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摘 要 通过实践发现教材泡菜中亚硝酸盐含量测定实验存在的一些问题，参考国标的方法进行改进，以紫外分光光度计为检测仪器，建立了标准曲线，研究了络合物加入时间、显色时间、显色液的稳定性及活性炭脱色效果。
关键词 泡菜 亚硝酸盐 分光光度计
中图分类号 Q-33 文献标志码 B
1 引言
发展学生的核心素养被置于课程改革的基础地位，其中培养学生的科学探究能力是重要的组成部分。“制作泡菜并检测亚硝酸盐含量”是人教版高中生物教材《选修1·生物技术实践》中的一个实验，该实验与现实生活紧密相连，具有很强的实践性。学生通过主动参与科学探索过程，在实践中加深对知识的理解，掌握科学方法，学会科学地认识世界。生物学科的发展和进步离不开其他学科，尤其是数学、物理、化学、信息学及技术，因此学科素养融合对于发展学生的核心素养至关重要。教师要充分挖掘有理科共性的思维和方法，把相关的学科素养融合起来，汇成个体的核心素养。而该实验很好地融合了其他理科学科，尤其是运用到了化学的一些定量分析方法，例如样品的前处理、移液管的使用等，把生物和化学相关的知识融合起来，更好地促进学生核心素养的发展。
蔬菜容易富集硝酸盐，若在其生长过程中大量使用了氮肥，则所含硝酸盐的含量就会更高。硝酸盐本身对人体无害或毒害性相对较低，然而人体摄入的硝酸盐可在细菌的作用下还原成亚硝酸盐，亚硝酸盐可导致高铁血红蛋白症。当人体摄入的亚硝酸盐总量达到0.3～0.5 g时，会引起中毒；当摄入总量达到3 g时，会引起死亡。另一方面，亚硝酸盐可在一定的条件下形成亚硝胺，从而诱发消化系统癌变，对人体健康构成了潜在的威胁。故需要检测蔬菜及蔬菜制品中亚硝酸盐的含量。
廖德丰对硝酸盐和亚硝酸盐的毒理学效应及检测技术研究进展进行了梳理，主要针对水体亚硝酸盐和硝酸盐污染对水生生物及人体的毒理学效应进行阐述，并罗列了检测硝酸盐和亚硝酸盐的新方法，对中学教师深入认识该实验有很大的帮助。尽管此实验为定量检测实验，但教材中采用的是误差较大的目视比色法，故有人采用分光光度计进行精确测定，让学生体会现代实验设备在生物学课堂中的应用。肖安庆等研究了贮藏条件和时间对蔬菜中亚硝酸盐含量的影响。下面着重从化学的视角来对该实验进行深入分析，利用精密分析仪器——分光光度计进行实验探究，探讨存在的问题并提出解决方案。
2 实验原理
在弱酸性条件下，亚硝酸盐与对氨基苯磺酸溶液发生重氮反应后，与萘乙二胺盐酸偶联形成紫红色的偶氮染料（图1），将显色后的样品与已知浓度的标准显色液进行比较，可以采用目视比色法和光电比色法。
3 实验部分
3.1 仪器与试剂
主要仪器：容量瓶，移液管，漏斗，50 mL比色管，723型分光光度计，电子分析天平，搅拌机，离心机，pH计。
试剂：亚铁氰化钾溶液（106 g/L）；乙酸锌溶液（220 g/L）；饱和硼砂溶液（50 g/L）：对氨基苯磺酸溶液（4 g/L）；N-1-萘基乙二胺盐酸盐溶液（2 g/L）；亚硝酸钠标准溶液（200 μg /mL）；亚硝酸钠标准使用液（5.0 μg/mL）；氢氧化铝乳液；氢氧化钠溶液（2.5 mol/L）。本方法所用试剂均为分析纯，水为去离子水。
泡菜的制作：将白菜洗净，切成小块，晾晒过夜，放入泡菜坛中，加入煮沸并冷却的食盐水，浸没蔬菜，密封发酵，3 d后取用。
提取剂：50 g氯化镉与50 g氯化钡，溶解于1 000 mL蒸馏水中，用浓盐酸调节pH至1。
3.2 实验步骤
3.2.1 操作过程
