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摘 要：建立了肉灌肠中罗丹明B、诱惑红、苏丹红Ⅰ、苏丹红Ⅱ、苏丹红Ⅲ、苏丹红Ⅳ、胭脂红、苋菜红8种易添加的红色色素残留量的液相色谱-串联质谱分析方法。样品用乙腈稀释提取，以水和乙腈为流动相进行梯度洗脱。质谱采用电喷雾正离子（ESI）模式电离，多反应监测（MRM）模式检测。该方法回收率在81.2%～108.9%之间。相对标准偏差（RSD）在4.2%～13.2%之间。表明该方法准确度高，RSD变异较小，结果准确可靠。
关键词：液质联用；肉灌肠；色素；超声波提取
中图分类号：O657.63 文献标志码：A 文章编号：1001-8123（2013）06-0019-03
为降低食品生产成本、并赋予食品诱人的外观、稳定色泽，一些不法生产厂家在食品生产加工过程中违法使用非食用色素或超范围添加色素。近年来，工业染料和超范围添加色素在食品中的非法使用问题频繁发生，如在渔业中添加孔雀石绿；在辣椒粉或辣椒酱中使用苏丹红、对位红、玫瑰红等；在豆干、腐竹、腐皮中使用碱性橙、碱性嫩黄和酸性金黄等；在卤制熟食和软包装肉制品中使用苏丹红和诱惑红等食品安全事件。为此，卫生部印发了“食品中可能违法添加的非食用物质名单”通知，列出了数种非食用色素，可见加强对食品中非食用色素的检测十分必要[1-5]。
目前，检测食品中非法添加色素染料的方法很多，包括免疫法、毛细管电泳法、电化学分析法、薄层色谱法、高效液相色谱法、气相色谱-质谱联用法和液相色谱-质谱联用法[6-18]。其中常用的方法是高效液相色谱法和液相色谱-质谱联用方法。对于建立多组分的快速预警检测方法，要求其灵敏度高、选择性好并能够对化合物进行确认，而液相色谱-串联质谱法具备了上述特点。本研究建立了同时检测肉灌肠中非法添加罗丹明B、苏丹红Ⅰ、苏丹红Ⅱ、苏丹红Ⅲ、苏丹红Ⅳ以及易超量超范围添加胭脂红、苋菜红、诱惑红的液相色谱-质谱联用方法。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
罗丹明B、苏丹红Ⅰ、苏丹红Ⅱ、苏丹红Ⅲ、苏丹红Ⅳ、胭脂红、苋菜红、诱惑红 德国Dr.Ehrenstorfer GmbH公司；甲醇、乙腈、乙醇、丙酮均为色谱纯 赛默飞世尔科技有限公司；氯化钠为分析纯 天津科密欧化学试剂有限公司；肉灌肠 市购。
1.2 仪器与设备
8030高效液相色谱-质谱联用仪 日本岛津公司；Diamonsil C18色谱柱（250mm×4.6mm，5μm） 北京迪马科技有限公司；Milli-Q密理博超纯制水机 德国默克密理博公司；M37610-33涡旋混合器 赛默飞世尔科技有限公司；BK-80A超声波振荡器 济南巴克超声波科技有限公司；TGL21M高速离心机 长沙湘智离心机仪器有限公司。
1.3 方法
1.3.1 色谱条件
流动相流速0.3mL/min，进样量：5μL，柱温：40℃，梯度：12min内5%～100%乙腈，保持2min，1min内回到初始流动相条件，保持3min至下一次进样。离子源：电喷雾正离子（ESI）模式；毛细管电压：3.2kV；离子源温度：100℃；脱溶剂气温度：350℃；脱溶剂气流量：540L/h。
1.3.2 标准溶液配制
准确称取一定量的标准物质，用乙腈稀释制成10mg/L标准溶液，于4℃条件下保存。
1.3.3 样品前处理
将样品放入绞肉机绞碎，准确称取混合均匀试样约2g（精确到0.01g）于具塞磨口玻璃试管中，加乙腈10mL，涡旋混合2min，超声萃取20min，离心取上清液，再加10mL乙腈萃取，合并2次提取液，加入2.5mL水和0.5g氯化钠，用乙腈定容至25mL，离心，上清液经0.2μm滤膜过滤，待LC-MS/MS测定。
