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[摘要]目的：探讨丹银海绵对糖尿病大鼠皮肤溃疡创面愈合的影响。方法：将雄性Wistar大鼠随机分为8组。除空白对照组外，其余7组大鼠，通过手术在其背部形成一10mm×10mm相同大小，深达肌层的溃疡，分别给予抗生素、生长因子凝胶、纳米银、丹黄散，以及不同浓度的丹银海绵处理溃疡面。给药28d后处死大鼠，取溃疡部位新生肉芽组织，HE染色观察组织形态的变化;Western Blot检测大鼠创面组织中AGEs、hs-CRP、IL-1、IL-6、bFGF、PDGF、VEGF表达水平。结果：病理切片观察显示适宜浓度的丹银海绵可以促进血管新生并伴扩张，同时生成大量新生成纤维细胞。Western Blot检测显示高浓度的丹银海绵可以显著上调创面组织中生长因子表达（P<0.05），降低AGEs水平及炎症因子表達（P<0.05）。结论：适宜浓度的丹银海绵对于糖尿病大鼠皮肤溃疡的愈合有明显的促进作用，提高治疗效果。
[关键词]丹银海绵;糖尿病;皮肤溃疡;AGEs;生长因子;炎症因子;创面愈合
[中图分类号]R285 [文献标志码]A [文章编号]1008-6455（2020）03-0071-04
Abstract： Objective To investigate the effect of Dan silver sponge on wound healing of diabetic rats with skin ulcers. Methods Male Wistar rats were randomly divided into 8 groups. Except for the control group， in the other 7 groups of rats， a 10mm×10mm ulcer was created on the back by surgery， and the depth of the ulcer reached the muscle layer. Treatment of ulcers with antibiotics， growth factor gel， nanosilver， Danhuang powder， and different concentrations of Dan silver sponge.The rats were sacrificed 28d after administration， and the new granulation tissue of the ulcer was taken. The histomorphological changes were observed by HE staining. The expression levels of AGEs， hs-CRP， IL-1， IL-6， bFGF， PDGF and VEGF in rat wound tissues were detected by Western Blot. Results Pathological sections showed that the appropriate concentration of Dan silver sponge can promote angiogenesis and expansion， and generate a large number of new fibroblasts. Western Blot assay indicated that high concentration of Dan silver sponge significantly up-regulated the expression of growth factor in wound tissue （P<0.05）， and decreased the expression of AGEs and inflammatory factors （P<0.05）. Conclusion The appropriate concentration of Dan silver sponge can promote the healing of skin ulcer in diabetic rats and improve the efficacy.
