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摘要 目的：觀察丹红注射液对不稳定型心绞痛（Unstable Angina Pectoris，UA）血瘀证患者择期经皮冠状动脉介入治疗（Percutaneous CoronaryIntervention，PCI）围手术期血清代谢组学的影响。方法：采用前瞻性、随机、对照、单盲的临床研究方法，选取2018年7月至2019年1月首都医科大学附属北京中医医院行PCI的中医证属血瘀证的UA患者61例作为研究对象，采用随机数字表法随机分为丹红组（n=31）和对照组（n=30）。丹红组采用西医规范治疗+丹红注射液治疗，对照组采用西医规范治疗+生理盐水，纳入健康志愿者10例。应用非靶向代谢组学方法对丹红组、对照组治疗前、PCI术后5 d及健康志愿者血清代谢产物进行分析。结果：治疗前，丹红组与对照组血清代谢产物谱比较，差异无统计学意义（P>0.05）;治疗前，丹红组及对照组与健康组有较大的差异，差异代谢物包括甘油磷脂代谢、鞘脂代谢、嘌呤代谢、氨基酸代谢等代谢通路中相关代谢产物;PCI术后5 d，丹红组与对照组患者的血清代谢物谱均趋向健康组，与治疗前比较差异有统计学意义（P<0.05）;术后丹红组患者的血清代谢物谱较对照组更接近健康组水平，差异有统计学意义（P<0.05）。结论：在西医规范治疗基础上使用丹红注射液，可使患者血清代谢产物水平更接近健康人群。
关键词 不稳定型心绞痛;血瘀证;丹红注射液;代谢组学;代谢通路;经皮冠状动脉介入治疗;围手术期;临床研究;心肌保护
Effects of Danhong Injection on Perioperative Metabolomics in Patients with Unstable Angina Pectoris
NIU Qian1，XING Wenlong2，LIU Hongxu2，WANG Yutong3，ZHU Yan4
（1 Beijing University of Traditional Chinese Medicine，Beijing 100029，China; 2 Beijing Hospital of Traditional Chinese Medicine Affiliated to Capital Medical University，Beijing，100010，China; 3 Capital Medical University，Beijing 100069，China; 4 Tianjin University of Traditional Chinese Medicine，Tianjin 301617，China）
Abstract Objective：To observe the effects of Danhong Injection on perioperative serum metabonomics in patients with blood stasis syndrome of unstable angina pectoris（UA）by using percutaneous coronary intervention（PCI） in a certain period.Methods：A prospective，randomized，controlled，single blind clinical trial was conducted.A total of 61 UA patients with TCM blood stasis syndrome undergoing elective PCI were selected as the research objects and were randomly divided into a Danhong group（n=31） and a control group（n=30），and 10 healthy volunteers were included as baseline.Danhong group received Western medicine+DHI treatment，the control group received Western medicine+saline.Non-targeted metabolomics methods were used to analyze the serum metabolites of Danhong group，and control group before treatment，5 days after PCI and serum metabolites of healthy volunteers.Results：Before treatment，there was no significant difference in serum metabolites between the Danhong group and the control group.Before treatment，there was significant difference among the above 2 groups and the healthy group.Differential metabolites mainly included glycerophospholipid，sphingolipid，purine，and amino acid groups，which were generated in their metabolic pathways.After 5 days of PCI，the profiles of serum metabolites were significantly closer to the healthy group.Compared with before treatment，there was a statistical difference; the serum metabolite profile of patients in the Danhong group was closer to the level of the healthy group than the control group，and the difference was statistically significant.Conclusion：The use of Danhong Injection on the basis of Western medicine standard treatment can make the patient′s serum metabolite level closer to healthy people. Keywords Unstable angina pectoris; Prethrombotic state; Danhong Injection; Metabolomics; Metabolic pathway; Perioperative PCI; Perioperative period;Clinical research; Myocardial protection
