乌干达大爆发，许多地区的种植户被迫放弃种植木薯[2]。Thresh等[3]估算非洲地区花叶病发生后，田间病株平均产量约损失30%～40%，产量损失最高达86%。2015年，由斯里兰卡木薯花叶病毒株系引起的花叶病在柬埔寨东部和越南南部交界地区发生并迅速向周边地区蔓延[4]，2018年6月，相继在柬埔寨、越南和泰国的多个省都发现了该病的危害[5]。3 a内，病害从柬埔寨东部桔井省和上丁省的单个种植园，发展到了覆盖该地区及其周边10%的种植地。受病害影响，柬埔寨2017年鲜薯价格比2016年涨了2～3倍，但单产从2016年的18 t/hm2，减至2017年的15 t/hm2[6]。我国已将非洲木薯花叶病毒列入进境植物检疫性有害生物名录[7]，2018年8月，木薯花叶病毒病在我国海南、福建发现并报道[8-9]。该病传播速度快，对木薯产业危害严重，病害在国内的发生，立即引起了国内木薯主产区薯农及科研人员的高度重视。 世界范围内，木薯的重要病毒病主要有3个类群：第一种为双生病毒引起的木薯双生病毒花叶病（cassava mosaic disease， CMD），病原为联体病毒科（Geminivieidae），菜豆金黄色花叶病毒（Begomovirus）;第二种为甘薯病毒引起的木薯褐条病（cassava brown streak disease， CBSD），病原为马铃薯Y病毒科（Potyviridae），甘薯病毒（Ipomovirus）;第三种为马铃薯X病毒引起的木薯普通花叶病（cassava common mosaic disease， CsCMD），病原为马铃薯X病毒组（Potexvirus），马铃薯X病毒（Potato virus X）。在东南亚及国内发现的重大危险性入侵木薯花叶病毒病，主要为第一种类型，由双生病毒引起的木薯花叶病毒病，强致病株系为斯里兰卡木薯花叶病毒株系（Sri Lankan cassava mosaic virus， SLCMV）;木薯褐条病目前仅在非洲中东部地区危害[10];多年来，木薯普通花叶病毒病（CsCMD）仅在拉丁美洲发现，我国台湾于1981年有过报道[11]。
为进一步明确引起国内木薯花叶病毒病的病毒种类及其危害情况，2018—2019年，本团队研究人员集中对国内木薯主栽区的木薯花叶病毒病疫情进行调查，并对病毒株系进行鉴定，为明确国内花叶病种类，提高木薯病毒病的监测预警，避免罹病种茎的调运，保证木薯的健康生產提供必要的检测技术。
1 材料与方法
1.1 田间调查和样品采集
参考《外来入侵物种普查及其安全性考察技术方案》中的病害田间调查方法，于2018年8月至2019年8月，分别对我国海南、广东、广西、福建、江西、湖南、贵州和云南8省（区）的19个木薯品种或种质保存基地进行调查，同时对广西2地农户自行种植地进行考察。实地监测木薯叶片是否黄化、花叶、皱缩、褪绿，大小是否有变化，植株是否矮化等;对各地木薯花叶病突发原因进行调查，走访种茎来源，调查病害发生时间和对可能传入的途径进行分析。
采集样品384份，分批整理后保存于–80 ℃冰箱中备用，阳性对照为带有目标病毒核酸序列的质粒，健康对照为防虫温室培育的健康木薯叶片。
1.2 改良CTAB一步法制备核酸
所有的试剂、枪头及EP管均需RNAase处理。取50～100 mg幼嫩叶片，在液氮中研磨成粉末，加入65 ℃预热的CTAB-巯基乙醇缓冲液600 μL（2% CTAB，20 mmol/L EDTA，100 mmol/L Tris- HCl 8.0，1.4 mol/L NaCl，1% PVP40，使用前加入20%β-巯基乙醇），充分震荡混匀;65 ℃水浴锅中恒温水浴30～60 min;12 000 r/min离心5 min，上清液经2次600 μL氯仿萃取后，加入等体积预冷异丙醇，于4 ℃冰箱沉淀核酸30 min;离心，用1 mL预冷70%乙醇清洗2次，干燥后的核酸用无RNAase的ddH2O充分溶解，进行电泳及浓度检测后分装，一部分直接用于PCR，另一部分进行反转录，用获得的cDNA进行PCR扩增。DNA及cDNA于–20 ℃冰箱中保存备用。