称取5 g试样，在研钵中研磨成匀浆，加12.5 mL饱和硼砂溶液，搅拌均匀，以300 mL 70 ℃左右的水将试样洗入500 mL容量瓶中，于沸水浴中加热15 min，取出置冷水浴中冷却，并放置至室温。
振荡上述提取液时，加入5 mL 亚铁氰化钾溶液，摇匀，再加入5 mL 乙酸锌溶液，以沉淀蛋白质。加水至刻度，摇匀，放置30 min，上清液用滤纸过滤，弃去初滤液30 mL，滤液备用。
吸取40 mL上述滤液于50 mL带塞比色管中，另吸取0.00、0.20、0.40、0.60、0.80、1.0、1.5 mL亚硝酸钠标准使用液（相当于0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、7.5 μg亚硝酸钠），分别置于50 mL带塞比色管中。于标准管与试样管中分别加入2.0 mL对氨基苯磺酸溶液，混匀。静置3～5 min 后，各加入1.0 mL盐酸萘乙二胺溶液，加水至刻度，混匀，静置3 min后，用1 cm比色皿，以零管调节零点，于波长538 nm处测吸光度，绘制标准曲线，同时做试剂空白。
3.2.2 结果计算
用下式进行计算亚硝酸盐（以亚硝酸钠计）的含量：
X1=■
式中：
X1——试样中亚硝酸钠的含量，单位为毫克每千克（mg/kg）；
A1——测定用样液中亚硝酸钠的质量，单位为微克（μg）；
m——試样质量，单位为克（g）；
V1——测定用样液体积，单位为毫升（mL）；
V0——试样处理液总体积，单位为毫升（mL）。
4 结果与讨论
4.1 高中生物教材中“制作泡菜并检测亚硝酸盐含量”解析
在对高中生物教材中“制作泡菜并检测亚硝酸盐含量”的亚硝酸盐含量测定方法实验过程中，发现了如下问题：
（1） 溶液配制：亚硝酸盐标准液配制采用的是硅胶干燥器中干燥24 h的亚硝酸钠，以硅胶干燥剂进行吸湿干燥，但是亚硝酸盐含水量不大，放置于硅胶干燥器中24 h干燥效果并不明显。此外，亚硝酸盐只有在320℃以上才会发生分解，所以完全可以在烘箱中用110℃烘干到恒重后，再进行称量和溶液配制，最终配制好的溶液的浓度才会更精确。 （2） 样品前处理：教材中关于样品处理液的制备方法存在较多问题，见表1。
综上所述，高中生物教材中“制作泡菜并检测亚硝酸盐含量”这一实验存在较多问题。在高中阶段就应该让学生形成定量的概念，培养其严谨的科学精神，故而参考国标中检测亚硝酸盐的方法对这个实验进行改进，具体操作方法如3.2所示。
4.2 标准曲线绘制
以亚硝酸盐质量（x）为横坐标，对应的吸光度（y）为纵坐标，绘制出标准曲线，计算曲线斜率，得出二者的关系式为：y=0.1565x，相关系数R2=0.9995，线性关系良好（图2）。
4.3 络合物加入时间及显色时间的确定
取0.5 mL浓度为5.0 μg/mL的亚硝酸钠标准溶液，置于50 mL的比色管中，接着按以下四种方案进行实验：① 同时加入2 mL的对氨基苯磺酸溶液和1 mL 的萘乙二胺盐酸溶液；② 先加入2 mL的对氨基苯磺酸溶液，3 min后加入1 mL 的萘乙二胺盐酸；③ 先加入2 mL的对氨基苯磺酸溶液，5 min后加入1 mL 的萘乙二胺盐酸；④ 先加入2 mL的对氨基苯磺酸溶液，7 min后加入1 mL 的萘乙二胺盐酸。之后加水至刻度，混匀，分别取静置2、5、10、15、20、 30、60、120、180 min 后的溶液，以试剂空白作参比，在538 nm测得吸光度值，如图3所示。同时加入对氨基苯磺酸溶液和萘乙二胺盐酸整体发光值较低，络合物在显色反应3 min时发光值已趋于稳定，且显色液在几个小时内相对稳定。故选择先加入2 mL的对氨基苯磺酸溶液，3 min后再加入1 mL 的萘乙二胺盐酸，定容后显色反应3 min后进行测定。