中图分类号：R289.5;R541文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.12.023
近年来，随着我国冠心病发病率不断升高，经皮冠状动脉介入治疗（Percutaneous Coronary Intervention，PCI）已成为冠心病的重要治疗方式之一，2018年，中国大陆PCI年手术量已经超过91万例，其中不稳定型心绞痛（Unstable Angina Pectoris，UA）患者占PCI总数的66.73%。伴随PCI的增多，与之相关的临床问题，如：无复流与慢血流、围手术期心肌损伤（Perioperative Myocardial Injury，PMI）、再灌注损伤等越来越成为人们关注的焦点。
PMI是指PCI术后心肌损伤相关生物标志物水平的升高，有着复杂的发生机制。目前现代医学的干预尚不能避免PMI的发生，这为中医药防治提供了空间[1]，有研究显示丹红注射液具有潜在的PCI围手术期心肌保护作用，针对丹红注射液PCI围手术期心肌保护作用机制的研究也在不断展开，其抗炎、改善微循环、抗氧化应激、抗凝以及促血管新生等药理作用被陆续揭示[2-5]。但由于中医药作用机制存在多靶点、多重机制的复杂性，从单一角度探索，在解释丹红注射液作用机制方面尚存在局限性。代谢组学作为一种从整体上研究生物体代谢产物和代谢途径的变化，进而探寻其病理生理变化过程的研究方法，具有整体性、动态性、即时性的特点[6]。基于此，本研究应用非靶向代谢组学方法对丹红注射液PCI围手术期心肌保护机制进行探索。现报道如下。
1 资料与方法
1.1 一般资料 选取2018年7月至2019年1月首都医科大学附属北京中医医院行PCI的中医证属血瘀证的UA患者61例作为研究对象，采用随机数字表法随机分为丹红组（n=31）和对照组（n=30）。2组患者性别、年龄、危险因素等一般资料比较，差异无统计学意义（P>0.05）;另选取2018年6月至2018年12月在首都医科大学附属北京中医医院体检中心体检的健康志愿者10例作为健康组，3组一般资料经统计学分析，差异无统计学意义（P>0.05），具有可比性。本项目经首都医科大学附属北京中医医院伦理委员会批准（20171020）。
1.2 诊断标准 西医诊断标准：1）UA诊断标准参考中国医师协会急诊医师分会、中华医学会心血管病学分会等在2016年颁布的《急性冠脉综合征急诊快速诊疗指南》及中华医学会心血管病学分会《非ST段抬高型急性冠状动脉综合征诊断和治疗指南（2016）》[7-8]。2）PCI按照中华医学会心血管病学分会介入心脏病学组发布的《中国经皮冠状动脉介入治疗指南（2016）》[9]。3）PMI诊断标准依照2018年ESC/ACC/AHA/WHF联合发布的第四版《全球心肌梗死新定义》[10]。
中医诊断标准：中医胸痹心痛病血瘀证诊断标准依据《中华人民共和国国家标准-中医临床诊疗术语证候部分》制定[11]。
1.3 纳入标准 1）符合UA诊断标准者;2）符合中医胸痹心痛病血瘀证诊断标准者;3）年龄18～86歲者;4）拟行PCI者;5）入院前2周未规律服用任何中药制剂者;6）受试者或其法定代理人对本研究知情同意并签署知情同意书。
1.4 排除标准 1）合并急性脑卒中者，有脑出血史者，有肝肾及造血系统等严重原发疾病者，有精神疾病的患者;2）合并其他能引起肌酶或心肌酶水平升高疾病者，如心肌炎、心力衰竭、骨骼肌损伤等;3）有慢性心功能不全且左室射血分数（LVEF）<40%者;4）严重感染性疾病、自身免疫性疾病、肿瘤患者;5）已知对丹红注射液过敏者;6）观察期间要求应用含有活血化瘀成分中药制剂者。
1.5 脱落与剔除标准 1）纳入后发现不符合UA诊断标准或冠脉影像学标准而被误纳入者;2）纳入后冠脉造影显示血管病变需行冠状动脉旁路移植术，或术者判断无需进行PCI手术，或拒绝接受PCI者;3）试验过程中服用其他中成药或中药汤剂者。因故剔除的病例应记录剔除原因，保留相关记录，不做疗效统计分析。但接受过治疗，且有安全性记录者，可视情况纳入安全性分析。
1.6 中止试验标准 1）出现过敏反应，考虑为试验药物所致者;2）出现重大的突发病情变化，需要重新调整治疗方案者;3）出现其他不可预知的紧急情况者。
1.7 终止试验标准 1）试验中发生严重安全性问题;2）有证据证明试验药物无效，不具有临床价值，应终止试验，避免延误受试者的有效治疗，同时避免不必要的经济损失;3）因故无法保证试验受试者安全;4）在试验中发现该方案有重大失误，难以评价药物效应;或者该方案在实施中发生了重大偏差，再继续下去，难以评价药物疗效。
1.8 研究方法
1.8.1 随机与盲法 采用前瞻性、随机、对照、单盲的临床试验方法，设定随机种子数字，选取由随机种子产生的180个随机数字（预存120个补充量）。将180个随机数字排定秩次，按编定秩次的奇偶进行分组，数值为奇数者分配至丹红组中，偶数者分配至对照组中。编制分配序列表，即随机数字对应的秩次与试验分组相对应。对患者实施盲法试验干预，符合纳入标准的患者，由主管医师按照入组时间的先后领取编号（由小到大）及相应编号的试验药物，记录每个受试对象的个人信息及其获取的药物编号。由护士负责药物使用，每次使用后均记录备案。2组均采用棕色套袋遮蔽输液瓶，使用棕色输液器进行滴注，使受试者处于盲态。 1.8.2 治疗方法 2组患者均按照《非ST段抬高型急性冠状动脉综合征诊断和治疗指南（2016）》进行西医规范治疗。在此基础上，丹红组予以丹红注射液40 mL+生理盐水250 mL，静脉滴注，滴速控制在100 mL/h左右，2次/d。术前应用2～3 d;冠脉造影穿刺成功后，静脉滴注1次;术后应用不少于5 d。对照组于同时间点应用生理盐水40 mL+生理盐水250 mL，静脉滴注。
