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[摘要]目的：探讨VEGF对血管及软组织长入多孔聚乙烯支架的影响。方法：制作多孔聚乙烯支架置入动物体内的模型后，随机分成2组：第一组应用VEGF；第二组为对照组（不给任何药物）。术后第7天、第14天取出支架，做组织学分析观察毛细血管及肉芽组织长入状况。结果：应用VEGF组血管及肉芽组织长入孔隙迅速，而对照组长入缓慢，有显著性差异。结论：血管内皮生长因子可促进血管及软组织长入多孔聚乙烯支架，从而加强了该支架的稳定性，促进植入效果。
[关键词]耳支架；血管内皮生长因子（VEGF）；耳再造
[中图分类号]Q813[文献标识码]A[文章编号]1008-6455（2008）08-1178-03
The effects of VEGF on blood vessels and soft tissues growing into the porous polyethylene pivoting helix framework
TIAN Li-liang1,DIAO Zhi-yong2
（1.Department of Plastic And Cosmetic Surgery, the Fifth Affiliated Hospital of harbin Medical University, Daqing 164300,Heilongjiang,China; 2. Department of Plastic and Cosmetic Surgery,the Fifth Affiliated Hospital of harbin Medical University,Harbin 150001,Heilongjiang，China）
Abstract： ObjectiveTo observe the effects of VEGF on blood vessels and soft tissues growing into the porous polyethylene pivoting helix framework.MethodsPorous polyethylene pivoting helix frameworks were implanted into the rabbits' bodies. The rabbits were randomly divided into two groups, VEGF group and the control group. The control groups were given nothing. The frameworks were taken out to observe the growth of blood vessels and soft tissues.ResultsThe results showed that blood vessels and granulation tissue grew into the pores rapidly in the VEGF group. However, blood vessels and granulation tissue grew into the pores of the control groups slowly. There was significant difference between the experimental groups and the control groups.ConclusionOur results suggest vascular endothelial growth factor promoted blood vessels and soft tissues growing into porous polyethylene pivoting helix framework. Thereby, VEGF was able to improve the effect of porous Polyethylene pivoting helix framework after it was implanted.
Key words：ear framework；vascular endothelial growth factor（VEGF）