Key words： Dan silver sponge; diabetes; skin ulcers; AGEs; growth factors; inflammatory factors; wound healing
糖尿病是一种全身慢性代谢性疾病[1]。糖尿病皮肤溃疡（Diabetic cutaneous ulcers，DCU）是指因糖尿病患者长期血糖控制不佳引起神经以及不同程度的末梢血管病变，从而导致感染、溃疡形成和或深部组织的破坏，是糖尿病患者致死致残的严重并发症之一，严重影响患者生活质量[2-4]。DCU的治疗效果至今尚不理想，且随着近年来糖尿病患者的日益增多，DCU所造成的社会经济负担日趋沉重，故亟需研制新的治疗方法提高其临床疗效[4-5]。本课题组在前期研究中发现丹黄散可有效促进DCU的愈合，但其抗菌性较差，有一定的局限性[6-7]。大量研究显示纳米银具有广谱抗菌、不产生耐药、且生物兼容性良好的特点[8-10]。因此，本研究将丹黄散与具有良好抗菌作用的纳米银有机结合，通过动物实验观察其对糖尿病溃疡创面愈合的影响，现报道如下。
1 材料和方法
1.1 试剂与药品：丹黄散制剂（选购丹参、大黄、当归、沉香、松香、没药六味中药按1：1：1的比例制成丹黄散制剂，由医院药剂科制备完成）;纳米银海绵（羟甲基壳聚糖与硝酸银的混合溶液制成纳米银海绵，低、中、高浓度丹银海绵分别含硝酸银11.11%、16.67%、22.22%，由医院中心实验室制备完成）;丹银海绵（纳米银海绵负载丹黄散，由医院中心实验室制备完成）;链脲佐菌素（Streptozocin，STZ）（Sigma）;柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液（Sigma）;艾科灵睿血糖仪及试纸（艾康生物技术有限公司）;重组人表皮生长因子凝胶（批号：14020213）。 1.2 实验动物：健康雄性Wistar大鼠40只，体重180～220g，购自重庆国家生物产业基地实验动物中心。
1.3 实验方法
1.3.1 分组：随机分为空白对照组、抗生素组、生长因子组、纳米银组、丹黄散组、低浓度丹银海绵组、中浓度丹银海绵组、高浓度丹银海绵组共8组，每组5只。
1.3.2 糖尿病大鼠模型的制备：空白对照组采用普通饲料喂养，其余7组采用高脂高糖饲料喂养20d，禁食12h后腹腔注射10% STZ 40mg/kg，第7天测空腹血糖高于16.7mmol/L时，认为糖尿病模型制备成功。造模过程中失败的大鼠随时补充。
1.3.3 皮肤溃疡样本制备及干预：1周后，对大鼠腹腔注射水合氯酸进行麻醉，选择背部面积10mm×10mm区域，剃去毛发，龙胆紫染色标记，无菌条件下剪去标记部位皮肤，深达肌层，形成溃疡区。皮肤创面形成后，将制备所得的糖尿病溃疡感染模型大鼠随机分为7组，纳米银组采用银纳米涂抹溃疡部位;丹黄散组采用“丹黄散”外敷换药;低浓度丹银海绵组采用低浓度丹银海绵外敷换药;中浓度丹银海绵组采用中浓度丹银海绵外敷换药;高浓度丹银海绵组采用高浓度丹银海绵外敷换药;生长因子组采用重组人表皮生长因子凝胶换药;抗生素组采用亚胺培南西司他丁钠换药;另取正常大鼠5只按上述方法造模后做为第8组空白对照组，不加任何干预方法。
1.3.4 主要观察指标
1.3.4.1 细胞形态学观察：实验后28d处死大鼠，取溃疡部位新生肉芽组织，置于-80℃保存备用，部分肉芽组织以福尔马林保存。创面新生肉芽组织采用HE染色观察创面新生组织中毛细血管增生情况与细胞形态学改变;
1.3.4.2 创面组织因子测定：用Western Blot方法检测新生肉芽组织，测定大鼠创面组织中AGEs、hs-CRP、IL-1、IL-6、bFGF、PDGF、VEGF表达水平。
1.4 统计学分析：用SPSS 22.0软件处理数据，实验数据以均数±标准差（x?±s）表示，两样本比较应用t检验，多样本比较应用方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 创面组织病理观察：HE染色镜下显示：丹黄散组可见大量新生的成纤维细胞和扩张的毛细血管，组织结构紧密，较粗血管周围可见袢状弯曲的毛细血管网，与空白对照组相比炎症细胞浸润较少。低浓度纳米银海绵组中上述现象更为显著，大量新生血管形成伴有扩张、有大量新生成纤维细胞促使组织结构紧密。详见图1。
2.2 各组创面组织AGEs表达水平：空白对照组、抗生素组、生长因子组、纳米银组、丹黄散组、不同浓度（低、中、高）丹银海绵组创面组织中AGEs水平进行比较，差异均有统计学意义（P<0.05）;其中高浓度丹银海绵组创面组织AGEs水平均明显低于其余7组，差异均具有统计学意义（P<0.05）;但高浓度丹银海绵组与中浓度丹银海绵组创面组织AGEs水平比较，差异无统计学意义（P>0.05）。详见表1。