4.4 活性炭脫色实验
参考国标的方法进行测定，在样品前处理时发现，当选用样品颜色较深时，处理过后的溶液依然存在较深的颜色，影响结果测定。活性炭能较好地吸附植物中的色素，故选择用活性炭对最后的样品液进行脱色处理，可以有效地消除测定时产生的误差，并对加入活性炭之后的实验进行回收率测定。称取4份5 g样品，分别加入0、1、3、5 mL的5.25 μg/mL 亚硝酸钠标准溶液，按照3.2进行处理，只是在沸水浴后分别加入2 g活性炭继续加热2 min，其余步骤同3.2。最后测定吸光度，结果见表2，加入活性炭进行脱色的回收率在87.9%～94.6%之间，证明该方法具有较高的回收率。
4.5 小结
通过在实际操作发现高中生物教材中“制作泡菜并检测亚硝酸盐含量”实验中存在的一些问题，故而参考国标的方法对这个实验进行改进。通过紫外分光光度计对实验结果进行精密测量，建立标准曲线，考查了反应溶液的稳定性，希望能让广大中学教师对此实验的原理、样品的前处理、实验的操作、实验结果的处理等方面能有更深入的认识，从而更好地应用到实验教学中。
参考文献：
[1] 朱正威，孙万儒，赵占良.生物1·生物技术实践（选修）[M].北京：人民教育出版社，2007：9-10.
[2] 刘杏认，任建强，甄兰.蔬菜硝酸盐累积及其影响因素的研究[J].土壤通报，2003，34（4）：354-361.
[3] 廖德丰.硝酸盐和亚硝酸盐的毒理学效应及检测技术研究进展[J]..生物学教学，2013，38（12）：4-6.
[4] 张旭，张瑾，毕诗秀.光电比色在“泡菜亚硝酸盐含量测定”中应用[J]..生物学教学，2013，38（8）：34-35.
[5] 杜伟，孙存华.752型分光光度计定量测定泡菜亚硝酸盐含量[J]..教学仪器与实验，2010，26（1）：38-39.
[6] 肖安庆，吴宇.贮藏条件和时间对蔬菜中亚硝酸盐含量的影响[J]..中学生物学，2011，27（9）：37-40.
关键词 泡菜 亚硝酸盐 分光光度计
中图分类号 Q-33 文献标志码 B
1 引言
发展学生的核心素养被置于课程改革的基础地位，其中培养学生的科学探究能力是重要的组成部分。“制作泡菜并检测亚硝酸盐含量”是人教版高中生物教材《选修1·生物技术实践》中的一个实验，该实验与现实生活紧密相连，具有很强的实践性。学生通过主动参与科学探索过程，在实践中加深对知识的理解，掌握科学方法，学会科学地认识世界。生物学科的发展和进步离不开其他学科，尤其是数学、物理、化学、信息学及技术，因此学科素养融合对于发展学生的核心素养至关重要。教师要充分挖掘有理科共性的思维和方法，把相关的学科素养融合起来，汇成个体的核心素养。而该实验很好地融合了其他理科学科，尤其是运用到了化学的一些定量分析方法，例如样品的前处理、移液管的使用等，把生物和化学相关的知识融合起来，更好地促进学生核心素养的发展。
蔬菜容易富集硝酸盐，若在其生长过程中大量使用了氮肥，则所含硝酸盐的含量就会更高。硝酸盐本身对人体无害或毒害性相对较低，然而人体摄入的硝酸盐可在细菌的作用下还原成亚硝酸盐，亚硝酸盐可导致高铁血红蛋白症。当人体摄入的亚硝酸盐总量达到0.3～0.5 g时，会引起中毒；当摄入总量达到3 g时，会引起死亡。另一方面，亚硝酸盐可在一定的条件下形成亚硝胺，从而诱发消化系统癌变，对人体健康构成了潜在的威胁。故需要检测蔬菜及蔬菜制品中亚硝酸盐的含量。
