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【摘 要】 目的:考察不同产地差不嘎蒿药材的各项质量指标,为其质量标准建立及优质产地的筛选提供一定的实验依据。方法:采用HPLC法,流动相:乙腈-0.2%甲酸水(35∶65)流量:0.8ml/min;检测波长:288nm;柱温:30℃,测定指标性成分异樱花素、圣草酚-7-甲醚的含量;按照2010年版《中国药典》(一部)附录方法测定其醇溶性浸出物、水分、杂质、灰分含量及其酸败度,综合评定药材质量。 结果:不同产地的药材之间有一定的差异,其中异樱花素、圣草酚-7-甲醚含量差异较为明显,水分随保藏年份的增加而减少,其他项的差异保持在一定范围内。结论:不同产地的差不嘎蒿药材的质量有所不同,内蒙古自治区赤峰市可作为优质种源。
【关键词】 差不嘎蒿;不同产地;质量对比;异樱花素;圣草酚-7-甲醚
【中图分类号】R284.1 【文献标志码】 A 【文章编号】1007-8517(2015)17-0027-04
Abstract:Objective Study the quality indicators of Artemisia halodendron Turcz.In different areas, to provide some academic basis for quality criterion and origin select of Artemisia halodendron. Method The methods of HPLC (mobile phase of acetonitrile-0.2% formic acid water(35:65); The flow rate was 0.8 ml/min, the detection wavelength was 288 nm,column temperature 30℃)was used to determine the content of the signature ingredients-Isosakuranetin and Eriodictyol-7-methyl ether. According to the 2010 pharmacopoeia appendix method for determining the ethanol–soluble, moisture, impurities, ash content and its degree of rancidity. To evaluate the quality of Artemisia halodendron in a comprehensive way. Results There are many differences between all the medicines, especially the content of Isosakuranetin and Eriodictyol-7-methyl ether . Moisture content decreased with the increase of the preservation time, and other quality indexs remain within a certain range of differences. Conclusion The content of chemical compositions in Artemisia halodendron from different place has a significant difference and and Artemisia halodendron in Chifeng, Inner Mongolia could be used as a high quality germplasm.
Keywords:Artemisia halodendron Turcz.;Different habitats; Quality contrast; Isosakuranetin; Eriodictyol-7-methyl ether
