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摘要[目的]研究蜀本草多糖的优化提取工艺和抑菌活性。[方法]通过提取温度、提取时间、料液比等单因素和正交试验对匀浆热水提法提取蜀本草多糖工艺进行了优化，同时利用所得多糖进行体外抑菌活性试验和热稳定性研究。[结果]蜀本草多糖提取最优条件为提取温度65 ℃、料液比（m/v）1∶45、提取时间75 min，多糖得率最高为6.28%；抑菌活性试验结果表明，蜀本草多糖提取物对酵母菌无明显抑制作用，对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌有明显抑制作用；蜀本草粗多糖提取物在100 ℃及以下活性稳定。[结论]该研究为开发利用蜀本草多糖提供理论依据。
关键词蜀本草；多糖；正交试验；抑菌活性；热稳定性
中图分类号S567文献标识码A文章编号0517-6611（2014）36-12909-03
Abstract[Objective]The research aimed to study the extraction technology and the bacteriostatic activity of Portulaca oleracea L..[Method]The homogenate and hot water extraction method was used to gain the optimization extract condition of polysaccharides from Portulaca oleracea L. by orthogonal experiment.The purified polysaccharide was investigated about antibacterial activity and heat stability.[Result]The orthogonal experiment shows that the large yield of polysaccharide was 6.28% at 65 ℃， solventsolid ratio 1∶45，75 min. Antibacterial activity of the experiment shows that the polysaccharide had no significant inhibitory effect on saccharomycete，and it had obvious inhibitory effect on three bacteria （Escherichia coli， Staphylococcus aureus， Sacillus subtilis）. The bacteriostatic stability of polysaccharide was active under 100 ℃.[Conclusion]The study provides the theoretical basis for the development and utilization of Portulaca oleracea L. polysaccharide.
Key wordsPortulaca oleracea L.； Polysaccharide； Orthogonal experiment； Antibacterial activity； Heat stability
蜀本草（Portulaca oleracea L.）为蜀本草科蜀本草属植物，属于药食同源的野生植物之一，不仅具有很高的营养价值，且具有清热解毒、利水去湿、散血消肿、除尘杀菌、消炎止痛、止血凉血等多种药理功能[1]。蜀本草含有丰富的植物多糖，而植物多糖在自然界中作为一种重要的天然活性物质，其最大的优点在于毒副作用小、资源来源广泛、成本低廉，且在高温下植物多糖的性质很稳定。因此，植物多糖被广泛应用于高效低毒药物和功能食品的研发中。研究表明，多糖的提取方法主要有水提法、酶提法、超声波法等[2]。该试验以匀浆+热水提法提取蜀本草多糖，并通过正交试验对该法进行了条件优化，最后对蜀本草多糖体外抑菌活性和热稳定性进行了初步探究，为合理有效开发利用蜀本草多糖提供理论依据。
1材料与方法
1.1材料和试剂
蜀本草于2013年9月采自武汉东湖学院大棚试验基地。采摘后洗净，40 ℃烘干至恒重，粉碎后过40目筛，密封备用。抑菌试验所用的大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、酵母菌等均由武汉大学生科院提供，分别于对应的培养基中接种活化后备用。
LB培养基、PDA培养基、水饱和酚、无水乙醇、葡萄糖等试剂均为分析纯。
1.2仪器
WFJ 7200型可见分光光度计，尤尼柯（上海）仪器有限公司；MIKRO 22R台式冷冻离心机，德国赫提驰公司；gentle MACS Dissociator，德国美天旎生物技术有限公司；MJ300BSⅡ霉菌培养箱，上海新苗医疗器械制造有限公司；CHAS恒温振荡器，常州国华电器有限公司；立式压力蒸汽灭菌器，上海博迅实业有限公司医疗设备厂。
1.3方法