1.3.4 色素提取率计算公式
提取率/% =×100
式中：C为提取液中色素质量浓度/（μg/mL），V为提取液体积mL，m为试样质量/g。
1.3.5 提取方式的比较
比较了3种提取方式：振荡提取、热水浴提取法、超声波提取。振荡提取的条件：准确称取2.00g样品放入玻璃试管中，加入10mL乙腈，振荡混合2min；热水浴提取条件：准确称取2.00g样品放入玻璃管中，加入10mL乙腈，在80℃的水浴中浸提30min；超声波提取条件：准确称取2.00g样品放入玻璃管中，加入10mL乙腈，在超声波提取仪中提取20min。通过比较色素提取率确定提取方式。每种提取方式进行4次平行实验，取平均值进行比较。
2 结果与分析
2.1 提取溶剂的选择
本实验比较了几种溶剂对色素提取率的影响，水对苏丹红的提取率最低，有机溶剂的色素提取率均在70%以上，脂肪在甲醇、乙醇和丙酮中的溶解率较大，提取液杂质较多，不利于实验分析，而脂肪在乙腈中的溶解量很小并且乙腈是较好的蛋白沉淀剂。因此，本实验最佳提取条件以乙腈为提取溶剂，固液比1：5、浸提时间20min，连续浸提2次，提取效果最佳。
2.2 提取方式的选择
振荡提取、热水浴提取法、超声波提取3种提取方式的色素提取率见表2，从表2可以看出色素的提取率均为超声波提取率最高，热水浴提取率最低，超声波提取效果高于振荡提取效果。因此，本实验超声辅助萃取法提取色素。
2.3 质谱条件的选择
参照此8种物质的电离特性，通过连续进样，对每种色素的单标溶液进行全扫描，确定每种色素的电离方式和分子离子峰，在分别获得每种色素的分子离子峰后，进行二级质谱（子离子）扫描，优化碰撞能量，从中选出2个丰度比较高的子离子分别作为定性和定量离子，选出并建立MRM模式的质谱方法。质谱分析参数见表3。
2.4 方法回收率和准确度 取空白肉灌肠样品，添加3个不同质量浓度水平的混合标准溶液，按样品预处理方法进行处理，测定提取液中的目标化合物。每个浓度水平取6份样品进行实验，计算平均回收率及相对标准偏差（RSD），方法回收率在81.2%～108.9%之间。相对标准偏差（RSD）在4.2%～13.2%之间，具体结果见表4。
3 结 论
本实验建立的方法以乙腈为提取溶剂、采用超声波辅助萃取，可以实现对肉灌肠中8种红色色素的同时检测，该方法的灵敏度、准确度都能满足日常检测分析的要求，具有快速、灵敏度高的特点。
参考文献：
[1] 陈晓红， 李小平， 姚淘平. 高效液相色谱-质谱联用法测定饮料中人工合成色素的研究[J]. 中国卫生检验杂志， 2005， 15（8）： 941-942.
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[3] 金玉娥， 孙丕， 沈红， 等. 食品中违禁色素橙黄Ⅱ和酸性间胺黄的HPLC测定研究[J]. 上海计量测试， 2006（4）： 19-22.
[4] 赵志磊， 吴广臣， 李小亭. 高效液相色谱测定食品中非食用色素皂黃[J]. 食品工业科技， 2008， 29（6）： 284-286.
[5] 唐勇， 琚春梅， 魏钟杰， 等. 苏丹红Ⅰ、Ⅲ和对位红竞争ELISA检测方法的初步建立[J]. 食品科学， 2008， 29（8）： 523-524.
[6] 张文德. 食品中苏丹红Ⅰ号的单扫示波极谱测定法[J]. 中国食品卫生杂志， 2006， 18（4）： 317-321.
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[9] 高洁， 宁尚勇， 许志强. 固相萃取-高效液相色谱法检测食品中的非食用色素[J]. 分析试验室. 2008， 27（8）： 33-36.