差不嘎蒿为菊科植物差不嘎蒿Artemisia halodendron Turcz.的干燥成熟果实,又名有沙蒿、沙漠嘎、普勒罕达等,在《中国沙漠地区药用植物》[1]、《中药大辞典》[2] 、《全国中草药汇编》[3]中均有收载。差不嘎蒿味辛性温,归肝、肺经,具有抗炎[4]、止咳、祛痰、平喘[5]、解表、祛湿等功效,临床用于治疗肠痈腹痛、慢性盆腔炎、跌打损伤、风湿性关节炎、慢性气管炎及支气管哮喘等症[1-3]。研究发现,差不嘎蒿药材中含有大量的黄酮类成分[6-7],并具有清除自由基、抗氧化、抗炎、抗肿瘤、抗病毒、抗突变、调节免疫、防治血管硬化、降血糖等功能[8]。对差不嘎蒿药材祛痰平喘活性成分进行追踪[5],确定其有效部位为总黄酮,其中,异樱花素和圣草酚-7-甲醚含量较高,为指标性成分[4]。
产地是影响中药材质量的重要因素之一,当地所有的生态因子均与药材质量有关,其中包括土壤、气温、降雨、光照、生态群落构成等。大多数药材经过千百年来的筛选,已将产地和质量紧密结合,即称优质产地的药材为道地药材[9]。因此,产地作为中药质量的本草学属性在中药质量评价中有着不可或缺的重要地位[10]。迄今为止,内蒙、甘肃、山西等地均被视为差不嘎蒿的主产区,但各地差不嘎蒿质量差别的研究尚未见报道。本实验选取差不嘎蒿主产区的19批不同产地的药材,分别测定指标性成分圣草酚-7-甲醚、异樱花素的含量,药材的醇溶性浸出物含量,稳定性指标酸败度,安全性指标水分、杂质、灰分含量,对其进行综合全面的质量评价。
1 仪器与材料
1.1 仪器 LC-20A高效液相色谱仪(DAD,Shimadzu Corporation);双列六孔电热恒温水浴箱(天津市泰斯特仪器有限公司);KQ-500DE超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司);WG136型电热鼓风干燥箱(天津市泰斯特仪器有限公司);AB265-S精密电子天平(Mettler Toledo);JA2003电子分析天平(上海舜宇恒平科学仪器有限公司);DL-I-15电炉(天津市泰斯特仪器有限公司);马弗炉(弗恩森(北京)电炉有限公司)。 1.2 材料 本次研究用19批差不嘎蒿药材供试品均由亚宝药业集团股份有限公司提供,涵盖了内蒙古、山西、甘肃等地区在内的差不嘎蒿主产区,于秋天果实成熟时采收果穗,晒干,搓出种子,除去杂质。经中国医学科学院药物研究所马林教授鉴定,各批供试品均为差不嘎蒿,详见表1。
异樱花素对照品、圣草酚-7-甲醚对照品自制,经面积归一化法确定其纯度均在98%以上;乙腈为色谱纯;水为自制超纯水;其余试剂均为分析纯。
2 方法与结果
2.1 指标性成分含量测定
2.1.1 色谱条件与系统适应性试验[4] 色谱柱:Phenomenex Extend(250mm× 4.6mm,5μm),检测波长:288 nm;流动相:乙腈-0.2%甲酸水溶液(35∶65);流速0.8 ml/min;柱温:30℃;进样量:10μl。供试品中各相邻色谱峰的分离度均符合要求,理论板数均不低于3000。对照品及样品HPLC图谱见图1-3。
2.1.2 对照品溶液的制备 取圣草酚-7-甲醚、异樱花素对照品适量,精密称定,加甲醇分别制成每1ml含圣草酚-7-甲醚76.20μg、异樱花素26.18μg的溶液,即得。
2.1.3 供试品溶液的制备 将各批差不嘎蒿药材粉碎,过三号筛。取药材粉末约0.5g,精密称定,置50ml具塞锥形瓶中,精密加85%乙醇20ml,称定重量,超声处理(功率500W,频率40kHz)30min,放冷,用85%乙醇补足减失的重量,滤过,滤液蒸干,残渣用甲醇溶解,并转移至10ml容量瓶中,加甲醇至刻度,摇匀,即得。
2.1.4 线性关系考察 分别精密吸取浓度为127.00μg/ml的圣草酚-7-甲醚对照品溶液1、2、4、6、8、10ml,浓度为53.36μg/mL的异樱花素对照品溶液1、2、4、6、8、10ml,依次用甲醇定容到10ml容量瓶中,摇匀。6个不同浓度的对照液分别进样2次测定,每次10μl。以Y为峰面积,X为对照品进样量,得圣草酚-7-甲醚回归方程为Y=2517.54X+16207.66(R2=0.9993),线性范围:0.1270~1.2700μg/ml;异樱花素回归方程为Y=3754067.83X +15469.71(R2 =0.9995),线性范围0.0534~0.5336μg/ml。
2.1.5 精密度试验 取76.20μg/ml圣草酚-7-甲醚、26.18μg/mL异樱花素对照品溶液,重复进样6次,每次进样10μL,按照“2.1.1”项所述色谱条件测定,RSD分别为:0.47%、0.66%,表明精密度良好。
2.1.6 重复性试验 取同一批差不嘎蒿种子粉末共6份,按照“2.1.3”项所述制成供试品溶液。测得圣草酚-7-甲醚、异樱花素含量的RSD分别为0.84%、0.98%。