廖德丰对硝酸盐和亚硝酸盐的毒理学效应及检测技术研究进展进行了梳理，主要针对水体亚硝酸盐和硝酸盐污染对水生生物及人体的毒理学效应进行阐述，并罗列了检测硝酸盐和亚硝酸盐的新方法，对中学教师深入认识该实验有很大的帮助。尽管此实验为定量检测实验，但教材中采用的是误差较大的目视比色法，故有人采用分光光度计进行精确测定，让学生体会现代实验设备在生物学课堂中的应用。肖安庆等研究了贮藏条件和时间对蔬菜中亚硝酸盐含量的影响。下面着重从化学的视角来对该实验进行深入分析，利用精密分析仪器——分光光度计进行实验探究，探讨存在的问题并提出解决方案。
2 实验原理
在弱酸性条件下，亚硝酸盐与对氨基苯磺酸溶液发生重氮反应后，与萘乙二胺盐酸偶联形成紫红色的偶氮染料（图1），将显色后的样品与已知浓度的标准显色液进行比较，可以采用目视比色法和光电比色法。
3 实验部分
3.1 仪器与试剂
主要仪器：容量瓶，移液管，漏斗，50 mL比色管，723型分光光度计，电子分析天平，搅拌机，离心机，pH计。
试剂：亚铁氰化钾溶液（106 g/L）；乙酸锌溶液（220 g/L）；饱和硼砂溶液（50 g/L）：对氨基苯磺酸溶液（4 g/L）；N-1-萘基乙二胺盐酸盐溶液（2 g/L）；亚硝酸钠标准溶液（200 μg /mL）；亚硝酸钠标准使用液（5.0 μg/mL）；氢氧化铝乳液；氢氧化钠溶液（2.5 mol/L）。本方法所用试剂均为分析纯，水为去离子水。
泡菜的制作：将白菜洗净，切成小块，晾晒过夜，放入泡菜坛中，加入煮沸并冷却的食盐水，浸没蔬菜，密封发酵，3 d后取用。
提取剂：50 g氯化镉与50 g氯化钡，溶解于1 000 mL蒸馏水中，用浓盐酸调节pH至1。
3.2 实验步骤
3.2.1 操作过程
称取5 g试样，在研钵中研磨成匀浆，加12.5 mL饱和硼砂溶液，搅拌均匀，以300 mL 70 ℃左右的水将试样洗入500 mL容量瓶中，于沸水浴中加热15 min，取出置冷水浴中冷却，并放置至室温。
振荡上述提取液时，加入5 mL 亚铁氰化钾溶液，摇匀，再加入5 mL 乙酸锌溶液，以沉淀蛋白质。加水至刻度，摇匀，放置30 min，上清液用滤纸过滤，弃去初滤液30 mL，滤液备用。
吸取40 mL上述滤液于50 mL带塞比色管中，另吸取0.00、0.20、0.40、0.60、0.80、1.0、1.5 mL亚硝酸钠标准使用液（相当于0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、7.5 μg亚硝酸钠），分别置于50 mL带塞比色管中。于标准管与试样管中分别加入2.0 mL对氨基苯磺酸溶液，混匀。静置3～5 min 后，各加入1.0 mL盐酸萘乙二胺溶液，加水至刻度，混匀，静置3 min后，用1 cm比色皿，以零管调节零点，于波长538 nm处测吸光度，绘制标准曲线，同时做试剂空白。
3.2.2 结果计算
用下式进行计算亚硝酸盐（以亚硝酸钠计）的含量：
X1=■
式中：
X1——试样中亚硝酸钠的含量，单位为毫克每千克（mg/kg）；
A1——测定用样液中亚硝酸钠的质量，单位为微克（μg）；
m——試样质量，单位为克（g）；
V1——测定用样液体积，单位为毫升（mL）；
V0——试样处理液总体积，单位为毫升（mL）。
4 结果与讨论
4.1 高中生物教材中“制作泡菜并检测亚硝酸盐含量”解析
在对高中生物教材中“制作泡菜并检测亚硝酸盐含量”的亚硝酸盐含量测定方法实验过程中，发现了如下问题：
（1） 溶液配制：亚硝酸盐标准液配制采用的是硅胶干燥器中干燥24 h的亚硝酸钠，以硅胶干燥剂进行吸湿干燥，但是亚硝酸盐含水量不大，放置于硅胶干燥器中24 h干燥效果并不明显。此外，亚硝酸盐只有在320℃以上才会发生分解，所以完全可以在烘箱中用110℃烘干到恒重后，再进行称量和溶液配制，最终配制好的溶液的浓度才会更精确。 （2） 样品前处理：教材中关于样品处理液的制备方法存在较多问题，见表1。