1.8.3 血清样本采集与初步处理 采集健康组受试者空腹血清样本，采集丹红组及对照组患者治疗前和PCI术后5 d的血清样本。所有入选患者和健康组受试者血清样本的采集均要求空腹状态下（餐后8 h以上）。室温下，促凝管采集静脉血4 mL，血液样本在室温下自然静置1 h，4 ℃下3 000 r/min离心10 min（离心半径10 cm），收集上清液，置于-80 ℃冰箱冻存待测。
1.9 观察指标
1.9.1 PCI围手术期CK-MB水平的变化及PMI的发生率 对2组患者PCI围手术期心肌损伤标志物CK-MB的变化进行观察，比较分析2组患者PMI的发生情况。
1.9.2 术后30 d主要心血管事件（MACE事件） 采用电话随访、微信随访、门诊随访等方式，记录患者术后30 d内MACE事件发生情况，本研究MACE事件包括：导致再次住院的再发心绞痛、再发心肌梗死、冠脉血管重建、非致死性脑卒中、全因死亡。
1.9.3 代谢组学指标分析 通过对治疗前后丹红组、对照组和健康组的血清代谢产物及代谢途径进行比较分析，探讨丹红注射液对UA血瘀证患者PCI围手术期代谢组学可能的影响。
1.10 统计学方法 疗效学指标采用SPSS 15.0（PN：32119001，SN：5045602）统计软件进行数据分析，计量资料用均数±标准差（±s）表示，2组呈正态分布且方差齐性的连续性变量组间比较采用t检验，组内术前术后比较采用配对样本t检验;计数资料用百分比（%）表示，组间比较采用χ2检验。以P<0.05为差异有统计学意义。
1.11 代谢组学方法 采用超高效液相色谱-四级杆串联飞行时间质谱联用技术（UPLC-Q/TOF-MS）对样本进行非靶向代谢组学分析。
1.11.1 血清样本制备 1）将待测样品从-80 ℃冰箱中取出，置于4 ℃的冰水中融化30～60 min;2）取100 μL血清至标记好标签的1.5 mL离心管中，加入200 μL的乙腈;3）充分振荡10 min，进行蛋白沉淀。12 000 r/min，4 ℃，离心半径10 cm，离心10 min，取上层溶液100 μL，置于200 μL内衬管中，待测。
1.11.2 色谱条件及反相色谱分离条件 色谱分离采用Thermo Scientific的U3000超快速液相色谱使用反相色谱对样本进行分析。梯度系统的条件分别见表1。反相色谱分离条件：色谱柱Waters UPLC HSS T3（1.8 μm 2.1 mm×100 mm）;流动相：A（甲醇，0.1%甲酸，10 mmol/L乙酸铵）和B（水，0.1%甲酸，10 mmol/L乙酸铵）;洗脱程序见表1，流速：0.3 mL/min;进样量为1.0 μL;柱温：50 ℃。
1.11.3 亲水色谱分离条件 色谱柱Waters UPLC BEH Amide（1.7 μm 2.1 mm×100 mm）;流动相：A（乙腈，0.1%甲酸，10 mmol/L乙酸铵）和B（水，0.1%甲酸，10 mmol/L乙酸铵）;洗脱程序见表2。流速：0.3 mL/min;进样量为1 μL;柱温：40 ℃。
1.11.4 質谱条件 质谱分析使用装备热电喷雾离子源的四极杆轨道离子阱质谱仪（Q Exactive，ThermoFisher Scientific）。正离子离子源电压分别为3.7 kV。毛细管加热温度320 ℃。翘气压力30 psi，辅助气压力10 psi。容积加热蒸发温度300 ℃。翘气、辅助气及碰撞气均为氮气。碰撞气压力为1.5 mTorr。一级全扫描参数为：分辨率70 000，自动增益控制目标为1×106，最大隔离时间50 ms，质荷比扫描范围50～1 500 Da。液质系统由Xcalibur 2.2 SP1.48软件控制。
1.11.5 差异代谢标志物的鉴定 根据初步所筛选出的差异物一级精确分子量和对质控样本进行MS/MS二级扫描得到的二级质谱图，搜索在线数据库HMDB，比较质谱的质荷比m/z或者精确分子质量Mass，误差限制0.01 Da。对应代谢物的二级图谱及碎片分子量，经过结构推导得出初步结果，最后通过与标准品的MS/MS质谱图比较进行鉴定。
1.11.6 代谢组学数据统计分析方法 对采集好的液相-质谱数据采用Progenesis QI软件处理，依次进行导入原始数据、峰对齐、峰提取、归一化处理，形成保留时间、质荷比和峰强度的表格。反相色谱和亲水色谱提取峰的时间分别为1～18 min和1～12 min。各种添加剂离子均去卷积到每一个离子特征。
分别取各组所有样品各5 μL混合均匀，经前处理作为质控样品（前处理方法和其他样品一样）。首先采用5个空白样本平衡色谱柱，再采用3个质控样本平衡柱条件。然后每间隔6～8个样本插入1个质控样本用于监测整个液质系统的稳定性和重复性。计算质控样本中提取的代谢特征的变异系数值，变异系数超过15%的代谢特征被删除。
应用SIMCA14.1（Umetrics）进行主成分分析（PCA），偏最小二乘法判别分析（PLS-DA）和正交偏最小二乘法判别分析（OPLS-DA），单样本方差分析和t检验;采用PLS-DA模型的VIP值（阈值>1），并结合t检验的P值（P<0.05），以及组间倍率变化（Fold Change）值（FC值<0.75，1.3 2.1 疗效指标
2.1.1 2组患者PMI发生率比较 61例中有6例发生了PMI，总发生率为9.83%，丹红组PMI发生率为3.32%，对照组为16.67%，2组比较差异无统计学意义（P>0.05）。见表3。
2.1.2 2组患者PCI围手术期CK-MB水平的动态变化比较 手术前，2组CK-MB水平比较，差异无统计学意义（P=0.83），具有可比性。手术后，丹红组24 h CK-MB、5 d CK-MB均升高，与手术前比较，差异均无统计学意义（P=0.36，P=0.78）;对照组术后24 h的CK-MB和术后5 d的CK-MB均升高，与手术前比较，差异均有统计学意义（P=0.01，P=0.04）;2组术后5 d的CK-MB均较术后24 h回落，同组比较，丹红组差异无统计学意义（P=0.23），对照组差异有统计学意义（P=0.04）。
手术后2组间比较，丹红组术后24 h的CK-MB水平较对照组低，差异有统计学意义（P=0.04），术后5 d 2组差异无统计学意义（P=0.38）。见表4。
2.1.3 2组患者PCI术后30 d内MACE发生率的比较 对61例进行了术后30 d的随访工作。结果显示，2组共5例受试者发生了再发心绞痛，其中丹红组1例，对照组4例（3.2%比13.3%），丹红组及对照组术后30 d内MACE总发生率为8.3%，2组比较差异无统计学意义（P>0.05）。2组未失访患者，未出现死亡、再发心肌梗死、冠脉血管重建及非致死性脑卒中。