2.1.7 稳定性试验 取同一份差不噶蒿种子供试品溶液,分别在0、2、4、6、8、12、16、20、24、32、40、48h后进行HPLC测定。结果圣草酚-7-甲醚、异樱花素含量的RSD分别为0.65%、0.78%。表明供试品溶液在48h内基本稳定。
2.1.8 加样回收率试验 取已知圣草酚-7-甲醚、异樱花素含量的差不嘎蒿种子样品0.25g,精密称定,分别加入对照品溶液适量,按“2.1.3”项下方法操作,吸取10μL 进样测定。结果圣草酚-7-甲醚、异樱花素的平均回收率分别为101.3%、98.9%,RSD 分别为1.05%、1.29%。
2.1.9 样品测定 取不同产地差不嘎蒿药材药材,按“2.1.3”项下方法进行供试品溶液制备,分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液10μl,注入液相色谱仪,测定,即得。结果见表2。
2.2 其他质量指标测定
按照2010年版《中国药典》(一部)中提供的方法,将差不嘎蒿粉碎后,分别测定其醇溶性浸出物含量、水分含量、杂质含量、灰分含量及其酸败度。结果见表2。
3 讨论
从差不嘎蒿的各种成分含量数据可知,不同地区药材质量是有差异性的。HPLC含量检测结果显示,圣草酚-7-甲醚含量以S4、S5、S14样品较高,S3样品含量最低;异樱花素同样是S4样品含量最高,其次为S5,再次是S14、S15,其中S19含量最低。以上结果表明,内蒙古自治区赤峰市的样品含指标性成分较高,质量较好。醇溶性浸出物检测结果显示,S14、S16药材样品含量较高,内蒙古自治区赤峰市样品含量紧随其次。
由于其他项含量测定数据量过大,故需要通过数理统计的方法进行数据分析,从而科学的表征这些差异。借助统计软件SPSS13.0将有关差不嘎蒿质量的各项数据统一进行Zscores标准化处理,对标准化处理后的数据进行分层聚类分析。根据数据特点,对数据进行了Q型聚类分析,并绘制聚类树状图,来评价不同地区差不嘎蒿质量的相似度,见图4。
从图4可见,S10、S11、S6、S8、S7、S12和指标性物质含量最高的S4样品聚为一类;样品S1自成一类,其他地区样品大致聚为一类。聚类结果显示,该药材质量虽有差异,但不具有经纬地带性,考虑是各样品生长环境导致植物体内成分的代谢合成差异。
检测结果显示,该药材含水量随着储藏年份的增加会逐年减少,在2.46%~7.85%之间,药材表面有胶质层包裹,与其他种子类药材水分限度相差不多[11];杂质含量从4.98%~9.67%不等,整体杂质含量偏高,其中 S4药材杂质含量最高;总灰分是药材中各种无机成分总量的指标,酸不溶性灰分大部分为沾染的泥沙。结果显示,总灰分含量在5.90%~8.22%之间,酸不溶性灰分含量在0.15%~0.40%在之间,整体偏高,S4、S14、S16药材样品质量较好。综合统计分析结果,以安全性指标评判,内蒙古中部地区的样品质量较好。 差不嘎蒿酸败度测定中,酸值为1.70~5.45之间,羰基值为1.999~8.146之间,过氧化值为0.041~0.156之间。与2010年版《中国药典》一部收载的6种种子类药材(郁李仁、柏子仁、桃仁、核桃仁、蓖麻子、榧子)酸败度限度[11]以及国家动植物油脂标准限度[12-13]相比,多数数值偏低,说明本药材中所含游离脂肪酸、低分子醛类或酮类及过氧化物较少,在一定程度上反映该药材不易酸败。分析药材不易酸败的原因可能与差不嘎蒿药材外壁包裹胶膜层有关。
以指标性物质和醇溶性浸出物含量为主,综合各个安全性指标对不同产地差不嘎蒿药材质量进行评价,结果显示各有优劣。但整体来说,内蒙古自治区赤峰市药材品质最好,陕西省榆林市药材质量相对较差。本研究以八个指标首次对19批药材样本进行了全面的质量对比评价,方法准确、稳定、重复性好,通过产地和指标性成分含量的相关试验分析,在临床用药方面提供一定的参考,同时为差不嘎蒿药材质量标准的建立、寻找优质产地实现GAP种植提供了依据。
参考文献
[1] 中国科学院冰川冻土沙漠研究所沙漠研究室编.中国沙漠地区药用植物[M].兰州:甘肃人民出版社,1973:50-51.
[2] 江苏新医学院.中药大辞典[M].上海:科学技术出版社,1986:1166.
[3] 全国中草药汇编组.全国中草药汇编[M].北京:人民卫生出版社,1978:815.
[4] 张媛媛,乔延江.HPLC法测定沙漠嘎种子中两种二氢黄酮的含量[J].北京中医药大学学报,2008,31(1):58-60.
[5] 张媛媛.沙漠嘎种子平喘活性成分筛选及其质量研究[D].北京:北京中医药大学.2006.