耳廓再造所选用的耳支架，以往多使用自体肋软骨雕刻而成，其优点是无排异反应，但手术对胸壁有创伤，取材受到一定限制，而将肋软骨雕刻成立体感强的耳廓支架亦有一定难度[1]。而应用异体肋软骨支架容易被吸收及变形[2-3]。硅橡胶支架及硅胶管钢丝支架则有很高的排异外露率[4]。我科自从1997年利用多孔聚乙烯（porous polyethylene）制成的支架行耳再造12例，其中9例效果满意，再造耳廓立体感强，手术时间短，患者痛苦小。其中3例出现支架部分外露，2例经换药后自行愈合，1例支架取出后愈合。所以，尚需用一种增进其稳定性的物质来提高手术的成功率。
多孔聚乙烯耳支架含有直径100μm的微孔，血管和软组织可向其中长入，使支架具有抗感染能力和不易被排出。血管长入后，伴随胶原的沉积可使耳廓的柔韧性不断增强[2]。
血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）是一种可溶性糖蛋白，有四种异构体，一般情况下VEGF165为最主要的异构体，天然的VEGF即表现出VEGF165的主要特性[3]。VEGF具有促血管内皮细胞分裂、增生和提高血管通透性的作用，在生理和病理性血管新生过程中起着关键性作用[4]。
本研究观察了VEGF对多孔聚乙烯支架血管及软组织长入其孔隙的影响，即对其组织相容性的影响。目的在于促进多孔聚乙烯耳支架植入的效果，提高该支架行耳再造术的成功率。
1材料和方法
1.1 动物模型制备：选取健康新西兰大耳白兔40只，雌雄不限，体重2.5～3.0kg，40只兔子均经下列处理：
1.1.1 用30%戊巴比妥钠右耳静脉注射麻醉（30mg/kg）。
1.1.2 麻醉平稳后，将动物俯卧位固定，左侧耳部用碱性油膏脱毛。
1.1.3 术区用10%聚乙烯醛酪烷酮碘消毒，铺无菌手术巾。
1.1.4 在无菌条件下于左侧耳中部做长约1cm纵行切口，切开皮肤皮下至耳软骨表面剥离形成大小约2cm×2cm潜在间隙，在此间隙中去除大小1cm×1cm耳廓软骨，将长1cm,宽1cm，厚0.4cm的多孔聚乙烯材料嵌入去除软骨部位，用1号线与周围软骨固定。在切口下方（靠头颅侧） 3cm做长3mm切口，从该口置入直径2mm引流管，经皮下至植入材料的右外侧，缝合皮肤，固定引流管，经引流管给予0.02～0.04kPa负压吸引，使皮肤与支架紧密贴附，3天后拔除引流管。
1.2 分组
1.2.1 应用外源VEGF组：从已在耳部置入多孔聚乙烯材料的40只兔子中随机抽取20只，在右耳静脉放置留置针，由留置针推注VEGF，一日两次，每次100mg，共2周。
1.2.2 对照组：已在耳部置入多孔聚乙烯材料的剩余20只不给予任何药物，作为对照组。
1.3 采集标本
1.3.1 术后第7天分别从2组中随机抽取10只兔子，用3%戊巴比妥钠耳静脉注射麻醉（30mg/kg），常规脱毛消毒，在无菌条件下，取出置入的支架，用10%甲醛固定常规石蜡包埋切片。
1.3.2 术后第14天，2组中剩余的10只兔子，用同样方法取出材料，用10%甲醛固定常规石蜡包埋切片。
1.4 免疫组化分析
1.4.1 将切好的石蜡组织切片用APES粘贴，脱蜡至水。
1.4.2 用蒸馏水配制的体积分数3%的H2O2室温浸泡5min。以灭活内源酶，微波修复抗原后用SABC法染色。
1.4.3 加入SABC，37℃反应20min，PBS洗两次，以DAB显色，苏本素轻度复染后，脱水、透明、封片、显微镜下观察分析。
1.5 肉芽组织血管面积和肉芽组织长入深度的分析
1.5.1 肉芽组织中血管面积的测量：分别对应用外源VEGF组及对照组在第7天和第14天随机抽取10只兔子中的5个蜡块横切制成切片，HE染色后，用北航图形分析系统作肉芽组织血管面积分析。方法是在每张切片上随机抽取5个400倍显微镜视野进行分析，计算这5个视野中血管断面面积占镜下肉芽组织面积的比值。
1.5.2 肉芽组织长入深度测量：再分别对两组在第7天和第14天抽取的10只兔子中的剩余的5个蜡块，每个蜡块分别各纵切5份，在40倍显微镜下测定肉芽组织深度，方法是用肉芽组织的面积除以宽度，得到长入深度，再算出每组长入深度的平均值。
2结果
2.1 免疫组化结果：术后第7天给予外源VEGF的肉芽组织血管内皮细胞的胞浆呈褐色为阳性（图1），而对照组无明显变化。术后第14天应用外源VEGF组血管内皮细胞的胞浆仍呈褐色（图2）说明VEGF对其仍有作用，而对照组亦无明显变化。
2.2 血管断面面积占镜下肉芽组织面积的比值见表1、2，两组术后肉芽组织长入深度的比较见表3、4。
3讨论