1.3 引物设计与合成
烟粉虱传双生病毒简并引物PA/PB[12]，扩增双生病毒共同区及外壳蛋白保守区域，目的片段约500 bp，用于粉虱传双生病毒引起的木薯花叶病病原检测。参考文献[8]合成斯里兰卡木薯花叶病毒DNA-A特异引物AF/AR，并通过合成背靠背引物扩增DNA-A全长序列，合成斯里兰卡木薯花叶病毒DNA-B特异引物BF/BR，扩增双生病毒DNA-B组份;参考文献[13]合成普通木薯普通花叶病毒特异引物CsCMV-3269-F/CsCMV- 3896-R，各引物序列见表1。所有引物均委托深圳华大基因科技有限公司合成。
1.4 病毒检测
1.4.1 SLCMV检测 先通过双生病毒的通用简并引物PA/PB对检测样品DNA进行PCR扩增，然后用SLCMV DNA-A特异性引物AF/AR和SLCMV DNA-B链特异引物BF/BR进行验证。
1.4.2 CsCMV检测 按照cDNA试剂盒说明书合成cDNA第一链，于-20 ℃保存，用RNA病毒特异性引物CsCMV-3269-F/CsCMV-3896-R进行PCR检测。PCR扩增条件及PCR体系均参考文献[8， 12-13]的方法进行。
1.5 序列分析
以上PCR产物用1.0%琼脂糖（1.0×TAE）电泳检测，BioRad凝胶成像仪观察，记录结果。选择代表性样品进行测序，根据序列比对的结果进行分析。序列的编辑和分析借助DNAMAN 8、DNAStarLasergene 7.1和MEGA 7.0等3个软件完成。
2 结果与分析
2.1 国内木薯花叶病的分布情况
目前国内已审定的木薯品种共36个，各地保存的木薯材料多为各属地保存、引进或者通过多种途径创制的种质材料，尚未进行审定，以统一的字母或者编号区分种质来源，一般情况下各地种植的种质数量远大于品种数量。本研究调查统计了各种植区（地）出现花叶症状的木薯品种（种质）（表2），从数量上看，2018年和2019年的品种（种质）发病率分别为5.2%和9.4%，广西贵港、北海和海南白沙2018年尚未发现感病植株，2019年由于种植了从发病区调运的种茎，导致病害发生;品种（种质）上看，主栽品种出现了花叶症状植株，2018年调查的7省13地，感病的主栽品种有‘华南9号’和‘南植199’，其他新种质如P系列、‘27-4’和‘39-2’等;2019年调查的8省19地，显症植株包括2018年的所有已知品种和新引进食用品种TCGRI系列。调查中，农户的种植地（表中编号20和编号21）均无木薯花叶病毒病显症植株，木薯花叶病毒病还仅发生于调查所涉及到的品种（种质）保存基地。 2.2 国内木薯花叶病的症状类型
田间调查发现，出现花叶病症状的木薯植株，可分为3种症状类型：第一种表现为叶片皱缩畸形，植株矮化，感病植株首先在叶片上出现褪绿的小斑点，随后逐渐扩大并与正常绿色形成典型花叶状，受侵染叶片背面有时可见突起，叶片普遍变小，叶片中部和基部常收缩成蕨叶状（图1A）;第二种表现为叶片花叶变形，植株矮化，感病植株首先在嫩叶上出现典型花叶，逐渐在老叶及整株叶片上形成花叶症状（图1B）;第三种表现为植株嫩叶褪绿、花叶症状，叶片以褪绿的小斑点向外蔓延，边界不清晰，大部分仅在上层叶片表现症状，不影响植株生长（图1C）。
在气温较低的冷凉地区，第一、第二种症状的植株呈现典型花叶或畸形症状后，长势严重削弱，叶片皱缩且不能正常展开，植株常矮化，不能正常结薯，严重时整株枯萎死亡。海南、广西等地区，春季和秋末季节气温较低，植株的“花叶”症状明显，夏天封行以后，叶片上的花叶症状减弱，可能是由于高温天气不利于症状的形成，生长中后期由于气温下降，受侵染植株症状会再度呈现。