1.3.1蜀本草多糖提取的单因素和正交试验。
称取蜀本草粉碎样品5份，以不同的提取温度、不同的料液比、不同的提取时间采用单因素和正交试验提取多糖，过滤脱色定溶，用苯酚硫酸法[3]测定多糖含量，确定马齿苋多糖的提取工艺。
1.3.2蜀本草多糖抑菌试验。
1.3.2.1蜀本草多糖的制备。
采用正交试验最佳工艺条件处理蜀本草，提取液经过滤、浓缩、脱色、去蛋白、乙醇沉淀等处理后得粗多糖[4]，冷冻干燥备用。称取干燥后蜀本草多糖5 g，加适量蒸馏水浸泡15 min，过滤浓缩溶液至10 ml，配制成0.5 g/ml多糖溶液，再用蒸馏水等倍稀释制成0.25、0125 g/ml溶液，置于冰箱中待用。 1.3.2.2抑菌试验。
通过平板打孔法测定蜀本草多糖对供试菌的抑制效果[3-4]。采用涂布法制成含菌平板。用打孔器在上述含菌平板上均匀打3个大小相同的孔，等量加入3种不同浓度蜀本草多糖溶液，每组3个平行，对照组均加无菌水。大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌放入37 ℃恒温培养箱中培养24 h；酵母菌放入28 ℃恒温培养箱中培养48 h。测定抑菌圈直径，取其平均值。
1.3.2.3最低抑菌浓度（MIC）的测定。
通过抑菌试验结果制定最低抑菌浓度（MIC），采用浓度梯度倾注平板法测定目标菌的最小抑菌浓度（MIC），以平板中无菌落生长为判断标准。
1.3.3热稳定性试验。
由最小浓度抑制试验确定每种菌的最低抑制浓度，将最低抑菌浓度下的蜀本草多糖溶液分别在80、100和121 ℃湿热条件下处理15 min后做抑菌试验[5-6]。
2结果与分析
2.1单因素条件下蜀本草多糖提取效果
2.1.1提取时间对蜀本草多糖得率的影响[5]。
称取蜀本草5份，按料液比1∶40（m/v）分别加入蒸馏水，于40 ℃水浴预处理10 min，然后匀浆处理2 min，最后在80 ℃水浴下，分别处理60、70、80、90、100 min，提取液离心取上清，采用苯酚硫酸法[3]测量多糖含量并计算得率。结果发现（图1），60～80 min多糖得率逐渐增高，80 min时，多糖得率最高，而后随着时间的延长，多糖得率开始下降，说明提取时间过长对多糖分子有影响。
3结论
（1）蜀本草多糖的提取方法主要有热水提法、酶提法、超声辅助提法，试验中发现蜀本草叶片经过组织匀浆后再用热水提效果较好，有可能成为替代超声波辅助提法的又一工艺，并通过正交试验对该工艺进行了条件优化，找到了最佳工艺条件为提取温度65 ℃、料液比（m/v）1∶45、提取时间75 min，多糖得率最高为6.28%。
（2）试验中按照最优条件提取的蜀本草多糖对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金花色葡萄球菌等3种试验细菌有抑制作用，对酵母菌无作用。其中对大肠杆菌和枯草芽孢杆菌的最小抑菌浓度范围在0.100～0.120 g/ml，金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度范围为0.080～0.100 g/ml。
（3）蜀本草多糖在100 ℃下具有抗菌活性，具备良好的热稳定性，具有良好的应用前景。
（4）素有“天然抗生素”之美称的蜀本草，其具有广谱的抗菌作用[10-11]，这一点对于在抗生素滥用的今天来说尤为重要。近年来，关于蜀本草多糖的研究屡见不鲜，诸多文献对其化学结构和药理作用的研究还处于初步阶段，相关研究工作有待进一步深入。如能将多糖进行分离纯化后，探究单一成分的作用，将体外与体内试验有机结合，并从宏观到微观层次上研究蜀本草多糖作用机制，则能更好地将相关理论应用于生产实践。如今，保健食品市场不断扩大，越来越多的人对其认知度和购买欲随之提高，而活性多糖现已成为天然药物学和保健食品学的研究热点，寻找高效天然无毒副作用药物是保健食品研究项目之一。
参考文献
[1] 王玉生，蔡岳文.南方药用植物图鉴[M].汕头：汕头大学出版社，2004：60.
[2] 李海燕，王旭深.马齿苋多糖提取方法的比较[J].第一军医大学分校学报，2005，28（2）：186-187.
[3] 陈钧辉，李俊，张冬梅，等.生物化学实验[M].4版.北京：科学出版社，2008：15-16.
[4] 曲晓兰，苏延友，高红莉.马齿苋不同采收期多糖含量的测定[J].时珍国医国药，2006，17（10）：1960-1961.
[5] 朱丹，牛广财，孟宪军.马齿苋多糖提取工艺的研究[J].中国农学通报，2006，22（8）：119-122.
[6] 曹光明.中药浸提物生产工艺学[M].北京：化学工业出版社，2009：51-61.
[7] PALAILISWAMYA U R，BIBLE B B，MCAVOY R J.Oxalic acid concentraions in Purslane（Portulaca oleraceae L.）is altered by the stage of harvest and the nitrate to ammonium ratios in hydroponics[J].Journal of American Society for Horticultural Science，2004，102（2）：267-275.