[6] 王延年,郭亦然,艾路,等.沙漠嘎种子化学成分研究[J].中国中药杂志,2004,29(6):506.
[7] 王延年,艾路,乔延江.沙漠嘎种子化学成分的分离与鉴定[J].中国实验方剂学杂志,2004,10(3):3-4.
[8] 刘星雨,周敏,孙体健,等.天然黄酮类化合物的药理活性及分离提取[J].中国药物与临床,2014,14(5):621-624.
[9] 潘雪梅,韦辉,刘毅,等.不同产地丹参药材质量研究[J].中草药,2011,42(9):1833-1836.
[10] 张铁军.中药质量认识与质量评价[J].中草药,2011,42(1):1-9.
[11] 国家药典委员会.中华人民共和国药典(一部)[M].北京:中国医药科技出版社,2010:193,231,260,262,330,341.
[12]中华人民共和国卫生部.GB 2716-2005.食用植物油卫生标准[S].北京:中国标准出版社,2005:3.
[13]中华人民共和国卫生部.GB10146-2005.食用动物油脂卫生标准[S].北京:中国标准出版社,2005:193.
(收稿日期:2015.05.27)
【关键词】 差不嘎蒿;不同产地;质量对比;异樱花素;圣草酚-7-甲醚
【中图分类号】R284.1 【文献标志码】 A 【文章编号】1007-8517(2015)17-0027-04
Abstract:Objective Study the quality indicators of Artemisia halodendron Turcz.In different areas, to provide some academic basis for quality criterion and origin select of Artemisia halodendron. Method The methods of HPLC (mobile phase of acetonitrile-0.2% formic acid water(35:65); The flow rate was 0.8 ml/min, the detection wavelength was 288 nm,column temperature 30℃)was used to determine the content of the signature ingredients-Isosakuranetin and Eriodictyol-7-methyl ether. According to the 2010 pharmacopoeia appendix method for determining the ethanol–soluble, moisture, impurities, ash content and its degree of rancidity. To evaluate the quality of Artemisia halodendron in a comprehensive way. Results There are many differences between all the medicines, especially the content of Isosakuranetin and Eriodictyol-7-methyl ether . Moisture content decreased with the increase of the preservation time, and other quality indexs remain within a certain range of differences. Conclusion The content of chemical compositions in Artemisia halodendron from different place has a significant difference and and Artemisia halodendron in Chifeng, Inner Mongolia could be used as a high quality germplasm.
Keywords:Artemisia halodendron Turcz.;Different habitats; Quality contrast; Isosakuranetin; Eriodictyol-7-methyl ether