[10] 黄晓兰， 吴惠勤， 黄芳. GC-MS/SIM法同时测定食品中的苏丹红Ⅰ～Ⅳ[J]. 分析测试学报， 2005， 24（4）： 1-4.
[11] TATEO F， BONONI M. Fast determination of Sudan Ⅰ by HPLC/APCI-MS in hot chilli， spices， and oven-baked foods[J]. Agricultural and Food Chemistry， 2004， 52（4）： 655-658.
[12] CALBINAI F， CARERI M， EVLIRI L， et al. Accurate mass measurements for the confirmation of Sudan azo-dyes in hot chilli products by capillary liquid chromatography-electrospray tandem quadrupole orthogonal-acceleration time of flight mass spectrometry[J]. Journal of Chromoatgraphy A， 2004， 1058（1/2）： 127-135.
[13] 宁啸骏， 王丁林， 虞成华， 等. UPLC-MS/MS同位素内标法测定食品中对位红、苏丹红Ⅰ～Ⅳ的研究[J]. 质谱学报， 2009， 30（1）： 41-43.
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[15] 陈焕文， 张燮， 罗明标. 电喷雾解析电离质谱法对食品中苏丹红染料的快速检测[J]. 分析化学. 2006， 34（4）： 464-466.
[16] 陈关娟， 李亚明， 张蓉， 等. 高效液相色谱法测定纺织品上的致敏性分散染料[J]. 染料与染色， 2006， 43（4）： 51-55.
[17] 丁友超， 曹锡忠， 吴丽娜， 等. 高效液相色谱-电喷雾串联质谱法快速分离鉴定纺织品中的9种致癌染料[J]. 色谱. 2008， 26（5）： 603-608.
[18] 赵珊， 张晶， 杨奕， 等. 色谱， 超高效液相色谱电喷雾串联四极杆质谱法检测果汁和葡萄酒中的27种工业染料[J]. 色谱， 2010， 28（4）： 356-362.
关键词：液质联用；肉灌肠；色素；超声波提取
中图分类号：O657.63 文献标志码：A 文章编号：1001-8123（2013）06-0019-03
为降低食品生产成本、并赋予食品诱人的外观、稳定色泽，一些不法生产厂家在食品生产加工过程中违法使用非食用色素或超范围添加色素。近年来，工业染料和超范围添加色素在食品中的非法使用问题频繁发生，如在渔业中添加孔雀石绿；在辣椒粉或辣椒酱中使用苏丹红、对位红、玫瑰红等；在豆干、腐竹、腐皮中使用碱性橙、碱性嫩黄和酸性金黄等；在卤制熟食和软包装肉制品中使用苏丹红和诱惑红等食品安全事件。为此，卫生部印发了“食品中可能违法添加的非食用物质名单”通知，列出了数种非食用色素，可见加强对食品中非食用色素的检测十分必要[1-5]。
目前，检测食品中非法添加色素染料的方法很多，包括免疫法、毛细管电泳法、电化学分析法、薄层色谱法、高效液相色谱法、气相色谱-质谱联用法和液相色谱-质谱联用法[6-18]。其中常用的方法是高效液相色谱法和液相色谱-质谱联用方法。对于建立多组分的快速预警检测方法，要求其灵敏度高、选择性好并能够对化合物进行确认，而液相色谱-串联质谱法具备了上述特点。本研究建立了同时检测肉灌肠中非法添加罗丹明B、苏丹红Ⅰ、苏丹红Ⅱ、苏丹红Ⅲ、苏丹红Ⅳ以及易超量超范围添加胭脂红、苋菜红、诱惑红的液相色谱-质谱联用方法。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