[8] 屠鹏飞.天然糖化学[M].北京：化学工业出版社，2013：116-122.
[9] DING S，DUDLEY E，PLUMMER S，et al.Fingerprint profile of Ginkgo biloba nutritional supplements by LC/ESIMS/MS[J].Phytochem，2008，69（13/14）：1555-1564.
[10] 刘绍军，周丽艳，赵希艳.马齿苋提取物抑霉作用及其在番茄贮藏上的应用[J].食品科技，2006，31（2）：103-105.
[11] RADHAKRISHNAN R，ZAKARIA M N，ISLAM M W.Neuropharmacological actions of Portulaca oleraceae L v.sativa（Hawk）[J].Journal of Ethnopharmacology，2001，76（2）：171-176.
关键词蜀本草；多糖；正交试验；抑菌活性；热稳定性
中图分类号S567文献标识码A文章编号0517-6611（2014）36-12909-03
Abstract[Objective]The research aimed to study the extraction technology and the bacteriostatic activity of Portulaca oleracea L..[Method]The homogenate and hot water extraction method was used to gain the optimization extract condition of polysaccharides from Portulaca oleracea L. by orthogonal experiment.The purified polysaccharide was investigated about antibacterial activity and heat stability.[Result]The orthogonal experiment shows that the large yield of polysaccharide was 6.28% at 65 ℃， solventsolid ratio 1∶45，75 min. Antibacterial activity of the experiment shows that the polysaccharide had no significant inhibitory effect on saccharomycete，and it had obvious inhibitory effect on three bacteria （Escherichia coli， Staphylococcus aureus， Sacillus subtilis）. The bacteriostatic stability of polysaccharide was active under 100 ℃.[Conclusion]The study provides the theoretical basis for the development and utilization of Portulaca oleracea L. polysaccharide.
Key wordsPortulaca oleracea L.； Polysaccharide； Orthogonal experiment； Antibacterial activity； Heat stability
蜀本草（Portulaca oleracea L.）为蜀本草科蜀本草属植物，属于药食同源的野生植物之一，不仅具有很高的营养价值，且具有清热解毒、利水去湿、散血消肿、除尘杀菌、消炎止痛、止血凉血等多种药理功能[1]。蜀本草含有丰富的植物多糖，而植物多糖在自然界中作为一种重要的天然活性物质，其最大的优点在于毒副作用小、资源来源广泛、成本低廉，且在高温下植物多糖的性质很稳定。因此，植物多糖被广泛应用于高效低毒药物和功能食品的研发中。研究表明，多糖的提取方法主要有水提法、酶提法、超声波法等[2]。该试验以匀浆+热水提法提取蜀本草多糖，并通过正交试验对该法进行了条件优化，最后对蜀本草多糖体外抑菌活性和热稳定性进行了初步探究，为合理有效开发利用蜀本草多糖提供理论依据。
1材料与方法
1.1材料和试剂
蜀本草于2013年9月采自武汉东湖学院大棚试验基地。采摘后洗净，40 ℃烘干至恒重，粉碎后过40目筛，密封备用。抑菌试验所用的大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、酵母菌等均由武汉大学生科院提供，分别于对应的培养基中接种活化后备用。
LB培养基、PDA培养基、水饱和酚、无水乙醇、葡萄糖等试剂均为分析纯。
1.2仪器
WFJ 7200型可见分光光度计，尤尼柯（上海）仪器有限公司；MIKRO 22R台式冷冻离心机，德国赫提驰公司；gentle MACS Dissociator，德国美天旎生物技术有限公司；MJ300BSⅡ霉菌培养箱，上海新苗医疗器械制造有限公司；CHAS恒温振荡器，常州国华电器有限公司；立式压力蒸汽灭菌器，上海博迅实业有限公司医疗设备厂。
