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[摘要]目的研究巢蛋白、神经胶质酸性蛋白和神经元特异性烯醇化酶的胶质瘤细胞中的表达。方法购买A172，U87，U251，LN229，GaMG，pA及pB，进行细胞培养、细胞免疫组化、Western blot分析、RT-PCR和loal-time PCR。结果B微管蛋白Ⅲ型（classⅢ B-tubulin）、微管相关蛋白2（MAP-2）、神经元特异性烯醇化酶（NsE）均表达于2种胶质母细胞瘤组织、5种人胶质母细胞瘤细胞系中，均在各种肿瘤细胞中均一表达，但是神经丝蛋白70不表达于这些肿瘤细胞中。NSE在胞质核细胞核区域存在，但是和胞质相比，细胞核区域具有显著较高的染色轻度。classIII B-tubulin、NSE均在各种细胞系中均一表达，但是MAP-2亚型在不同的细胞系或肿瘤组织中具有不同的含量，高分子量MAP-2在pA、U251、LN229中高表达，低分子量MAP-2在pB、A172、U8 7、GaMG中高表达，同时将两种不同分子量的MAP-2表达出来。结论巢蛋白、神经胶质酸性蛋白和神经元特异性烯醇化酶的胶质瘤细胞中的表达均随着周围环境的变化而变化。
[关键词]巢蛋白；神经胶质酸性蛋白；神经元特异性烯醇化酶；胶质瘤细胞；表达
本文研究通过研究巢蛋白、神经胶质酸性蛋白和神经元特异性烯醇化酶的胶质瘤细胞的表达情况及其在不同环境中的调控作用，并探讨其表达量与胶质瘤患者预后的关系，利于后期胶质瘤的诊断及治疗，具有重要实践意义，现报道如下。
1材料与方法
1.1材料
购买美国ATCC公司生产的A172，U87，U251，LN229，采用诺美卑尔根大学提供的GaMG，从挪威霍兰山大学医院神经外科病人胶质瘤标本中提取pA及pB。
1.2方法
1.2.1细胞培养
设定标准细胞培养环境，进行细胞传代，冻存细胞，进行细胞复苏及细胞计数。
1.2.2细胞免疫组化
1）细胞标本制作。将一层放置在37℃的温度下2h的50ug/ml聚左旋赖氨酸涂在12mm盖玻片上，然后将适量细胞种植出来，2-3d细胞爬片。用PBS对标本进行2次清洗，用4%多聚甲醛进行10min的固定。用0.5%Triton X-100对标本进行4min的透化处理。用PBS对标本进行3次清洗，将PBS加入其中后在4℃的冰箱中放置将其保存起来；2）免疫染色。室温下在封闭液中对细胞标本进行15min的放置，37℃下将细胞标本和一抗进行45min的孵育或4℃将细胞标本和一抗孵育过夜。用PBS对标本进行3次清洗，每次5min。37℃下将标本和二抗工作液进行45min的孵育。用PBS对标本进行3次清洗，每次5min，然后用三蒸水对其进行1次清洗。在每个标本中加入5trlVectashield固定液，其中含DAPI，常温下避光保存，时长为2h，将盖玻片边缘封闭住，在此过程中将指甲油充分利用起来。检查结果并将其保存下来，在此过程中将尼康Eclipse TE2000-E荧光显微镜充分利用起来。
1.2.3 Western blot分析
制备蛋白样品，测定蛋白浓度，进行SDS-PAGE凝胶电泳，在1.5ml的离心管中将18ul样本准备出来，70℃下对混合样本进行10min的加热。组装玻璃板和12孔NuPage 4-12%Bis-Tris胶，将500trl抗氧化剂及1倍NuPage MOPS SDS电泳缓冲液加入到电泳槽中，将1倍电泳缓冲液加入到外面空间中。将胶底部的气泡排出，在上样孔中加入15ul处理好的样品及7ul SeeBlue Plus2 Prestained标准。插上电极，200V下进行5min电泳。电泳过程中应该对电压及电泳时间进行适当调节，在此過程中严格依据分子量。将胶从玻璃板上取下时应该从下端开始对凝胶进行剥离，使较自然脱落。然后转膜，最后分析化学发光及结果。
1.2.4 RT-PCR和real-time PCR
提取细胞系总RNA，进行RNA定量，然后进行RT-PCT，最后进行实时定量PCR。
1.3统计学分析
对结果进行分析，分析过程中将LCS480软件充分利用起来，向Excel中导人，运用CT（2-A ACT）方法对数据进行分析。常规统计及t检验数据时采用软件SPSS19.0，检验水准a=0.05。
2讨论