2组患者在试验过程中均未出现药疹、出血等表现，血尿便常规、肝肾功能、血凝系列等未见因试验用药引起的异常。2组患者试验过程中一般体格检查均未见明显异常。试验期间无丹红注射液相关的不良反应发生，安全性良好。
2.2 代谢组学分析结果
2.2.1 图1A、1B依次为试验样本的反相色谱正离子总离子流图（TIC）以及亲水色谱正离子TIC。结果发现代谢产物得到了良好分离，且组间存在差异。主成分分析（PCA）模型参数见表5，反向色谱正离子图及亲水色谱正离子图见图2。
2.2.2 丹红组术前和对照组术前PCA及OPLS-DA分析 分析模型参数分别见表6、表7。
采用置换验证试验进行模型过拟合评价。见图3E、图4F。R2X代表模型对样本在X轴上的解释率，Q2表示模型对样本的预测率，分析结果显示丹红组术前和对照组术前OPLS-DA模型的R2X较小，Q2小于0，提示该模型未过度拟合，说明丹红组术前和对照组术前血清中代谢物在种类和数量上没有明显的统计学意义上的差异，术前2组血清样本的代谢轮廓较为接近，具有可比性。
2.2.3 丹红组术前和对照组术前与健康组的PCA及OPLS-DA分析 3组分析模型参数分别见表8、表9。
在PCA得分图中可以看出，术前的丹红组和对照组与健康组有明显的分离，结合分析结果提示疾病组的代谢网络相对于健康组发生紊乱，患者与健康者血清中代谢物在种类及数量上存在明显的差异。
2.2.4 丹红组术后及对照组术后与健康组的PLS-DA分析 分析模型参数分别见表10、图5。
从代谢轮廓的相对位置上看，丹红组术后的代谢轮廓更接近于健康组。丹红注射液对疾病相关的生物标志物起到了一定的回调作用。相关差异代谢物鉴别结果。见表11、表12。
3 讨论
本研究显示，在丹红组和对照组受试者基本情况一致的情况下，丹红组PMI发生率有低于对照组的趋势，丹红组PCI术后CK-MB升高程度低于对照组，且丹红组术后CK-MB的回落时间早于对照组，提示UA血瘀证患者PCI围手术期应用丹红注射液可以对心肌损伤标志物的升高起到抑制作用，具有一定的围手术期心肌保护作用。丹红组PMI的发生率、术后30 d MACE事件发生率均低于对照组，但差异无统计学意义（P>0.05）。综上所述，丹红注射液对UA血瘀证患者PCI围手术期具有一定的心肌保护作用。本研究属于探索性试验，纳入样本量较小，期待更大规模的随机对照研究及相关基础研究的进一步证实。
代谢组学分析鉴定显示，丹红组、对照组与健康组的血清代谢物谱存在着显著差异，这些差异代谢产物涵盖了甘油磷脂代谢、鞘脂代谢、嘌呤代谢、氨基酸代谢等多个代谢通路。脂质代谢紊乱在冠心病发病过程中扮演着关键角色[12-13]。在甘油磷脂代谢途径中，术前患者的血清样本中C18∶1、C18∶2溶血磷脂酰胆碱以及C18∶0、C18∶1溶血磷脂酰乙醇胺水平较健康者有明显降低，上述代谢产物与机体脂质代谢密切相关，与胰岛素抵抗水平指数呈显著负相关[14];术前患者的甘油磷脂酰胆碱、C18∶3/C16∶0、C22∶6/C14∶0、C20∶4/C16∶1以及C20∶4/C16∶0磷脂酰胆碱等的水平较健康者也有着明显的下降;C14∶0溶血磷脂酰膽碱与胰岛素抵抗水平指标呈显著正相关，术前患者血清中C14∶0溶血磷脂酰胆碱含量较健康组上升[15]。鞘脂类物质与冠心病关系密切，鞘氨醇的蓄积与心肌细胞凋亡有关，并在冠心病的发生、发展方面扮演着重要角色，术前患者SM（d18∶1/22∶1（13Z））水平较健康者有明显升高[16]。以上代谢产物水平的异常，提示术前患者发生了脂质代谢紊乱。在经过规范的药物及PCI后，患者的上述指标均趋近健康组的水平，提示规范治疗改善了UA患者脂质代谢紊乱;而术后丹红组的水平较对照组更接近健康组，提示在现代医学规范治疗的基础上加用丹红注射液，可以更好地调控UA血瘀证患者的脂质代谢紊乱，这可能是丹红注射液治疗UA血瘀证的作用机制之一。
支链氨基酸（BCAA）作为人体必需氨基酸，在生理状态下可以发挥多种重要的生理作用，如作为信号分子调节糖脂代谢、细胞凋亡及线粒体自噬等[17-18]。但当其代谢出现紊乱时，则可能会导致胰岛素抵抗、糖耐量异常及糖尿病的发生，且与动脉粥样硬化及冠心病的发生密切相关，高水平的BCAA是心肌梗死和冠心病发病的独立危险因素[19-23]。本研究显示术前患者血清样本中L-亮氨酸水平较健康者有显著升高，提示UA血瘀证发病过程中可能存在BCAA代谢异常，而经过治疗后的丹红组和对照组的血清L-亮氨酸水平较前下降;与对照组比较，丹红组的下降水平更趋近于健康组，提示丹红注射液在UA血瘀证患者机体BCAA代谢过程中起到较好的调节作用。 PCI术前，丹红组和对照组的L-Octanoylcarnitine、Hypoxanthine、Decanoylcarnitine、9-Decenoylcarnitine、DL-2-Aminooctanoic Acid、L-苯丙氨酸、L-色氨酸等代谢成分较健康组均有显著的升高，提示在UA的发病过程中伴随着嘌呤代谢、肉碱、氨基酸代谢的紊乱。肉碱在机体的脂肪代谢和能量产生中起着重要作用，它可以转运脂酰辅酶A通过线粒体内膜进入线粒体基质进行供能，可以改善机体能量供应，并促进缺血心肌脂肪代谢[24]。本研究中患者肉碱水平较健康者升高，其代谢过程可能为UA血瘀证患者长期存在着葡萄糖及脂肪利用的异常，使得肝脏脂肪合成增加，分解代谢减少，体内游离肉碱水平代偿性增加。在经过药物治疗及PCI术后，以上代谢产物的水平均较之前降低，丹红组的降低趋势则更接近健康组的水平。
综上所述，通过应用非靶向代谢组学的方法对PCI围手术期UA血瘀证患者及健康者之间的血清差异代谢物进行分析，我们发现了与UA血瘀证病理生理过程有强关联的潜在生物标志物，这为从整体水平探索UA病理生理机制及寻求新的治疗途径提供了依据。研究也提示丹红注射液通过在甘油磷脂代谢、鞘脂代谢、嘌呤代谢、氨基酸代谢等多个代谢通路上的调节，起到对UA血瘀证患者PCI围手术期心肌保护的作用。代谢组学方法在现代中医药研究方面有较大的优势，而更进一步的研究可在目前研究的基础上联合多种组学技术，采用多种技术方法融合和多层面交叉研究，从而更深入、更全面地揭示丹红注射液心肌保护作用机制。
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（2020-06-08收稿 责任编辑：杨觉雄）