罗丹明B、苏丹红Ⅰ、苏丹红Ⅱ、苏丹红Ⅲ、苏丹红Ⅳ、胭脂红、苋菜红、诱惑红 德国Dr.Ehrenstorfer GmbH公司；甲醇、乙腈、乙醇、丙酮均为色谱纯 赛默飞世尔科技有限公司；氯化钠为分析纯 天津科密欧化学试剂有限公司；肉灌肠 市购。
1.2 仪器与设备
8030高效液相色谱-质谱联用仪 日本岛津公司；Diamonsil C18色谱柱（250mm×4.6mm，5μm） 北京迪马科技有限公司；Milli-Q密理博超纯制水机 德国默克密理博公司；M37610-33涡旋混合器 赛默飞世尔科技有限公司；BK-80A超声波振荡器 济南巴克超声波科技有限公司；TGL21M高速离心机 长沙湘智离心机仪器有限公司。
1.3 方法
1.3.1 色谱条件
流动相流速0.3mL/min，进样量：5μL，柱温：40℃，梯度：12min内5%～100%乙腈，保持2min，1min内回到初始流动相条件，保持3min至下一次进样。离子源：电喷雾正离子（ESI）模式；毛细管电压：3.2kV；离子源温度：100℃；脱溶剂气温度：350℃；脱溶剂气流量：540L/h。
1.3.2 标准溶液配制
准确称取一定量的标准物质，用乙腈稀释制成10mg/L标准溶液，于4℃条件下保存。
1.3.3 样品前处理
将样品放入绞肉机绞碎，准确称取混合均匀试样约2g（精确到0.01g）于具塞磨口玻璃试管中，加乙腈10mL，涡旋混合2min，超声萃取20min，离心取上清液，再加10mL乙腈萃取，合并2次提取液，加入2.5mL水和0.5g氯化钠，用乙腈定容至25mL，离心，上清液经0.2μm滤膜过滤，待LC-MS/MS测定。
1.3.4 色素提取率计算公式
提取率/% =×100
式中：C为提取液中色素质量浓度/（μg/mL），V为提取液体积mL，m为试样质量/g。
1.3.5 提取方式的比较
比较了3种提取方式：振荡提取、热水浴提取法、超声波提取。振荡提取的条件：准确称取2.00g样品放入玻璃试管中，加入10mL乙腈，振荡混合2min；热水浴提取条件：准确称取2.00g样品放入玻璃管中，加入10mL乙腈，在80℃的水浴中浸提30min；超声波提取条件：准确称取2.00g样品放入玻璃管中，加入10mL乙腈，在超声波提取仪中提取20min。通过比较色素提取率确定提取方式。每种提取方式进行4次平行实验，取平均值进行比较。
2 结果与分析
2.1 提取溶剂的选择
本实验比较了几种溶剂对色素提取率的影响，水对苏丹红的提取率最低，有机溶剂的色素提取率均在70%以上，脂肪在甲醇、乙醇和丙酮中的溶解率较大，提取液杂质较多，不利于实验分析，而脂肪在乙腈中的溶解量很小并且乙腈是较好的蛋白沉淀剂。因此，本实验最佳提取条件以乙腈为提取溶剂，固液比1：5、浸提时间20min，连续浸提2次，提取效果最佳。
2.2 提取方式的选择
振荡提取、热水浴提取法、超声波提取3种提取方式的色素提取率见表2，从表2可以看出色素的提取率均为超声波提取率最高，热水浴提取率最低，超声波提取效果高于振荡提取效果。因此，本实验超声辅助萃取法提取色素。
2.3 质谱条件的选择
参照此8种物质的电离特性，通过连续进样，对每种色素的单标溶液进行全扫描，确定每种色素的电离方式和分子离子峰，在分别获得每种色素的分子离子峰后，进行二级质谱（子离子）扫描，优化碰撞能量，从中选出2个丰度比较高的子离子分别作为定性和定量离子，选出并建立MRM模式的质谱方法。质谱分析参数见表3。
2.4 方法回收率和准确度 取空白肉灌肠样品，添加3个不同质量浓度水平的混合标准溶液，按样品预处理方法进行处理，测定提取液中的目标化合物。每个浓度水平取6份样品进行实验，计算平均回收率及相对标准偏差（RSD），方法回收率在81.2%～108.9%之间。相对标准偏差（RSD）在4.2%～13.2%之间，具体结果见表4。
3 结 论
本实验建立的方法以乙腈为提取溶剂、采用超声波辅助萃取，可以实现对肉灌肠中8种红色色素的同时检测，该方法的灵敏度、准确度都能满足日常检测分析的要求，具有快速、灵敏度高的特点。
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