2.3 木薯花叶病毒的检测及其感染情况
将3种花叶症状类型的木薯叶片分别进行总核酸提取，用SLCMV和CsCMV特异引物进行PCR及RT-PCR扩增，以含有病毒序列的载体作为阳性对照。结果表明，与Wang等[8]的结果一致，双生病毒的通用引物PA/PB对木薯花叶病毒无有效的扩增条带。第一种症状类型样品仅能扩增到SLCMV的特异条带，引物AF/AR-PCR产物大小0.7 kb（图2A），无CsCMV的扩增片段，表明该症状类型由斯里兰卡木薯花叶病毒株系单独感染引起;第二种症状类型，表现出叶片花叶和植株矮化的样品不仅能扩增到SLCMV的特异性条带，也能扩增到CsCMV的特异片段，表明该种症状类型由斯里兰卡木薯花叶病毒和木薯普通花叶病毒2个株系复合感染引起;第三种症状类型（图2B），仅出现叶片花叶褪绿症状的植株样品，无SLCMV扩增产物，只能扩增到CsCMV的特异性片段，引物CsCMV-3269-F/CsCMV-3896-R产物大小0.6 kb，表明该类型由木薯普通花叶病毒株系侵染形成。与斯里兰卡木薯花叶病毒侵染形成的典型花叶症状相比，普通木薯花叶病毒株系病叶上“正常绿色”部分和“变色或黄化”部位之间界限不清晰，叶片无皱缩变形。
在2018年和2019年的384份测试样品中，斯里兰卡木薯花叶病毒株系（SLCMV）单独侵染的检出率为21.1%，分别来自海南、广东、云南、广西、贵州和福建6个省（区）的样品;木薯普通花叶病毒（CsCMV）单独侵染的检出率为78.8%，包括所有8个省（区）的样品;SLCMV-CsCMV复合侵染率为33.0%，主要来自海南、广西、广东和贵州4个省（区）的样品。由表3所示，CsCMV的检测仅随机选取了其中的179个样品，其感染率为78.8%，其中2019年每个采样点均只随机选取了3个样品进行检测，只有1个为阴性，其余样品均为阳性，据此推测若是将所有的样品进行检测，CsCMV的感染应该是普遍存在的。
2.4 木薯花叶病毒的鉴定
选取2019年海南儋州（DG1922）和贵州望谟（GZ1924）2个斯里兰卡木薯病毒阳性检测样品，经测序获得DNA-A和DNA-B全基因组序列，在Genbank的登录号为MN688214-MN688217。经BLAST比对表明，DG1922和GZ1924的DNA-A序列与已经报道的斯里兰卡木薯病毒株系柬埔寨分离物SLCMV-Cambodia（KT861468）[4]、越南分离物SLCMV-VTN6（LC312131）[14]、泰国分离物SLCMV-Surin1（MN544647）和中国分离物SLCMV-HN7（MH891840）[8]的序列同源性都在99%以上。为进一步明确国内木薯花叶病毒的归类，从Genbank下载11个木薯花叶病毒株系共37个不同分离物的DNA-A序列，与DG1922和GZ1924的DNA-A序列进行聚类分析，以番茄斑驳病毒序列（L14460）为树根，应用MEGA 7.0-ClastalW聚类，构建NJ（Neighbor-Joining）树。结果如图3所示，37个分离物均可严格地聚到各自所属的不同株系分枝中，DG1922和GZ1924序列均与斯里兰卡木薯花叶病毒株系聚在同一分枝，进一步表明，引起国内木薯花叶病毒病的双生病毒主要为斯里兰卡木薯花叶病毒株系。
同样，选择3个地点共5个木薯普通花叶病毒阳性检测样品分离物海南儋州（NX23，NX28）、广东开平（GD）和江西东乡（JX1，JX3）目的条带进行测序，经BLAST比对显示，目标序列与已经报道的拉丁美洲多个木薯普通花叶病毒分离物CsCMV-Arg104（KT002434）、CsCMV-Bra456（KT002429）和CsCMV-Arg128（KT002427）的依赖于RNA的RNA多聚酶基因（RdRp）序列同源性在91%～96%之间。引起木薯普通花叶病毒病的马铃薯X病毒组（Potexvirus）有5个株系，主要分布在阿根廷、巴西和哥伦比亚[15]，分别下载这些株系的24个拉丁美洲木薯普通花叶病毒分离物RdRp基因序列，以非洲花叶病毒株系为树根，聚类分析表明，国内木薯普通花叶病毒株系与已经报道的多个株系序列相似性较远，自为一个分枝，而且各个序列之间也有差异（图4）。表明国内的普通花叶病毒株系产生了较大的变异，形成独立分枝，有进化出新株系的可能性。