多孔聚乙烯在临床上初期多用于头面部骨缺损的修复。1993年wellisz[6]报道了应用多孔聚乙烯耳支架行烧伤后耳再造。该支架置入后，血管和软组织可经其直径100μm的微孔长入支架，从而提高其抗感染作用和增强其柔韧性，因软组织长入也不会发生像硅橡胶等支架在纤维包囊内活动和包膜挛缩引起支架的变形。我科从1997年～2007年底用该材料耳支架行耳再造12例（8人12耳），其中9例效果满意，再造耳廓立体感强，手术时间短，患者痛苦小。有3例出现支架部分外露，2例经换药后自行愈合，1例取出支架后愈合。该支架的优点[5,7-8]：①再造耳廓形态满意，三角窝、舟状窝等细微结构清晰；②减少创伤，免除患者切取肋软骨之苦，及气胸等并发症发生的可能性；③减少手术步骤，缩短手术时间，降低手术难度；④与硅橡胶支架相比，除排斥反应轻外，不会有耳支架在纤维包膜内活动，甚至包膜内积液现象；⑤较之自体或异体软骨支架，该支架更为稳定，但随血管的长入及胶原的沉积可增强其柔韧性。所以提高其成功率及柔韧性的关键是促进血管和软组织的长入。但也有缺点[5,7-8]：①耳支架较硬，其柔韧性的变化仍需进一步研究；②一旦皮肤破溃取出的可能性仍大。
血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）是一种具有促进血管新生作用也能增强血管通透性的糖蛋白，另一方面VEGF使微血管通透性增强，大分子物质，如纤维蛋白原等细胞外基质形成纤维蛋白凝胶，从而作为暂时基质允许和支持新生血管和内皮细胞的内生生长[6]VEGF与碱性成纤维细胞生长因子有协同作用。另外缺氧可刺激VEGF及其受体的表达[7]促进内皮细胞的生长。
本实验设计考虑到VEGF的半衰期短的缺点增加了给药次数，使其能对多孔聚乙烯支架周围组织持续作用。另外，将多孔聚乙烯支架埋置皮下封闭切口，造成局部缺氧环境来增强VEGF及其受体的表达。
在本实验中，多孔聚乙烯耳支架被埋置于去除部分耳廓软骨的位置，来替代正常耳廓软骨，使其成为真正意义的耳支架。而且术后给于负压吸引法塑型，使皮肤与支架紧密贴附，模拟耳廓再造的基本过程。
通过外源VEGF组、对照组之间术后第7天和术后第14天肉芽组织中毛细血管计数和长入深度观察，发现：①外源VEGF组肉芽组织中毛细胞管计数比对照组术后第7天的多45%左右，第14天约多52%左右；②外源VEGF组肉芽组织长入多孔聚乙烯支架的深度比对照组术后的第7天约多33%，第14天约多39%。而经统计学分析证明VEGF组与对照组有显著性差异。这说明VEGF明显促进血管及软组织长入多孔聚乙烯支架，而缺乏VEGF时血管及软组织长入多孔聚乙烯支架速度明显减慢。
免疫组化结果显示，血管内皮细胞在术后第7天和14天在应用外源VEGF组细胞浆均成褐色，说明VEGF均对其有作用。
以上结果表明：VEGF有明显促进血管及软组织长入多孔聚乙烯支架作用，使其与周围组织形成一体，从而提高其抗感染能力及其柔韧性，相应促进多孔聚乙烯耳支架植入的效果，并防止纤维包裹挛缩及防止耳廓支架的变形，从而使应用多孔聚乙烯耳支架行耳廓再造术的成功率提高。这为VEGF临床应用于多孔聚乙烯耳支架来促进多孔聚乙烯耳支架植入的效果提供了理论依据。有关VEGF应用于多聚乙烯耳支架来促进多孔聚乙烯耳支架植入的效果的临床应用尚有待于进一步探讨。
[参考文献]
[1]Tanzer KC. Nicaotia long follow-up of 44 reconstructed auricles[J], Plast Reconstr Surg, 1978,61:161-164.
[2]刘晓亮.在应用皮肤扩张术行耳廓再造中软骨支架塑造的改良[J]. 实用美容整形外科杂志，1997.8(2):97-98.
[3]潘 宁.三种耳廓支架材料再造耳[J].中国修复重建外科杂志,1997,11(2):208-209.
[4]李 万.扩张皮肤全耳廓再造术的挤压塑形的心得体会[J].实用美容整形外科杂志, 1996,9(2):74-75.
[5]陶宏炜，宣庆元. Medpor耳支架置入I期耳再造[J].中国美容医学,2002,11(6):589-590.
[6]Ferra N, Dvis-Smyth T. The biology of vascular endothelial growth factor[J]. Endocr Res,1997,183:4-25.
[7]刘 蓉,陈 兵,吴景泉,等. 应用去毛囊的头皮瓣修复Medpor支架外露[J].中国美容医学,2006,15(10):1156-1157.