1.3方法
1.3.1蜀本草多糖提取的单因素和正交试验。
称取蜀本草粉碎样品5份，以不同的提取温度、不同的料液比、不同的提取时间采用单因素和正交试验提取多糖，过滤脱色定溶，用苯酚硫酸法[3]测定多糖含量，确定马齿苋多糖的提取工艺。
1.3.2蜀本草多糖抑菌试验。
1.3.2.1蜀本草多糖的制备。
采用正交试验最佳工艺条件处理蜀本草，提取液经过滤、浓缩、脱色、去蛋白、乙醇沉淀等处理后得粗多糖[4]，冷冻干燥备用。称取干燥后蜀本草多糖5 g，加适量蒸馏水浸泡15 min，过滤浓缩溶液至10 ml，配制成0.5 g/ml多糖溶液，再用蒸馏水等倍稀释制成0.25、0125 g/ml溶液，置于冰箱中待用。 1.3.2.2抑菌试验。
通过平板打孔法测定蜀本草多糖对供试菌的抑制效果[3-4]。采用涂布法制成含菌平板。用打孔器在上述含菌平板上均匀打3个大小相同的孔，等量加入3种不同浓度蜀本草多糖溶液，每组3个平行，对照组均加无菌水。大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌放入37 ℃恒温培养箱中培养24 h；酵母菌放入28 ℃恒温培养箱中培养48 h。测定抑菌圈直径，取其平均值。
1.3.2.3最低抑菌浓度（MIC）的测定。
通过抑菌试验结果制定最低抑菌浓度（MIC），采用浓度梯度倾注平板法测定目标菌的最小抑菌浓度（MIC），以平板中无菌落生长为判断标准。
1.3.3热稳定性试验。
由最小浓度抑制试验确定每种菌的最低抑制浓度，将最低抑菌浓度下的蜀本草多糖溶液分别在80、100和121 ℃湿热条件下处理15 min后做抑菌试验[5-6]。
2结果与分析
2.1单因素条件下蜀本草多糖提取效果
2.1.1提取时间对蜀本草多糖得率的影响[5]。
称取蜀本草5份，按料液比1∶40（m/v）分别加入蒸馏水，于40 ℃水浴预处理10 min，然后匀浆处理2 min，最后在80 ℃水浴下，分别处理60、70、80、90、100 min，提取液离心取上清，采用苯酚硫酸法[3]测量多糖含量并计算得率。结果发现（图1），60～80 min多糖得率逐渐增高，80 min时，多糖得率最高，而后随着时间的延长，多糖得率开始下降，说明提取时间过长对多糖分子有影响。
3结论
（1）蜀本草多糖的提取方法主要有热水提法、酶提法、超声辅助提法，试验中发现蜀本草叶片经过组织匀浆后再用热水提效果较好，有可能成为替代超声波辅助提法的又一工艺，并通过正交试验对该工艺进行了条件优化，找到了最佳工艺条件为提取温度65 ℃、料液比（m/v）1∶45、提取时间75 min，多糖得率最高为6.28%。
（2）试验中按照最优条件提取的蜀本草多糖对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金花色葡萄球菌等3种试验细菌有抑制作用，对酵母菌无作用。其中对大肠杆菌和枯草芽孢杆菌的最小抑菌浓度范围在0.100～0.120 g/ml，金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度范围为0.080～0.100 g/ml。
（3）蜀本草多糖在100 ℃下具有抗菌活性，具备良好的热稳定性，具有良好的应用前景。
（4）素有“天然抗生素”之美称的蜀本草，其具有广谱的抗菌作用[10-11]，这一点对于在抗生素滥用的今天来说尤为重要。近年来，关于蜀本草多糖的研究屡见不鲜，诸多文献对其化学结构和药理作用的研究还处于初步阶段，相关研究工作有待进一步深入。如能将多糖进行分离纯化后，探究单一成分的作用，将体外与体内试验有机结合，并从宏观到微观层次上研究蜀本草多糖作用机制，则能更好地将相关理论应用于生产实践。如今，保健食品市场不断扩大，越来越多的人对其认知度和购买欲随之提高，而活性多糖现已成为天然药物学和保健食品学的研究热点，寻找高效天然无毒副作用药物是保健食品研究项目之一。
参考文献
[1] 王玉生，蔡岳文.南方药用植物图鉴[M].汕头：汕头大学出版社，2004：60.
[2] 李海燕，王旭深.马齿苋多糖提取方法的比较[J].第一军医大学分校学报，2005，28（2）：186-187.
[3] 陈钧辉，李俊，张冬梅，等.生物化学实验[M].4版.北京：科学出版社，2008：15-16.
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[5] 朱丹，牛广财，孟宪军.马齿苋多糖提取工艺的研究[J].中国农学通报，2006，22（8）：119-122.
[6] 曹光明.中药浸提物生产工艺学[M].北京：化学工业出版社，2009：51-61.
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[10] 刘绍军，周丽艳，赵希艳.马齿苋提取物抑霉作用及其在番茄贮藏上的应用[J].食品科技，2006，31（2）：103-105.
[11] RADHAKRISHNAN R，ZAKARIA M N，ISLAM M W.Neuropharmacological actions of Portulaca oleraceae L v.sativa（Hawk）[J].Journal of Ethnopharmacology，2001，76（2）：171-176.