基金项目：国家自然科学基金面上项目（81273741）;北京市自然科学基金项目（7142077）;许夏基金项目（XX-201710）;北京中医医院院级课题暨两院合作课题（YJ201720）
作者简介：牛芊（1991.12—），男，硕士，住院医师，研究方向：中西医结合防治心血管病，E-mail：[email protected]
通信作者：刘红旭（1963.01—），男，本科，主任医师，研究方向：中医、中西医结合防治心血管病，E-mail：[email protected];邢文龙（1988.08—），男，博士，主治医师，研究方向：中西医结合防治心血管疾病基础与临床研究，E-mail：[email protected]
关键词 不稳定型心绞痛;血瘀证;丹红注射液;代谢组学;代谢通路;经皮冠状动脉介入治疗;围手术期;临床研究;心肌保护
Effects of Danhong Injection on Perioperative Metabolomics in Patients with Unstable Angina Pectoris
NIU Qian1，XING Wenlong2，LIU Hongxu2，WANG Yutong3，ZHU Yan4
（1 Beijing University of Traditional Chinese Medicine，Beijing 100029，China; 2 Beijing Hospital of Traditional Chinese Medicine Affiliated to Capital Medical University，Beijing，100010，China; 3 Capital Medical University，Beijing 100069，China; 4 Tianjin University of Traditional Chinese Medicine，Tianjin 301617，China）
Abstract Objective：To observe the effects of Danhong Injection on perioperative serum metabonomics in patients with blood stasis syndrome of unstable angina pectoris（UA）by using percutaneous coronary intervention（PCI） in a certain period.Methods：A prospective，randomized，controlled，single blind clinical trial was conducted.A total of 61 UA patients with TCM blood stasis syndrome undergoing elective PCI were selected as the research objects and were randomly divided into a Danhong group（n=31） and a control group（n=30），and 10 healthy volunteers were included as baseline.Danhong group received Western medicine+DHI treatment，the control group received Western medicine+saline.Non-targeted metabolomics methods were used to analyze the serum metabolites of Danhong group，and control group before treatment，5 days after PCI and serum metabolites of healthy volunteers.Results：Before treatment，there was no significant difference in serum metabolites between the Danhong group and the control group.Before treatment，there was significant difference among the above 2 groups and the healthy group.Differential metabolites mainly included glycerophospholipid，sphingolipid，purine，and amino acid groups，which were generated in their metabolic pathways.After 5 days of PCI，the profiles of serum metabolites were significantly closer to the healthy group.Compared with before treatment，there was a statistical difference; the serum metabolite profile of patients in the Danhong group was closer to the level of the healthy group than the control group，and the difference was statistically significant.Conclusion：The use of Danhong Injection on the basis of Western medicine standard treatment can make the patient′s serum metabolite level closer to healthy people. Keywords Unstable angina pectoris; Prethrombotic state; Danhong Injection; Metabolomics; Metabolic pathway; Perioperative PCI; Perioperative period;Clinical research; Myocardial protection