2.3 各组创面组织炎症因子表达：空白对照组、抗生素组、生长因子组、纳米银组、丹黄散组、不同浓度（低、中、高）丹银海绵组创面组织中炎症介质hs-CRP、IL-1、IL-6含量进行比较，差异均有统计学意义（P<0.05）;其中高浓度丹银海绵组、中浓度丹银海绵组创面组织炎症因子水平均明显低于其余6组，差异均具有统计学意义（P<0.05）。详见表2。
2.4 各组创面组织生长因子表达：对照组、抗生素组、生长因子组、纳米银组、丹黄散组、不同浓度（低、中、高）丹银海绵组创面组织中生长因子bFGF、EGF、VEGF表达进行比较，差异均有统计学意义（P<0.05）;其中高浓度丹银海绵组、中浓度丹银海绵组创面组织bFGF、PDGF、VEGF表达均明显高于其余6组，差异均具有统计学意义（P<0.05）;但高浓度组与中浓度组创面组织bFGF、PDGF、VEGF表达比较，差异无统计意义（P>0.05）。详见表3。
3 讨论
祖国医学将糖尿病归于“脱疽”“疮疡”的范畴，病机属本虚标实之症，治疗以益气活血、通络化瘀、清热解毒、祛腐生肌为主[11]。前期研究已证实具有清热解毒、活血利湿、祛腐生肌的中药丹黄散可以促进糖尿病大鼠溃疡创面愈合，缩短愈合时间，但抗感染效果不佳。纳米银具有抗菌性，抗耐药性，临床广泛应用于溃疡、烧伤等的治疗中[9-10]。因此，本课题组将纳米银与丹黄散相结合，制备出不同浓度的丹银海绵，观察其对糖尿病溃疡创面愈合的影响，以期提高DCU的治疗效果，减轻患者、家庭、社会的负担。
创面愈合是一个复杂的过程，包括创面炎症反应、上皮内皮及血管新生、基质形成和胶原合成，涉及可溶性介质如生长因子、细胞因子和趋化因子，细胞外基质与不同细胞因子之间的协调作用[10，12]。AGEs的产生可间接刺激创面炎性因子合成，加重集体炎症反应[13];同时AGEs的聚集，能降低生长因子糖基化能力[14]，进一步影响创面愈合进程。说明AGEs的产生及积聚是糖尿病皮肤创面修复失控的本质[15]。本研究结果显示与其他组比较，外敷高浓度丹银海绵组的糖尿病大鼠皮肤溃疡创面组织中，AGEs水平降低，提示适宜浓度的丹银海绵可通过干预AGEs的表达影响创面愈合。
hs-CRP、IL-1、IL-6等炎症因子在DCU创面中的分泌，可刺激血管内皮因子释放，同时导致神经组织血流减少，从而加重创面炎症反应，抑制溃疡创面愈合[16-17]。本研究结果显示，与空白对照组相比，其余七组大鼠创面组织中炎症因子含量均有所减少，且中浓度与高浓度丹银海绵组的上述炎症因子的含量下降程度明显高于其他各组，说明适宜浓度的丹银海绵外敷可以减轻DCU创面的炎症反应，从而促进组织愈合。
炎症反应是影响糖尿病皮肤创面溃疡愈合的重要因素，而bFGF、PDGF、VEGF等生長因子的表达，则直接影响了新生血管的形成，从而直接决定了组织愈合的速度[18-19]。本研究结果显示与空白对照组相比，其余七组大鼠创面组织中生长因子表达均有所上调，且中浓度与高浓度丹银海绵组的生长因子表达上调程度明显高于其他各组，说明丹银海绵外敷可以促进生长因子表达上调，从而促进血管新生，进一步促进溃疡创面愈合。 新鲜肉芽组织的形成在创面愈合的过程中也尤为重要，直接影响愈合过程以及预后发展。新生毛细血管及成纤维细胞增生共同构成了肉芽组织，同时伴有炎性细胞浸润[20]。炎性细胞可降低组织氧含量，影响局部组织微循环，阻碍创面愈合，成纤维细胞增生及新生毛细血管的形成促进创面的愈合[21]。本次实验结果均表明适宜浓度的丹银海绵可促进新生毛细血管生长，加速成纤维细胞增生，减少炎性细胞浸润，从而加速创面愈合。
综上，适宜浓度的丹银海绵可以有效通过降低创面AGEs水平及hs-CRP、IL-1、IL-6等炎症因子的表达，使生长因子表达上调，促进创面新生组织中毛线血管新生及成纤维细胞的增生，从而促进糖尿病大鼠皮肤溃疡创面愈合进程，加速糖尿病大鼠皮肤溃疡愈合。但关于丹银海绵对促进糖尿病大鼠皮肤溃疡愈合过程中所涉及的有关分子机制、信号通络以及安全性还有待进一步研究。
[参考文献]
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[收稿日期]2019-09-16
本文引用格式：張春玲，陈露，赵伟，等.丹银海绵对糖尿病大鼠皮肤溃疡创面愈合的影响[J].中国美容医学，2020，29（3）：71-74.