差不嘎蒿为菊科植物差不嘎蒿Artemisia halodendron Turcz.的干燥成熟果实,又名有沙蒿、沙漠嘎、普勒罕达等,在《中国沙漠地区药用植物》[1]、《中药大辞典》[2] 、《全国中草药汇编》[3]中均有收载。差不嘎蒿味辛性温,归肝、肺经,具有抗炎[4]、止咳、祛痰、平喘[5]、解表、祛湿等功效,临床用于治疗肠痈腹痛、慢性盆腔炎、跌打损伤、风湿性关节炎、慢性气管炎及支气管哮喘等症[1-3]。研究发现,差不嘎蒿药材中含有大量的黄酮类成分[6-7],并具有清除自由基、抗氧化、抗炎、抗肿瘤、抗病毒、抗突变、调节免疫、防治血管硬化、降血糖等功能[8]。对差不嘎蒿药材祛痰平喘活性成分进行追踪[5],确定其有效部位为总黄酮,其中,异樱花素和圣草酚-7-甲醚含量较高,为指标性成分[4]。
产地是影响中药材质量的重要因素之一,当地所有的生态因子均与药材质量有关,其中包括土壤、气温、降雨、光照、生态群落构成等。大多数药材经过千百年来的筛选,已将产地和质量紧密结合,即称优质产地的药材为道地药材[9]。因此,产地作为中药质量的本草学属性在中药质量评价中有着不可或缺的重要地位[10]。迄今为止,内蒙、甘肃、山西等地均被视为差不嘎蒿的主产区,但各地差不嘎蒿质量差别的研究尚未见报道。本实验选取差不嘎蒿主产区的19批不同产地的药材,分别测定指标性成分圣草酚-7-甲醚、异樱花素的含量,药材的醇溶性浸出物含量,稳定性指标酸败度,安全性指标水分、杂质、灰分含量,对其进行综合全面的质量评价。
1 仪器与材料
1.1 仪器 LC-20A高效液相色谱仪(DAD,Shimadzu Corporation);双列六孔电热恒温水浴箱(天津市泰斯特仪器有限公司);KQ-500DE超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司);WG136型电热鼓风干燥箱(天津市泰斯特仪器有限公司);AB265-S精密电子天平(Mettler Toledo);JA2003电子分析天平(上海舜宇恒平科学仪器有限公司);DL-I-15电炉(天津市泰斯特仪器有限公司);马弗炉(弗恩森(北京)电炉有限公司)。 1.2 材料 本次研究用19批差不嘎蒿药材供试品均由亚宝药业集团股份有限公司提供,涵盖了内蒙古、山西、甘肃等地区在内的差不嘎蒿主产区,于秋天果实成熟时采收果穗,晒干,搓出种子,除去杂质。经中国医学科学院药物研究所马林教授鉴定,各批供试品均为差不嘎蒿,详见表1。
异樱花素对照品、圣草酚-7-甲醚对照品自制,经面积归一化法确定其纯度均在98%以上;乙腈为色谱纯;水为自制超纯水;其余试剂均为分析纯。
2 方法与结果
2.1 指标性成分含量测定
2.1.1 色谱条件与系统适应性试验[4] 色谱柱:Phenomenex Extend(250mm× 4.6mm,5μm),检测波长:288 nm;流动相:乙腈-0.2%甲酸水溶液(35∶65);流速0.8 ml/min;柱温:30℃;进样量:10μl。供试品中各相邻色谱峰的分离度均符合要求,理论板数均不低于3000。对照品及样品HPLC图谱见图1-3。
2.1.2 对照品溶液的制备 取圣草酚-7-甲醚、异樱花素对照品适量,精密称定,加甲醇分别制成每1ml含圣草酚-7-甲醚76.20μg、异樱花素26.18μg的溶液,即得。
2.1.3 供试品溶液的制备 将各批差不嘎蒿药材粉碎,过三号筛。取药材粉末约0.5g,精密称定,置50ml具塞锥形瓶中,精密加85%乙醇20ml,称定重量,超声处理(功率500W,频率40kHz)30min,放冷,用85%乙醇补足减失的重量,滤过,滤液蒸干,残渣用甲醇溶解,并转移至10ml容量瓶中,加甲醇至刻度,摇匀,即得。
2.1.4 线性关系考察 分别精密吸取浓度为127.00μg/ml的圣草酚-7-甲醚对照品溶液1、2、4、6、8、10ml,浓度为53.36μg/mL的异樱花素对照品溶液1、2、4、6、8、10ml,依次用甲醇定容到10ml容量瓶中,摇匀。6个不同浓度的对照液分别进样2次测定,每次10μl。以Y为峰面积,X为对照品进样量,得圣草酚-7-甲醚回归方程为Y=2517.54X+16207.66(R2=0.9993),线性范围:0.1270~1.2700μg/ml;异樱花素回归方程为Y=3754067.83X +15469.71(R2 =0.9995),线性范围0.0534~0.5336μg/ml。
2.1.5 精密度试验 取76.20μg/ml圣草酚-7-甲醚、26.18μg/mL异樱花素对照品溶液,重复进样6次,每次进样10μL,按照“2.1.1”项所述色谱条件测定,RSD分别为:0.47%、0.66%,表明精密度良好。