中图分类号：R289.5;R541文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.12.023
近年来，随着我国冠心病发病率不断升高，经皮冠状动脉介入治疗（Percutaneous Coronary Intervention，PCI）已成为冠心病的重要治疗方式之一，2018年，中国大陆PCI年手术量已经超过91万例，其中不稳定型心绞痛（Unstable Angina Pectoris，UA）患者占PCI总数的66.73%。伴随PCI的增多，与之相关的临床问题，如：无复流与慢血流、围手术期心肌损伤（Perioperative Myocardial Injury，PMI）、再灌注损伤等越来越成为人们关注的焦点。
PMI是指PCI术后心肌损伤相关生物标志物水平的升高，有着复杂的发生机制。目前现代医学的干预尚不能避免PMI的发生，这为中医药防治提供了空间[1]，有研究显示丹红注射液具有潜在的PCI围手术期心肌保护作用，针对丹红注射液PCI围手术期心肌保护作用机制的研究也在不断展开，其抗炎、改善微循环、抗氧化应激、抗凝以及促血管新生等药理作用被陆续揭示[2-5]。但由于中医药作用机制存在多靶点、多重机制的复杂性，从单一角度探索，在解释丹红注射液作用机制方面尚存在局限性。代谢组学作为一种从整体上研究生物体代谢产物和代谢途径的变化，进而探寻其病理生理变化过程的研究方法，具有整体性、动态性、即时性的特点[6]。基于此，本研究应用非靶向代谢组学方法对丹红注射液PCI围手术期心肌保护机制进行探索。现报道如下。
1 资料与方法
1.1 一般资料 选取2018年7月至2019年1月首都医科大学附属北京中医医院行PCI的中医证属血瘀证的UA患者61例作为研究对象，采用随机数字表法随机分为丹红组（n=31）和对照组（n=30）。2组患者性别、年龄、危险因素等一般资料比较，差异无统计学意义（P>0.05）;另选取2018年6月至2018年12月在首都医科大学附属北京中医医院体检中心体检的健康志愿者10例作为健康组，3组一般资料经统计学分析，差异无统计学意义（P>0.05），具有可比性。本项目经首都医科大学附属北京中医医院伦理委员会批准（20171020）。
1.2 诊断标准 西医诊断标准：1）UA诊断标准参考中国医师协会急诊医师分会、中华医学会心血管病学分会等在2016年颁布的《急性冠脉综合征急诊快速诊疗指南》及中华医学会心血管病学分会《非ST段抬高型急性冠状动脉综合征诊断和治疗指南（2016）》[7-8]。2）PCI按照中华医学会心血管病学分会介入心脏病学组发布的《中国经皮冠状动脉介入治疗指南（2016）》[9]。3）PMI诊断标准依照2018年ESC/ACC/AHA/WHF联合发布的第四版《全球心肌梗死新定义》[10]。
中医诊断标准：中医胸痹心痛病血瘀证诊断标准依据《中华人民共和国国家标准-中医临床诊疗术语证候部分》制定[11]。
1.3 纳入标准 1）符合UA诊断标准者;2）符合中医胸痹心痛病血瘀证诊断标准者;3）年龄18～86歲者;4）拟行PCI者;5）入院前2周未规律服用任何中药制剂者;6）受试者或其法定代理人对本研究知情同意并签署知情同意书。
1.4 排除标准 1）合并急性脑卒中者，有脑出血史者，有肝肾及造血系统等严重原发疾病者，有精神疾病的患者;2）合并其他能引起肌酶或心肌酶水平升高疾病者，如心肌炎、心力衰竭、骨骼肌损伤等;3）有慢性心功能不全且左室射血分数（LVEF）<40%者;4）严重感染性疾病、自身免疫性疾病、肿瘤患者;5）已知对丹红注射液过敏者;6）观察期间要求应用含有活血化瘀成分中药制剂者。
1.5 脱落与剔除标准 1）纳入后发现不符合UA诊断标准或冠脉影像学标准而被误纳入者;2）纳入后冠脉造影显示血管病变需行冠状动脉旁路移植术，或术者判断无需进行PCI手术，或拒绝接受PCI者;3）试验过程中服用其他中成药或中药汤剂者。因故剔除的病例应记录剔除原因，保留相关记录，不做疗效统计分析。但接受过治疗，且有安全性记录者，可视情况纳入安全性分析。
1.6 中止试验标准 1）出现过敏反应，考虑为试验药物所致者;2）出现重大的突发病情变化，需要重新调整治疗方案者;3）出现其他不可预知的紧急情况者。
1.7 终止试验标准 1）试验中发生严重安全性问题;2）有证据证明试验药物无效，不具有临床价值，应终止试验，避免延误受试者的有效治疗，同时避免不必要的经济损失;3）因故无法保证试验受试者安全;4）在试验中发现该方案有重大失误，难以评价药物效应;或者该方案在实施中发生了重大偏差，再继续下去，难以评价药物疗效。
1.8 研究方法
1.8.1 随机与盲法 采用前瞻性、随机、对照、单盲的临床试验方法，设定随机种子数字，选取由随机种子产生的180个随机数字（预存120个补充量）。将180个随机数字排定秩次，按编定秩次的奇偶进行分组，数值为奇数者分配至丹红组中，偶数者分配至对照组中。编制分配序列表，即随机数字对应的秩次与试验分组相对应。对患者实施盲法试验干预，符合纳入标准的患者，由主管医师按照入组时间的先后领取编号（由小到大）及相应编号的试验药物，记录每个受试对象的个人信息及其获取的药物编号。由护士负责药物使用，每次使用后均记录备案。2组均采用棕色套袋遮蔽输液瓶，使用棕色输液器进行滴注，使受试者处于盲态。 1.8.2 治疗方法 2组患者均按照《非ST段抬高型急性冠状动脉综合征诊断和治疗指南（2016）》进行西医规范治疗。在此基础上，丹红组予以丹红注射液40 mL+生理盐水250 mL，静脉滴注，滴速控制在100 mL/h左右，2次/d。术前应用2～3 d;冠脉造影穿刺成功后，静脉滴注1次;术后应用不少于5 d。对照组于同时间点应用生理盐水40 mL+生理盐水250 mL，静脉滴注。
1.8.3 血清样本采集与初步处理 采集健康组受试者空腹血清样本，采集丹红组及对照组患者治疗前和PCI术后5 d的血清样本。所有入选患者和健康组受试者血清样本的采集均要求空腹状态下（餐后8 h以上）。室温下，促凝管采集静脉血4 mL，血液样本在室温下自然静置1 h，4 ℃下3 000 r/min离心10 min（离心半径10 cm），收集上清液，置于-80 ℃冰箱冻存待测。
1.9 观察指标
1.9.1 PCI围手术期CK-MB水平的变化及PMI的发生率 对2组患者PCI围手术期心肌损伤标志物CK-MB的变化进行观察，比较分析2组患者PMI的发生情况。