3 讨论
自从2016年在国内首次发现木薯花叶病毒病（本研究室内部资料）和2018年正式报道以来[4， 9]，陆续在国内多个木薯种植地发现该病害。本研究通过对国内多地木薯花叶病毒病的田间调查、症状分析和病原鉴定，表明国内已发生木薯花叶病毒病，但范围还仅限于品种（种质）保存基地，尚未传播到生产一线。由双生病毒引起的木薯花叶病的传毒媒介为烟粉虱，主要引起木薯花叶病毒病短距离的传播危害，远距离传播主要通过罹病种茎和带毒薯类产品的调运和农产品交易等[1]，本研究团队于2016年首次发现木薯花叶病毒病为害的品种‘东莞紅尾’，是种植了从引种隔离圃中调运出来的种茎;2017年在海南文昌发现的2个出现症状的品种‘SC10’和‘SC205’，是由于前期种植了从东南亚引进的感病种质，导致部分植株被感染;而在本研究中的调查发现，2018年和2019年各地出现症状的种质，几乎都来源于调运的种茎，而当地的主栽品种，由于缺乏抗性，部分品种也出现了感病情况。这些数据表明，种植引进和调运的罹病种茎是2018年、2019年各省（区）出现病害的主要原因。2015年时涛等[16]通过有害生物风险性分析（PRA）程序评估木薯花叶病毒病在国内的综合风险值R为2.42，属于高度危险的病害，而且国内的大部分主栽品种均不具备对该病的抗性[17-19]。综上所述，加强病害监测，禁止从疫区调运种茎，是预防病害传播、保障木薯产业健康发展的重要举措。 本研究通过对国内多地木薯花叶病症状和病原的鉴定调查，发现目前引起国内木薯产生花叶症状的有3种情况，即由SLCMV单独感染引起的木薯斯里兰卡花叶病毒病、SLCMV和CsCMV共同侵染引起的复合感染以及由CsCMV单独侵染引起的木薯普通花葉病毒病。从采集样品检测的结果来看，海南、广东、云南、广西、贵州和福建6个省（区）都有斯里兰卡木薯花叶病毒和普通花叶病毒的感染，而江西和湖南则以木薯普通花叶病毒感染为主。
研究人员根据双生病毒结构和序列的差异及其主要发生的地区，将木薯花叶病毒（CMV）分为11个株系和1个重组株系：即非洲木薯花叶病毒株系（African cassava mosaic virus， ACMV），木薯花叶病毒马达加斯加株系（cassava mosaic Madagascar virus， CMMGV），东非木薯花叶病毒株系（East African cassava mosaic virus， EACMV），东非木薯花叶病毒乌干达变种（East African cassava mosaic-Ugandan variant， EACMV-
UG），东非木薯花叶病毒喀麦隆株系（East African cassava mosaic Cameroon virus， EACMCV），东非木薯花叶病毒肯尼亚株系（East African cassava mosaic Kenya virus， EACMKV），东非木薯花叶病毒马拉维株系（East African cassava mosaic Malawi virus， EACMMV），东非木薯花叶病毒桑给巴尔株系（East African cassava mosaic Zanzibar virus， EACMZV），南非木薯花叶病毒株系（South African cassava mosaic virus， SACMV），非洲木薯花叶布基纳法索病毒（African cassava mosaic Burkina Faso virus， ACMBFV），印度木薯花叶病毒株系（Indian cassava mosaic virus， ICMV）和斯里兰卡木薯花叶病毒株系（Sri Lankan cassava mosaic virus， SLCMV）[20]。