[关键词]丹银海绵;糖尿病;皮肤溃疡;AGEs;生长因子;炎症因子;创面愈合
[中图分类号]R285 [文献标志码]A [文章编号]1008-6455（2020）03-0071-04
Abstract： Objective To investigate the effect of Dan silver sponge on wound healing of diabetic rats with skin ulcers. Methods Male Wistar rats were randomly divided into 8 groups. Except for the control group， in the other 7 groups of rats， a 10mm×10mm ulcer was created on the back by surgery， and the depth of the ulcer reached the muscle layer. Treatment of ulcers with antibiotics， growth factor gel， nanosilver， Danhuang powder， and different concentrations of Dan silver sponge.The rats were sacrificed 28d after administration， and the new granulation tissue of the ulcer was taken. The histomorphological changes were observed by HE staining. The expression levels of AGEs， hs-CRP， IL-1， IL-6， bFGF， PDGF and VEGF in rat wound tissues were detected by Western Blot. Results Pathological sections showed that the appropriate concentration of Dan silver sponge can promote angiogenesis and expansion， and generate a large number of new fibroblasts. Western Blot assay indicated that high concentration of Dan silver sponge significantly up-regulated the expression of growth factor in wound tissue （P<0.05）， and decreased the expression of AGEs and inflammatory factors （P<0.05）. Conclusion The appropriate concentration of Dan silver sponge can promote the healing of skin ulcer in diabetic rats and improve the efficacy.
Key words： Dan silver sponge; diabetes; skin ulcers; AGEs; growth factors; inflammatory factors; wound healing
糖尿病是一种全身慢性代谢性疾病[1]。糖尿病皮肤溃疡（Diabetic cutaneous ulcers，DCU）是指因糖尿病患者长期血糖控制不佳引起神经以及不同程度的末梢血管病变，从而导致感染、溃疡形成和或深部组织的破坏，是糖尿病患者致死致残的严重并发症之一，严重影响患者生活质量[2-4]。DCU的治疗效果至今尚不理想，且随着近年来糖尿病患者的日益增多，DCU所造成的社会经济负担日趋沉重，故亟需研制新的治疗方法提高其临床疗效[4-5]。本课题组在前期研究中发现丹黄散可有效促进DCU的愈合，但其抗菌性较差，有一定的局限性[6-7]。大量研究显示纳米银具有广谱抗菌、不产生耐药、且生物兼容性良好的特点[8-10]。因此，本研究将丹黄散与具有良好抗菌作用的纳米银有机结合，通过动物实验观察其对糖尿病溃疡创面愈合的影响，现报道如下。