1.9.2 术后30 d主要心血管事件（MACE事件） 采用电话随访、微信随访、门诊随访等方式，记录患者术后30 d内MACE事件发生情况，本研究MACE事件包括：导致再次住院的再发心绞痛、再发心肌梗死、冠脉血管重建、非致死性脑卒中、全因死亡。
1.9.3 代谢组学指标分析 通过对治疗前后丹红组、对照组和健康组的血清代谢产物及代谢途径进行比较分析，探讨丹红注射液对UA血瘀证患者PCI围手术期代谢组学可能的影响。
1.10 统计学方法 疗效学指标采用SPSS 15.0（PN：32119001，SN：5045602）统计软件进行数据分析，计量资料用均数±标准差（±s）表示，2组呈正态分布且方差齐性的连续性变量组间比较采用t检验，组内术前术后比较采用配对样本t检验;计数资料用百分比（%）表示，组间比较采用χ2检验。以P<0.05为差异有统计学意义。
1.11 代谢组学方法 采用超高效液相色谱-四级杆串联飞行时间质谱联用技术（UPLC-Q/TOF-MS）对样本进行非靶向代谢组学分析。
1.11.1 血清样本制备 1）将待测样品从-80 ℃冰箱中取出，置于4 ℃的冰水中融化30～60 min;2）取100 μL血清至标记好标签的1.5 mL离心管中，加入200 μL的乙腈;3）充分振荡10 min，进行蛋白沉淀。12 000 r/min，4 ℃，离心半径10 cm，离心10 min，取上层溶液100 μL，置于200 μL内衬管中，待测。
1.11.2 色谱条件及反相色谱分离条件 色谱分离采用Thermo Scientific的U3000超快速液相色谱使用反相色谱对样本进行分析。梯度系统的条件分别见表1。反相色谱分离条件：色谱柱Waters UPLC HSS T3（1.8 μm 2.1 mm×100 mm）;流动相：A（甲醇，0.1%甲酸，10 mmol/L乙酸铵）和B（水，0.1%甲酸，10 mmol/L乙酸铵）;洗脱程序见表1，流速：0.3 mL/min;进样量为1.0 μL;柱温：50 ℃。
1.11.3 亲水色谱分离条件 色谱柱Waters UPLC BEH Amide（1.7 μm 2.1 mm×100 mm）;流动相：A（乙腈，0.1%甲酸，10 mmol/L乙酸铵）和B（水，0.1%甲酸，10 mmol/L乙酸铵）;洗脱程序见表2。流速：0.3 mL/min;进样量为1 μL;柱温：40 ℃。
1.11.4 質谱条件 质谱分析使用装备热电喷雾离子源的四极杆轨道离子阱质谱仪（Q Exactive，ThermoFisher Scientific）。正离子离子源电压分别为3.7 kV。毛细管加热温度320 ℃。翘气压力30 psi，辅助气压力10 psi。容积加热蒸发温度300 ℃。翘气、辅助气及碰撞气均为氮气。碰撞气压力为1.5 mTorr。一级全扫描参数为：分辨率70 000，自动增益控制目标为1×106，最大隔离时间50 ms，质荷比扫描范围50～1 500 Da。液质系统由Xcalibur 2.2 SP1.48软件控制。
1.11.5 差异代谢标志物的鉴定 根据初步所筛选出的差异物一级精确分子量和对质控样本进行MS/MS二级扫描得到的二级质谱图，搜索在线数据库HMDB，比较质谱的质荷比m/z或者精确分子质量Mass，误差限制0.01 Da。对应代谢物的二级图谱及碎片分子量，经过结构推导得出初步结果，最后通过与标准品的MS/MS质谱图比较进行鉴定。
1.11.6 代谢组学数据统计分析方法 对采集好的液相-质谱数据采用Progenesis QI软件处理，依次进行导入原始数据、峰对齐、峰提取、归一化处理，形成保留时间、质荷比和峰强度的表格。反相色谱和亲水色谱提取峰的时间分别为1～18 min和1～12 min。各种添加剂离子均去卷积到每一个离子特征。
分别取各组所有样品各5 μL混合均匀，经前处理作为质控样品（前处理方法和其他样品一样）。首先采用5个空白样本平衡色谱柱，再采用3个质控样本平衡柱条件。然后每间隔6～8个样本插入1个质控样本用于监测整个液质系统的稳定性和重复性。计算质控样本中提取的代谢特征的变异系数值，变异系数超过15%的代谢特征被删除。
应用SIMCA14.1（Umetrics）进行主成分分析（PCA），偏最小二乘法判别分析（PLS-DA）和正交偏最小二乘法判别分析（OPLS-DA），单样本方差分析和t检验;采用PLS-DA模型的VIP值（阈值>1），并结合t检验的P值（P<0.05），以及组间倍率变化（Fold Change）值（FC值<0.75，1.3
2.1.1 2组患者PMI发生率比较 61例中有6例发生了PMI，总发生率为9.83%，丹红组PMI发生率为3.32%，对照组为16.67%，2组比较差异无统计学意义（P>0.05）。见表3。
2.1.2 2组患者PCI围手术期CK-MB水平的动态变化比较 手术前，2组CK-MB水平比较，差异无统计学意义（P=0.83），具有可比性。手术后，丹红组24 h CK-MB、5 d CK-MB均升高，与手术前比较，差异均无统计学意义（P=0.36，P=0.78）;对照组术后24 h的CK-MB和术后5 d的CK-MB均升高，与手术前比较，差异均有统计学意义（P=0.01，P=0.04）;2组术后5 d的CK-MB均较术后24 h回落，同组比较，丹红组差异无统计学意义（P=0.23），对照组差异有统计学意义（P=0.04）。
手术后2组间比较，丹红组术后24 h的CK-MB水平较对照组低，差异有统计学意义（P=0.04），术后5 d 2组差异无统计学意义（P=0.38）。见表4。
2.1.3 2组患者PCI术后30 d内MACE发生率的比较 对61例进行了术后30 d的随访工作。结果显示，2组共5例受试者发生了再发心绞痛，其中丹红组1例，对照组4例（3.2%比13.3%），丹红组及对照组术后30 d内MACE总发生率为8.3%，2组比较差异无统计学意义（P>0.05）。2组未失访患者，未出现死亡、再发心肌梗死、冠脉血管重建及非致死性脑卒中。
2组患者在试验过程中均未出现药疹、出血等表现，血尿便常规、肝肾功能、血凝系列等未见因试验用药引起的异常。2组患者试验过程中一般体格检查均未见明显异常。试验期间无丹红注射液相关的不良反应发生，安全性良好。
2.2 代谢组学分析结果
2.2.1 图1A、1B依次为试验样本的反相色谱正离子总离子流图（TIC）以及亲水色谱正离子TIC。结果发现代谢产物得到了良好分离，且组间存在差异。主成分分析（PCA）模型参数见表5，反向色谱正离子图及亲水色谱正离子图见图2。