2.1.6 重复性试验 取同一批差不嘎蒿种子粉末共6份,按照“2.1.3”项所述制成供试品溶液。测得圣草酚-7-甲醚、异樱花素含量的RSD分别为0.84%、0.98%。
2.1.7 稳定性试验 取同一份差不噶蒿种子供试品溶液,分别在0、2、4、6、8、12、16、20、24、32、40、48h后进行HPLC测定。结果圣草酚-7-甲醚、异樱花素含量的RSD分别为0.65%、0.78%。表明供试品溶液在48h内基本稳定。
2.1.8 加样回收率试验 取已知圣草酚-7-甲醚、异樱花素含量的差不嘎蒿种子样品0.25g,精密称定,分别加入对照品溶液适量,按“2.1.3”项下方法操作,吸取10μL 进样测定。结果圣草酚-7-甲醚、异樱花素的平均回收率分别为101.3%、98.9%,RSD 分别为1.05%、1.29%。
2.1.9 样品测定 取不同产地差不嘎蒿药材药材,按“2.1.3”项下方法进行供试品溶液制备,分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液10μl,注入液相色谱仪,测定,即得。结果见表2。
2.2 其他质量指标测定
按照2010年版《中国药典》(一部)中提供的方法,将差不嘎蒿粉碎后,分别测定其醇溶性浸出物含量、水分含量、杂质含量、灰分含量及其酸败度。结果见表2。
3 讨论
从差不嘎蒿的各种成分含量数据可知,不同地区药材质量是有差异性的。HPLC含量检测结果显示,圣草酚-7-甲醚含量以S4、S5、S14样品较高,S3样品含量最低;异樱花素同样是S4样品含量最高,其次为S5,再次是S14、S15,其中S19含量最低。以上结果表明,内蒙古自治区赤峰市的样品含指标性成分较高,质量较好。醇溶性浸出物检测结果显示,S14、S16药材样品含量较高,内蒙古自治区赤峰市样品含量紧随其次。
由于其他项含量测定数据量过大,故需要通过数理统计的方法进行数据分析,从而科学的表征这些差异。借助统计软件SPSS13.0将有关差不嘎蒿质量的各项数据统一进行Zscores标准化处理,对标准化处理后的数据进行分层聚类分析。根据数据特点,对数据进行了Q型聚类分析,并绘制聚类树状图,来评价不同地区差不嘎蒿质量的相似度,见图4。
从图4可见,S10、S11、S6、S8、S7、S12和指标性物质含量最高的S4样品聚为一类;样品S1自成一类,其他地区样品大致聚为一类。聚类结果显示,该药材质量虽有差异,但不具有经纬地带性,考虑是各样品生长环境导致植物体内成分的代谢合成差异。
检测结果显示,该药材含水量随着储藏年份的增加会逐年减少,在2.46%~7.85%之间,药材表面有胶质层包裹,与其他种子类药材水分限度相差不多[11];杂质含量从4.98%~9.67%不等,整体杂质含量偏高,其中 S4药材杂质含量最高;总灰分是药材中各种无机成分总量的指标,酸不溶性灰分大部分为沾染的泥沙。结果显示,总灰分含量在5.90%~8.22%之间,酸不溶性灰分含量在0.15%~0.40%在之间,整体偏高,S4、S14、S16药材样品质量较好。综合统计分析结果,以安全性指标评判,内蒙古中部地区的样品质量较好。 差不嘎蒿酸败度测定中,酸值为1.70~5.45之间,羰基值为1.999~8.146之间,过氧化值为0.041~0.156之间。与2010年版《中国药典》一部收载的6种种子类药材(郁李仁、柏子仁、桃仁、核桃仁、蓖麻子、榧子)酸败度限度[11]以及国家动植物油脂标准限度[12-13]相比,多数数值偏低,说明本药材中所含游离脂肪酸、低分子醛类或酮类及过氧化物较少,在一定程度上反映该药材不易酸败。分析药材不易酸败的原因可能与差不嘎蒿药材外壁包裹胶膜层有关。
以指标性物质和醇溶性浸出物含量为主,综合各个安全性指标对不同产地差不嘎蒿药材质量进行评价,结果显示各有优劣。但整体来说,内蒙古自治区赤峰市药材品质最好,陕西省榆林市药材质量相对较差。本研究以八个指标首次对19批药材样本进行了全面的质量对比评价,方法准确、稳定、重复性好,通过产地和指标性成分含量的相关试验分析,在临床用药方面提供一定的参考,同时为差不嘎蒿药材质量标准的建立、寻找优质产地实现GAP种植提供了依据。
参考文献
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[12]中华人民共和国卫生部.GB 2716-2005.食用植物油卫生标准[S].北京:中国标准出版社,2005:3.
[13]中华人民共和国卫生部.GB10146-2005.食用动物油脂卫生标准[S].北京:中国标准出版社,2005:193.
(收稿日期:2015.05.27)