1 材料和方法
1.1 试剂与药品：丹黄散制剂（选购丹参、大黄、当归、沉香、松香、没药六味中药按1：1：1的比例制成丹黄散制剂，由医院药剂科制备完成）;纳米银海绵（羟甲基壳聚糖与硝酸银的混合溶液制成纳米银海绵，低、中、高浓度丹银海绵分别含硝酸银11.11%、16.67%、22.22%，由医院中心实验室制备完成）;丹银海绵（纳米银海绵负载丹黄散，由医院中心实验室制备完成）;链脲佐菌素（Streptozocin，STZ）（Sigma）;柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液（Sigma）;艾科灵睿血糖仪及试纸（艾康生物技术有限公司）;重组人表皮生长因子凝胶（批号：14020213）。 1.2 实验动物：健康雄性Wistar大鼠40只，体重180～220g，购自重庆国家生物产业基地实验动物中心。
1.3 实验方法
1.3.1 分组：随机分为空白对照组、抗生素组、生长因子组、纳米银组、丹黄散组、低浓度丹银海绵组、中浓度丹银海绵组、高浓度丹银海绵组共8组，每组5只。
1.3.2 糖尿病大鼠模型的制备：空白对照组采用普通饲料喂养，其余7组采用高脂高糖饲料喂养20d，禁食12h后腹腔注射10% STZ 40mg/kg，第7天测空腹血糖高于16.7mmol/L时，认为糖尿病模型制备成功。造模过程中失败的大鼠随时补充。
1.3.3 皮肤溃疡样本制备及干预：1周后，对大鼠腹腔注射水合氯酸进行麻醉，选择背部面积10mm×10mm区域，剃去毛发，龙胆紫染色标记，无菌条件下剪去标记部位皮肤，深达肌层，形成溃疡区。皮肤创面形成后，将制备所得的糖尿病溃疡感染模型大鼠随机分为7组，纳米银组采用银纳米涂抹溃疡部位;丹黄散组采用“丹黄散”外敷换药;低浓度丹银海绵组采用低浓度丹银海绵外敷换药;中浓度丹银海绵组采用中浓度丹银海绵外敷换药;高浓度丹银海绵组采用高浓度丹银海绵外敷换药;生长因子组采用重组人表皮生长因子凝胶换药;抗生素组采用亚胺培南西司他丁钠换药;另取正常大鼠5只按上述方法造模后做为第8组空白对照组，不加任何干预方法。
1.3.4 主要观察指标
1.3.4.1 细胞形态学观察：实验后28d处死大鼠，取溃疡部位新生肉芽组织，置于-80℃保存备用，部分肉芽组织以福尔马林保存。创面新生肉芽组织采用HE染色观察创面新生组织中毛细血管增生情况与细胞形态学改变;
1.3.4.2 创面组织因子测定：用Western Blot方法检测新生肉芽组织，测定大鼠创面组织中AGEs、hs-CRP、IL-1、IL-6、bFGF、PDGF、VEGF表达水平。
1.4 统计学分析：用SPSS 22.0软件处理数据，实验数据以均数±标准差（x?±s）表示，两样本比较应用t检验，多样本比较应用方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 创面组织病理观察：HE染色镜下显示：丹黄散组可见大量新生的成纤维细胞和扩张的毛细血管，组织结构紧密，较粗血管周围可见袢状弯曲的毛细血管网，与空白对照组相比炎症细胞浸润较少。低浓度纳米银海绵组中上述现象更为显著，大量新生血管形成伴有扩张、有大量新生成纤维细胞促使组织结构紧密。详见图1。
2.2 各组创面组织AGEs表达水平：空白对照组、抗生素组、生长因子组、纳米银组、丹黄散组、不同浓度（低、中、高）丹银海绵组创面组织中AGEs水平进行比较，差异均有统计学意义（P<0.05）;其中高浓度丹银海绵组创面组织AGEs水平均明显低于其余7组，差异均具有统计学意义（P<0.05）;但高浓度丹银海绵组与中浓度丹银海绵组创面组织AGEs水平比较，差异无统计学意义（P>0.05）。详见表1。