[8]邝 勇,王 标,李 江. 枕动脉岛状筋膜瓣修复再造耳支架外露[J].中国美容医学,2002,11(4):333-334.
[收稿日期]2008-05-12[修回日期]2008-08-01
编辑/张惠娟
[关键词]耳支架；血管内皮生长因子（VEGF）；耳再造
[中图分类号]Q813[文献标识码]A[文章编号]1008-6455（2008）08-1178-03
The effects of VEGF on blood vessels and soft tissues growing into the porous polyethylene pivoting helix framework
TIAN Li-liang1,DIAO Zhi-yong2
（1.Department of Plastic And Cosmetic Surgery, the Fifth Affiliated Hospital of harbin Medical University, Daqing 164300,Heilongjiang,China; 2. Department of Plastic and Cosmetic Surgery,the Fifth Affiliated Hospital of harbin Medical University,Harbin 150001,Heilongjiang，China）
Abstract： ObjectiveTo observe the effects of VEGF on blood vessels and soft tissues growing into the porous polyethylene pivoting helix framework.MethodsPorous polyethylene pivoting helix frameworks were implanted into the rabbits' bodies. The rabbits were randomly divided into two groups, VEGF group and the control group. The control groups were given nothing. The frameworks were taken out to observe the growth of blood vessels and soft tissues.ResultsThe results showed that blood vessels and granulation tissue grew into the pores rapidly in the VEGF group. However, blood vessels and granulation tissue grew into the pores of the control groups slowly. There was significant difference between the experimental groups and the control groups.ConclusionOur results suggest vascular endothelial growth factor promoted blood vessels and soft tissues growing into porous polyethylene pivoting helix framework. Thereby, VEGF was able to improve the effect of porous Polyethylene pivoting helix framework after it was implanted.
Key words：ear framework；vascular endothelial growth factor（VEGF）
耳廓再造所选用的耳支架，以往多使用自体肋软骨雕刻而成，其优点是无排异反应，但手术对胸壁有创伤，取材受到一定限制，而将肋软骨雕刻成立体感强的耳廓支架亦有一定难度[1]。而应用异体肋软骨支架容易被吸收及变形[2-3]。硅橡胶支架及硅胶管钢丝支架则有很高的排异外露率[4]。我科自从1997年利用多孔聚乙烯（porous polyethylene）制成的支架行耳再造12例，其中9例效果满意，再造耳廓立体感强，手术时间短，患者痛苦小。其中3例出现支架部分外露，2例经换药后自行愈合，1例支架取出后愈合。所以，尚需用一种增进其稳定性的物质来提高手术的成功率。