胶质瘤源自神经上皮细胞的肿瘤总称，约占颅脑肿瘤的45%，属于临床中较为常见的颅内恶性肿瘤。临床学者提出了多种关于胶质瘤的起源及发展的假说，其中普遍认可肿瘤干细胞模型及克隆演变模型。长期以来，胶质瘤认为起源于脑间质中的胶质细胞，且有部分学者通过研究表明：胶质瘤中表达神经元标记物，少数胶质瘤细胞中含有神经元特异性的离子通道。胶质瘤形成过程中极易使得神经元的不完全分化，或者来源胶质细胞肿瘤的恶心演变中，处于分化。恶性颅脑肿瘤往往包含较显著的细胞异质性，胶质瘤细胞中含有其他多种类型的标记物，如：神经元标记物。因此，研究巢蛋白、神经胶质酸性蛋白和神经元特异性烯醇化酶的胶质瘤细胞的表达研究具有重要意义。本研究结果表明，巢蛋白、神经胶质酸性蛋白和神经元特异性烯醇化酶的胶质瘤细胞中的表达均随着周围环境的变化而变化，值得临床充分重视。
[关键词]巢蛋白；神经胶质酸性蛋白；神经元特异性烯醇化酶；胶质瘤细胞；表达
本文研究通过研究巢蛋白、神经胶质酸性蛋白和神经元特异性烯醇化酶的胶质瘤细胞的表达情况及其在不同环境中的调控作用，并探讨其表达量与胶质瘤患者预后的关系，利于后期胶质瘤的诊断及治疗，具有重要实践意义，现报道如下。
1材料与方法
1.1材料
购买美国ATCC公司生产的A172，U87，U251，LN229，采用诺美卑尔根大学提供的GaMG，从挪威霍兰山大学医院神经外科病人胶质瘤标本中提取pA及pB。
1.2方法
1.2.1细胞培养
设定标准细胞培养环境，进行细胞传代，冻存细胞，进行细胞复苏及细胞计数。
1.2.2细胞免疫组化
1）细胞标本制作。将一层放置在37℃的温度下2h的50ug/ml聚左旋赖氨酸涂在12mm盖玻片上，然后将适量细胞种植出来，2-3d细胞爬片。用PBS对标本进行2次清洗，用4%多聚甲醛进行10min的固定。用0.5%Triton X-100对标本进行4min的透化处理。用PBS对标本进行3次清洗，将PBS加入其中后在4℃的冰箱中放置将其保存起来；2）免疫染色。室温下在封闭液中对细胞标本进行15min的放置，37℃下将细胞标本和一抗进行45min的孵育或4℃将细胞标本和一抗孵育过夜。用PBS对标本进行3次清洗，每次5min。37℃下将标本和二抗工作液进行45min的孵育。用PBS对标本进行3次清洗，每次5min，然后用三蒸水对其进行1次清洗。在每个标本中加入5trlVectashield固定液，其中含DAPI，常温下避光保存，时长为2h，将盖玻片边缘封闭住，在此过程中将指甲油充分利用起来。检查结果并将其保存下来，在此过程中将尼康Eclipse TE2000-E荧光显微镜充分利用起来。
1.2.3 Western blot分析
制备蛋白样品，测定蛋白浓度，进行SDS-PAGE凝胶电泳，在1.5ml的离心管中将18ul样本准备出来，70℃下对混合样本进行10min的加热。组装玻璃板和12孔NuPage 4-12%Bis-Tris胶，将500trl抗氧化剂及1倍NuPage MOPS SDS电泳缓冲液加入到电泳槽中，将1倍电泳缓冲液加入到外面空间中。将胶底部的气泡排出，在上样孔中加入15ul处理好的样品及7ul SeeBlue Plus2 Prestained标准。插上电极，200V下进行5min电泳。电泳过程中应该对电压及电泳时间进行适当调节，在此過程中严格依据分子量。将胶从玻璃板上取下时应该从下端开始对凝胶进行剥离，使较自然脱落。然后转膜，最后分析化学发光及结果。
1.2.4 RT-PCR和real-time PCR
提取细胞系总RNA，进行RNA定量，然后进行RT-PCT，最后进行实时定量PCR。
1.3统计学分析
对结果进行分析，分析过程中将LCS480软件充分利用起来，向Excel中导人，运用CT（2-A ACT）方法对数据进行分析。常规统计及t检验数据时采用软件SPSS19.0，检验水准a=0.05。
2讨论
胶质瘤源自神经上皮细胞的肿瘤总称，约占颅脑肿瘤的45%，属于临床中较为常见的颅内恶性肿瘤。临床学者提出了多种关于胶质瘤的起源及发展的假说，其中普遍认可肿瘤干细胞模型及克隆演变模型。长期以来，胶质瘤认为起源于脑间质中的胶质细胞，且有部分学者通过研究表明：胶质瘤中表达神经元标记物，少数胶质瘤细胞中含有神经元特异性的离子通道。胶质瘤形成过程中极易使得神经元的不完全分化，或者来源胶质细胞肿瘤的恶心演变中，处于分化。恶性颅脑肿瘤往往包含较显著的细胞异质性，胶质瘤细胞中含有其他多种类型的标记物，如：神经元标记物。因此，研究巢蛋白、神经胶质酸性蛋白和神经元特异性烯醇化酶的胶质瘤细胞的表达研究具有重要意义。本研究结果表明，巢蛋白、神经胶质酸性蛋白和神经元特异性烯醇化酶的胶质瘤细胞中的表达均随着周围环境的变化而变化，值得临床充分重视。