综上所述，高中生物教材中“制作泡菜并检测亚硝酸盐含量”这一实验存在较多问题。在高中阶段就应该让学生形成定量的概念，培养其严谨的科学精神，故而参考国标中检测亚硝酸盐的方法对这个实验进行改进，具体操作方法如3.2所示。
4.2 标准曲线绘制
以亚硝酸盐质量（x）为横坐标，对应的吸光度（y）为纵坐标，绘制出标准曲线，计算曲线斜率，得出二者的关系式为：y=0.1565x，相关系数R2=0.9995，线性关系良好（图2）。
4.3 络合物加入时间及显色时间的确定
取0.5 mL浓度为5.0 μg/mL的亚硝酸钠标准溶液，置于50 mL的比色管中，接着按以下四种方案进行实验：① 同时加入2 mL的对氨基苯磺酸溶液和1 mL 的萘乙二胺盐酸溶液；② 先加入2 mL的对氨基苯磺酸溶液，3 min后加入1 mL 的萘乙二胺盐酸；③ 先加入2 mL的对氨基苯磺酸溶液，5 min后加入1 mL 的萘乙二胺盐酸；④ 先加入2 mL的对氨基苯磺酸溶液，7 min后加入1 mL 的萘乙二胺盐酸。之后加水至刻度，混匀，分别取静置2、5、10、15、20、 30、60、120、180 min 后的溶液，以试剂空白作参比，在538 nm测得吸光度值，如图3所示。同时加入对氨基苯磺酸溶液和萘乙二胺盐酸整体发光值较低，络合物在显色反应3 min时发光值已趋于稳定，且显色液在几个小时内相对稳定。故选择先加入2 mL的对氨基苯磺酸溶液，3 min后再加入1 mL 的萘乙二胺盐酸，定容后显色反应3 min后进行测定。
4.4 活性炭脫色实验
参考国标的方法进行测定，在样品前处理时发现，当选用样品颜色较深时，处理过后的溶液依然存在较深的颜色，影响结果测定。活性炭能较好地吸附植物中的色素，故选择用活性炭对最后的样品液进行脱色处理，可以有效地消除测定时产生的误差，并对加入活性炭之后的实验进行回收率测定。称取4份5 g样品，分别加入0、1、3、5 mL的5.25 μg/mL 亚硝酸钠标准溶液，按照3.2进行处理，只是在沸水浴后分别加入2 g活性炭继续加热2 min，其余步骤同3.2。最后测定吸光度，结果见表2，加入活性炭进行脱色的回收率在87.9%～94.6%之间，证明该方法具有较高的回收率。
4.5 小结
通过在实际操作发现高中生物教材中“制作泡菜并检测亚硝酸盐含量”实验中存在的一些问题，故而参考国标的方法对这个实验进行改进。通过紫外分光光度计对实验结果进行精密测量，建立标准曲线，考查了反应溶液的稳定性，希望能让广大中学教师对此实验的原理、样品的前处理、实验的操作、实验结果的处理等方面能有更深入的认识，从而更好地应用到实验教学中。
参考文献：
[1] 朱正威，孙万儒，赵占良.生物1·生物技术实践（选修）[M].北京：人民教育出版社，2007：9-10.
[2] 刘杏认，任建强，甄兰.蔬菜硝酸盐累积及其影响因素的研究[J].土壤通报，2003，34（4）：354-361.
[3] 廖德丰.硝酸盐和亚硝酸盐的毒理学效应及检测技术研究进展[J]..生物学教学，2013，38（12）：4-6.
[4] 张旭，张瑾，毕诗秀.光电比色在“泡菜亚硝酸盐含量测定”中应用[J]..生物学教学，2013，38（8）：34-35.
[5] 杜伟，孙存华.752型分光光度计定量测定泡菜亚硝酸盐含量[J]..教学仪器与实验，2010，26（1）：38-39.
[6] 肖安庆，吴宇.贮藏条件和时间对蔬菜中亚硝酸盐含量的影响[J]..中学生物学，2011，27（9）：37-40.