多孔聚乙烯耳支架含有直径100μm的微孔，血管和软组织可向其中长入，使支架具有抗感染能力和不易被排出。血管长入后，伴随胶原的沉积可使耳廓的柔韧性不断增强[2]。
血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）是一种可溶性糖蛋白，有四种异构体，一般情况下VEGF165为最主要的异构体，天然的VEGF即表现出VEGF165的主要特性[3]。VEGF具有促血管内皮细胞分裂、增生和提高血管通透性的作用，在生理和病理性血管新生过程中起着关键性作用[4]。
本研究观察了VEGF对多孔聚乙烯支架血管及软组织长入其孔隙的影响，即对其组织相容性的影响。目的在于促进多孔聚乙烯耳支架植入的效果，提高该支架行耳再造术的成功率。
1材料和方法
1.1 动物模型制备：选取健康新西兰大耳白兔40只，雌雄不限，体重2.5～3.0kg，40只兔子均经下列处理：
1.1.1 用30%戊巴比妥钠右耳静脉注射麻醉（30mg/kg）。
1.1.2 麻醉平稳后，将动物俯卧位固定，左侧耳部用碱性油膏脱毛。
1.1.3 术区用10%聚乙烯醛酪烷酮碘消毒，铺无菌手术巾。
1.1.4 在无菌条件下于左侧耳中部做长约1cm纵行切口，切开皮肤皮下至耳软骨表面剥离形成大小约2cm×2cm潜在间隙，在此间隙中去除大小1cm×1cm耳廓软骨，将长1cm,宽1cm，厚0.4cm的多孔聚乙烯材料嵌入去除软骨部位，用1号线与周围软骨固定。在切口下方（靠头颅侧） 3cm做长3mm切口，从该口置入直径2mm引流管，经皮下至植入材料的右外侧，缝合皮肤，固定引流管，经引流管给予0.02～0.04kPa负压吸引，使皮肤与支架紧密贴附，3天后拔除引流管。
1.2 分组
1.2.1 应用外源VEGF组：从已在耳部置入多孔聚乙烯材料的40只兔子中随机抽取20只，在右耳静脉放置留置针，由留置针推注VEGF，一日两次，每次100mg，共2周。
1.2.2 对照组：已在耳部置入多孔聚乙烯材料的剩余20只不给予任何药物，作为对照组。
1.3 采集标本
1.3.1 术后第7天分别从2组中随机抽取10只兔子，用3%戊巴比妥钠耳静脉注射麻醉（30mg/kg），常规脱毛消毒，在无菌条件下，取出置入的支架，用10%甲醛固定常规石蜡包埋切片。
1.3.2 术后第14天，2组中剩余的10只兔子，用同样方法取出材料，用10%甲醛固定常规石蜡包埋切片。
1.4 免疫组化分析
1.4.1 将切好的石蜡组织切片用APES粘贴，脱蜡至水。
1.4.2 用蒸馏水配制的体积分数3%的H2O2室温浸泡5min。以灭活内源酶，微波修复抗原后用SABC法染色。
1.4.3 加入SABC，37℃反应20min，PBS洗两次，以DAB显色，苏本素轻度复染后，脱水、透明、封片、显微镜下观察分析。
1.5 肉芽组织血管面积和肉芽组织长入深度的分析
1.5.1 肉芽组织中血管面积的测量：分别对应用外源VEGF组及对照组在第7天和第14天随机抽取10只兔子中的5个蜡块横切制成切片，HE染色后，用北航图形分析系统作肉芽组织血管面积分析。方法是在每张切片上随机抽取5个400倍显微镜视野进行分析，计算这5个视野中血管断面面积占镜下肉芽组织面积的比值。
1.5.2 肉芽组织长入深度测量：再分别对两组在第7天和第14天抽取的10只兔子中的剩余的5个蜡块，每个蜡块分别各纵切5份，在40倍显微镜下测定肉芽组织深度，方法是用肉芽组织的面积除以宽度，得到长入深度，再算出每组长入深度的平均值。
2结果
2.1 免疫组化结果：术后第7天给予外源VEGF的肉芽组织血管内皮细胞的胞浆呈褐色为阳性（图1），而对照组无明显变化。术后第14天应用外源VEGF组血管内皮细胞的胞浆仍呈褐色（图2）说明VEGF对其仍有作用，而对照组亦无明显变化。
2.2 血管断面面积占镜下肉芽组织面积的比值见表1、2，两组术后肉芽组织长入深度的比较见表3、4。
3讨论