引起木薯普通花叶病的马铃薯X病毒组（Potexvirus）的5个株系则主要危害南美洲地区阿根廷、巴西和哥伦比亚的木薯。由于病毒结构简单，而且需要适应环境和品种的更替，常与寄主和其他病毒产生重组，从而变异成不同的株系。非洲强致病力的重组株系时有报道，目前在乌干达和加纳地区的强致病力病毒株系EACMV-UG，为东非木薯花叶病毒株系和非洲花叶病毒株系的重组体[21]。木薯普通花叶病毒病主要发生在拉丁美洲地区，尚未在非洲和东南亚发现，尽管多数文献报道南美洲的木薯普通花叶病毒对木薯的产量影响较小，但Venturini等[22]研究表明，巴西CsCMV的发生导致木薯品种‘BRS Kiriris’和‘BRS Jari’的产量损失达30%～60%。目前国内外均未见双生病毒和普通花叶病毒共同侵染木薯的报道，本研究检测到国内多地木薯同时携带2种病毒的情况属首次报道。
国内木薯花叶病毒病由斯里兰卡木薯花叶病毒株系引起，与2015年来影响柬埔寨、越南和泰国木薯产业的病毒株系有非常高的序列相似性，表明目前国内的木薯病毒与东南亚的株系有着很高的同源性，也可能直接或者间接来源于薯类农产品的边境或者国际贸易。木薯普通花叶病毒引起的花叶症状不典型，不具备扭曲畸形的特征，田间观察容易被忽视。聚类分析显示国内的CsCMV与南美洲多个株系序列相似性在96%以下，推测木薯普通花叶病毒株系已长期侵染国内多个木薯品种，存在序列重组变异的可能，须通过全基因组序列测定及变异率分析进行证明。国内的木薯产业及其育种在“一带一路”和国际合作的带动下，早期从哥伦比亚的国际热带农业研究中心（CIAT）引进了一些国外的优良种质[23]，也为病害的引入和传播提供了可能，但目前国内尚无因该病害而导致木薯产量和品质下降的报道，也是该病害没有得到足够重视的重要原因之一。
基于实际应用的需要，木薯病毒的检测技术在近年得到了快速发展。2019年Boykin等[24]通过结合PDQeX DNA纯化技术与MinION和MinIT移动测序设备，建立了便携式的林间试验室（Tree Lab）系统，用于对非洲木薯花叶病毒的现场早期诊断，突破了传统鉴定方法对大型设备的需求以及数据联网分析等程序，为技术人员在田间对病害的准确诊断提供了可能。Minato等[5]采用PCR技术对柬埔寨和越南的6480个木薯花叶病毒病疑似样品进行检测，结果表明样品感染率为7.6%，且发现14%的阳性样品无木薯花叶病毒病的典型症状。2015年Otti等[25]应用高通量多重实时PCR技术，可同时有效检测非洲的2种木薯重要病毒，即花叶病毒（ACMV）和褐条病毒（UCBSV），也分同属于DNA病毒和RNA病毒;Uke等[26]通过PCR和图像识别技术检测到引起印度木薯花叶的2种病毒印度木薯花叶病毒（ICMV）和斯里兰卡木薯花叶病毒（SLCMV），但无法对2种病毒进行有效区分。除了双生病毒引起的花叶病，国际上还有木薯褐条病、蛙皮病和多种潜在病毒性病害，由于国内首次发现该病的感染，其检测的方向多为双生病毒，除了存在普通花叶病毒的复合感染之外，是否还存在其他病毒的侵染，需要配合更多的检测技术进行深入分析。而作为分子生物学技术检测的基础，高效率的核酸抽提，以及微量病毒的有效提纯最为关键，很多假阴性的结果都与病毒核酸的抽提效率相关，同时作为最为便利的样品来源，以叶片作为靶标样品是否最有效也需要作进一步验证[27]。
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責任编辑：谢龙莲