2.2.2 丹红组术前和对照组术前PCA及OPLS-DA分析 分析模型参数分别见表6、表7。
采用置换验证试验进行模型过拟合评价。见图3E、图4F。R2X代表模型对样本在X轴上的解释率，Q2表示模型对样本的预测率，分析结果显示丹红组术前和对照组术前OPLS-DA模型的R2X较小，Q2小于0，提示该模型未过度拟合，说明丹红组术前和对照组术前血清中代谢物在种类和数量上没有明显的统计学意义上的差异，术前2组血清样本的代谢轮廓较为接近，具有可比性。
2.2.3 丹红组术前和对照组术前与健康组的PCA及OPLS-DA分析 3组分析模型参数分别见表8、表9。
在PCA得分图中可以看出，术前的丹红组和对照组与健康组有明显的分离，结合分析结果提示疾病组的代谢网络相对于健康组发生紊乱，患者与健康者血清中代谢物在种类及数量上存在明显的差异。
2.2.4 丹红组术后及对照组术后与健康组的PLS-DA分析 分析模型参数分别见表10、图5。
从代谢轮廓的相对位置上看，丹红组术后的代谢轮廓更接近于健康组。丹红注射液对疾病相关的生物标志物起到了一定的回调作用。相关差异代谢物鉴别结果。见表11、表12。
3 讨论
本研究显示，在丹红组和对照组受试者基本情况一致的情况下，丹红组PMI发生率有低于对照组的趋势，丹红组PCI术后CK-MB升高程度低于对照组，且丹红组术后CK-MB的回落时间早于对照组，提示UA血瘀证患者PCI围手术期应用丹红注射液可以对心肌损伤标志物的升高起到抑制作用，具有一定的围手术期心肌保护作用。丹红组PMI的发生率、术后30 d MACE事件发生率均低于对照组，但差异无统计学意义（P>0.05）。综上所述，丹红注射液对UA血瘀证患者PCI围手术期具有一定的心肌保护作用。本研究属于探索性试验，纳入样本量较小，期待更大规模的随机对照研究及相关基础研究的进一步证实。
代谢组学分析鉴定显示，丹红组、对照组与健康组的血清代谢物谱存在着显著差异，这些差异代谢产物涵盖了甘油磷脂代谢、鞘脂代谢、嘌呤代谢、氨基酸代谢等多个代谢通路。脂质代谢紊乱在冠心病发病过程中扮演着关键角色[12-13]。在甘油磷脂代谢途径中，术前患者的血清样本中C18∶1、C18∶2溶血磷脂酰胆碱以及C18∶0、C18∶1溶血磷脂酰乙醇胺水平较健康者有明显降低，上述代谢产物与机体脂质代谢密切相关，与胰岛素抵抗水平指数呈显著负相关[14];术前患者的甘油磷脂酰胆碱、C18∶3/C16∶0、C22∶6/C14∶0、C20∶4/C16∶1以及C20∶4/C16∶0磷脂酰胆碱等的水平较健康者也有着明显的下降;C14∶0溶血磷脂酰膽碱与胰岛素抵抗水平指标呈显著正相关，术前患者血清中C14∶0溶血磷脂酰胆碱含量较健康组上升[15]。鞘脂类物质与冠心病关系密切，鞘氨醇的蓄积与心肌细胞凋亡有关，并在冠心病的发生、发展方面扮演着重要角色，术前患者SM（d18∶1/22∶1（13Z））水平较健康者有明显升高[16]。以上代谢产物水平的异常，提示术前患者发生了脂质代谢紊乱。在经过规范的药物及PCI后，患者的上述指标均趋近健康组的水平，提示规范治疗改善了UA患者脂质代谢紊乱;而术后丹红组的水平较对照组更接近健康组，提示在现代医学规范治疗的基础上加用丹红注射液，可以更好地调控UA血瘀证患者的脂质代谢紊乱，这可能是丹红注射液治疗UA血瘀证的作用机制之一。
支链氨基酸（BCAA）作为人体必需氨基酸，在生理状态下可以发挥多种重要的生理作用，如作为信号分子调节糖脂代谢、细胞凋亡及线粒体自噬等[17-18]。但当其代谢出现紊乱时，则可能会导致胰岛素抵抗、糖耐量异常及糖尿病的发生，且与动脉粥样硬化及冠心病的发生密切相关，高水平的BCAA是心肌梗死和冠心病发病的独立危险因素[19-23]。本研究显示术前患者血清样本中L-亮氨酸水平较健康者有显著升高，提示UA血瘀证发病过程中可能存在BCAA代谢异常，而经过治疗后的丹红组和对照组的血清L-亮氨酸水平较前下降;与对照组比较，丹红组的下降水平更趋近于健康组，提示丹红注射液在UA血瘀证患者机体BCAA代谢过程中起到较好的调节作用。 PCI术前，丹红组和对照组的L-Octanoylcarnitine、Hypoxanthine、Decanoylcarnitine、9-Decenoylcarnitine、DL-2-Aminooctanoic Acid、L-苯丙氨酸、L-色氨酸等代谢成分较健康组均有显著的升高，提示在UA的发病过程中伴随着嘌呤代谢、肉碱、氨基酸代谢的紊乱。肉碱在机体的脂肪代谢和能量产生中起着重要作用，它可以转运脂酰辅酶A通过线粒体内膜进入线粒体基质进行供能，可以改善机体能量供应，并促进缺血心肌脂肪代谢[24]。本研究中患者肉碱水平较健康者升高，其代谢过程可能为UA血瘀证患者长期存在着葡萄糖及脂肪利用的异常，使得肝脏脂肪合成增加，分解代谢减少，体内游离肉碱水平代偿性增加。在经过药物治疗及PCI术后，以上代谢产物的水平均较之前降低，丹红组的降低趋势则更接近健康组的水平。
综上所述，通过应用非靶向代谢组学的方法对PCI围手术期UA血瘀证患者及健康者之间的血清差异代谢物进行分析，我们发现了与UA血瘀证病理生理过程有强关联的潜在生物标志物，这为从整体水平探索UA病理生理机制及寻求新的治疗途径提供了依据。研究也提示丹红注射液通过在甘油磷脂代谢、鞘脂代谢、嘌呤代谢、氨基酸代谢等多个代谢通路上的调节，起到对UA血瘀证患者PCI围手术期心肌保护的作用。代谢组学方法在现代中医药研究方面有较大的优势，而更进一步的研究可在目前研究的基础上联合多种组学技术，采用多种技术方法融合和多层面交叉研究，从而更深入、更全面地揭示丹红注射液心肌保护作用机制。
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（2020-06-08收稿 责任编辑：杨觉雄）
基金项目：国家自然科学基金面上项目（81273741）;北京市自然科学基金项目（7142077）;许夏基金项目（XX-201710）;北京中医医院院级课题暨两院合作课题（YJ201720）
作者简介：牛芊（1991.12—），男，硕士，住院医师，研究方向：中西医结合防治心血管病，E-mail：[email protected]
通信作者：刘红旭（1963.01—），男，本科，主任医师，研究方向：中医、中西医结合防治心血管病，E-mail：[email protected];邢文龙（1988.08—），男，博士，主治医师，研究方向：中西医结合防治心血管疾病基础与临床研究，E-mail：[email protected]