多孔聚乙烯在临床上初期多用于头面部骨缺损的修复。1993年wellisz[6]报道了应用多孔聚乙烯耳支架行烧伤后耳再造。该支架置入后，血管和软组织可经其直径100μm的微孔长入支架，从而提高其抗感染作用和增强其柔韧性，因软组织长入也不会发生像硅橡胶等支架在纤维包囊内活动和包膜挛缩引起支架的变形。我科从1997年～2007年底用该材料耳支架行耳再造12例（8人12耳），其中9例效果满意，再造耳廓立体感强，手术时间短，患者痛苦小。有3例出现支架部分外露，2例经换药后自行愈合，1例取出支架后愈合。该支架的优点[5,7-8]：①再造耳廓形态满意，三角窝、舟状窝等细微结构清晰；②减少创伤，免除患者切取肋软骨之苦，及气胸等并发症发生的可能性；③减少手术步骤，缩短手术时间，降低手术难度；④与硅橡胶支架相比，除排斥反应轻外，不会有耳支架在纤维包膜内活动，甚至包膜内积液现象；⑤较之自体或异体软骨支架，该支架更为稳定，但随血管的长入及胶原的沉积可增强其柔韧性。所以提高其成功率及柔韧性的关键是促进血管和软组织的长入。但也有缺点[5,7-8]：①耳支架较硬，其柔韧性的变化仍需进一步研究；②一旦皮肤破溃取出的可能性仍大。
血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）是一种具有促进血管新生作用也能增强血管通透性的糖蛋白，另一方面VEGF使微血管通透性增强，大分子物质，如纤维蛋白原等细胞外基质形成纤维蛋白凝胶，从而作为暂时基质允许和支持新生血管和内皮细胞的内生生长[6]VEGF与碱性成纤维细胞生长因子有协同作用。另外缺氧可刺激VEGF及其受体的表达[7]促进内皮细胞的生长。
本实验设计考虑到VEGF的半衰期短的缺点增加了给药次数，使其能对多孔聚乙烯支架周围组织持续作用。另外，将多孔聚乙烯支架埋置皮下封闭切口，造成局部缺氧环境来增强VEGF及其受体的表达。
在本实验中，多孔聚乙烯耳支架被埋置于去除部分耳廓软骨的位置，来替代正常耳廓软骨，使其成为真正意义的耳支架。而且术后给于负压吸引法塑型，使皮肤与支架紧密贴附，模拟耳廓再造的基本过程。
通过外源VEGF组、对照组之间术后第7天和术后第14天肉芽组织中毛细血管计数和长入深度观察，发现：①外源VEGF组肉芽组织中毛细胞管计数比对照组术后第7天的多45%左右，第14天约多52%左右；②外源VEGF组肉芽组织长入多孔聚乙烯支架的深度比对照组术后的第7天约多33%，第14天约多39%。而经统计学分析证明VEGF组与对照组有显著性差异。这说明VEGF明显促进血管及软组织长入多孔聚乙烯支架，而缺乏VEGF时血管及软组织长入多孔聚乙烯支架速度明显减慢。
免疫组化结果显示，血管内皮细胞在术后第7天和14天在应用外源VEGF组细胞浆均成褐色，说明VEGF均对其有作用。
以上结果表明：VEGF有明显促进血管及软组织长入多孔聚乙烯支架作用，使其与周围组织形成一体，从而提高其抗感染能力及其柔韧性，相应促进多孔聚乙烯耳支架植入的效果，并防止纤维包裹挛缩及防止耳廓支架的变形，从而使应用多孔聚乙烯耳支架行耳廓再造术的成功率提高。这为VEGF临床应用于多孔聚乙烯耳支架来促进多孔聚乙烯耳支架植入的效果提供了理论依据。有关VEGF应用于多聚乙烯耳支架来促进多孔聚乙烯耳支架植入的效果的临床应用尚有待于进一步探讨。
[参考文献]
[1]Tanzer KC. Nicaotia long follow-up of 44 reconstructed auricles[J], Plast Reconstr Surg, 1978,61:161-164.
[2]刘晓亮.在应用皮肤扩张术行耳廓再造中软骨支架塑造的改良[J]. 实用美容整形外科杂志，1997.8(2):97-98.
[3]潘 宁.三种耳廓支架材料再造耳[J].中国修复重建外科杂志,1997,11(2):208-209.
[4]李 万.扩张皮肤全耳廓再造术的挤压塑形的心得体会[J].实用美容整形外科杂志, 1996,9(2):74-75.
[5]陶宏炜，宣庆元. Medpor耳支架置入I期耳再造[J].中国美容医学,2002,11(6):589-590.
[6]Ferra N, Dvis-Smyth T. The biology of vascular endothelial growth factor[J]. Endocr Res,1997,183:4-25.
[7]刘 蓉,陈 兵,吴景泉,等. 应用去毛囊的头皮瓣修复Medpor支架外露[J].中国美容医学,2006,15(10):1156-1157.
[8]邝 勇,王 标,李 江. 枕动脉岛状筋膜瓣修复再造耳支架外露[J].中国美容医学,2002,11(4):333-334.
[收稿日期]2008-05-12[修回日期]2008-08-01
编辑/张惠娟