2.3 各组创面组织炎症因子表达：空白对照组、抗生素组、生长因子组、纳米银组、丹黄散组、不同浓度（低、中、高）丹银海绵组创面组织中炎症介质hs-CRP、IL-1、IL-6含量进行比较，差异均有统计学意义（P<0.05）;其中高浓度丹银海绵组、中浓度丹银海绵组创面组织炎症因子水平均明显低于其余6组，差异均具有统计学意义（P<0.05）。详见表2。
2.4 各组创面组织生长因子表达：对照组、抗生素组、生长因子组、纳米银组、丹黄散组、不同浓度（低、中、高）丹银海绵组创面组织中生长因子bFGF、EGF、VEGF表达进行比较，差异均有统计学意义（P<0.05）;其中高浓度丹银海绵组、中浓度丹银海绵组创面组织bFGF、PDGF、VEGF表达均明显高于其余6组，差异均具有统计学意义（P<0.05）;但高浓度组与中浓度组创面组织bFGF、PDGF、VEGF表达比较，差异无统计意义（P>0.05）。详见表3。
3 讨论
祖国医学将糖尿病归于“脱疽”“疮疡”的范畴，病机属本虚标实之症，治疗以益气活血、通络化瘀、清热解毒、祛腐生肌为主[11]。前期研究已证实具有清热解毒、活血利湿、祛腐生肌的中药丹黄散可以促进糖尿病大鼠溃疡创面愈合，缩短愈合时间，但抗感染效果不佳。纳米银具有抗菌性，抗耐药性，临床广泛应用于溃疡、烧伤等的治疗中[9-10]。因此，本课题组将纳米银与丹黄散相结合，制备出不同浓度的丹银海绵，观察其对糖尿病溃疡创面愈合的影响，以期提高DCU的治疗效果，减轻患者、家庭、社会的负担。
创面愈合是一个复杂的过程，包括创面炎症反应、上皮内皮及血管新生、基质形成和胶原合成，涉及可溶性介质如生长因子、细胞因子和趋化因子，细胞外基质与不同细胞因子之间的协调作用[10，12]。AGEs的产生可间接刺激创面炎性因子合成，加重集体炎症反应[13];同时AGEs的聚集，能降低生长因子糖基化能力[14]，进一步影响创面愈合进程。说明AGEs的产生及积聚是糖尿病皮肤创面修复失控的本质[15]。本研究结果显示与其他组比较，外敷高浓度丹银海绵组的糖尿病大鼠皮肤溃疡创面组织中，AGEs水平降低，提示适宜浓度的丹银海绵可通过干预AGEs的表达影响创面愈合。
hs-CRP、IL-1、IL-6等炎症因子在DCU创面中的分泌，可刺激血管内皮因子释放，同时导致神经组织血流减少，从而加重创面炎症反应，抑制溃疡创面愈合[16-17]。本研究结果显示，与空白对照组相比，其余七组大鼠创面组织中炎症因子含量均有所减少，且中浓度与高浓度丹银海绵组的上述炎症因子的含量下降程度明显高于其他各组，说明适宜浓度的丹银海绵外敷可以减轻DCU创面的炎症反应，从而促进组织愈合。
炎症反应是影响糖尿病皮肤创面溃疡愈合的重要因素，而bFGF、PDGF、VEGF等生長因子的表达，则直接影响了新生血管的形成，从而直接决定了组织愈合的速度[18-19]。本研究结果显示与空白对照组相比，其余七组大鼠创面组织中生长因子表达均有所上调，且中浓度与高浓度丹银海绵组的生长因子表达上调程度明显高于其他各组，说明丹银海绵外敷可以促进生长因子表达上调，从而促进血管新生，进一步促进溃疡创面愈合。 新鲜肉芽组织的形成在创面愈合的过程中也尤为重要，直接影响愈合过程以及预后发展。新生毛细血管及成纤维细胞增生共同构成了肉芽组织，同时伴有炎性细胞浸润[20]。炎性细胞可降低组织氧含量，影响局部组织微循环，阻碍创面愈合，成纤维细胞增生及新生毛细血管的形成促进创面的愈合[21]。本次实验结果均表明适宜浓度的丹银海绵可促进新生毛细血管生长，加速成纤维细胞增生，减少炎性细胞浸润，从而加速创面愈合。
综上，适宜浓度的丹银海绵可以有效通过降低创面AGEs水平及hs-CRP、IL-1、IL-6等炎症因子的表达，使生长因子表达上调，促进创面新生组织中毛线血管新生及成纤维细胞的增生，从而促进糖尿病大鼠皮肤溃疡创面愈合进程，加速糖尿病大鼠皮肤溃疡愈合。但关于丹银海绵对促进糖尿病大鼠皮肤溃疡愈合过程中所涉及的有关分子机制、信号通络以及安全性还有待进一步研究。
[参考文献]
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[收稿日期]2019-09-16
本文引用格式：張春玲，陈露，赵伟，等.丹银海绵对糖尿病大鼠皮肤溃疡创面愈合的影响[J].中国美容医学，2020，29（3）：71-74.