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摘要：采用RT-PCR方法对四川绵阳地区采集的疑似猪繁殖与呼吸综合征感染病料进行克隆，并对ORF5基因进行测序及遗传进化分析。Nsp2基因扩增结果表明，获得的15个猪繁殖与呼吸综合征阳性毒株均为Nsp2基因存在缺失的变异株。ORF5基因测序结果表明，15株ORF5基因均由603 bp编码、200 个氨基酸组成，各毒株之间的氨基酸同源性为87.6%～100.0%，与GenBank 中13 株参考毒株的序列同源性在57.2%～99.0%之间，与HUN4、JXA1、TJM、GXHZ12等HP-PRRSV 代表株ORF5的相似性高达90%～99%。推导氨基酸分析结果表明，各毒株的ORF5氨基酸序列因各场的不同而差异显著，存在一些突变位点，同时同一场内的不同毒株间的差异也较大，多数毒株在信号肽、跨膜功能区都存在突变位点，各毒株的潜在糖基化位点也存在差异；遗传进化树分析结果表明，15 株ORF5 序列均属于北美株，大部分毒株序列与2006年暴发的JXA1高度同源。总体上，各毒株之间没有呈现明显的地域性。
关键词：绵阳；猪繁殖与呼吸综合征；ORF5基因；克隆；遗传变异
中图分类号： S852.6文献标志码： A文章编号：1002-1302（2014）09-0026-04
收稿日期：2013-12-05
基金项目：四川省应用基础研究计划（编号：2013JY0127）；四川省教育厅自然科学研究项目（编号：09ZB033）；绵阳师范学院科研项目（编号：QD204A004）。
作者简介：陈希文（1977—），男，四川宜宾人，博士，副教授，从事动物疾病防控研究。Tel：（0816）2200065；E-mail：[email protected]。猪繁殖与呼吸综合征（porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）是一种流行于全球的猪烈性传染病，该病于1987年在美国发现首例病例后很快就在欧美各国的猪群中引发了一场空前的“流产风暴”，使有关国家的养猪业蒙受了灾难性的经济损失。这种曾被称为猪神秘病（mystery swine disease，MSD）、猪蓝耳病（blue-eared disease of pigs）的猪病现已蔓延至世界各国，是目前造成全球养猪业经济损失严重的疾病之一[1-9]。该病的病原为猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV），Wensvoort等在荷兰首次分离到该病毒[10]，以后在美国、加拿大、欧洲国家、中国以及日本也陆续分离到[11-13]。该病毒为有襄膜的单股正链RNA病毒，含有8个读码框，由于其基因组结构和转录机制与动脉炎病毒相似，1995年国际病毒分类委员会将PRRSV归属于动脉炎病毒科 （Arteriuiridae）动脉炎病毒属 （Arteriuirus）。2006年在中国暴发的猪高热病的主要病原就是PRRSV 变异株（高致病性PRRSV），其显著特点是高发病率和高死亡率，并引起育肥猪的发病死亡[14]。PRRSV有8个读码框，其中ORF5编码囊膜糖蛋白GP5，该蛋白是PRRSV 异质性最高的结构蛋白，2个基因型间氨基酸的相似性仅50%～55%，北美型不同分离株间GP5 的同源性为89%～94%，欧洲株间的同源性为87.10%～9925%。GP5 也是PRRSV 主要的宿主保护性抗原，参与细胞免疫和体液免疫，GP5 的变异直接导致PRRSV疫苗株的交叉保护率降低，给该病的防控带来了更大的挑战[15-18]。有研究表明，中国北美型流行毒株可被分为多个亚型，近来又有研究表明中国同时存在着欧洲型PRRSV，这些无疑给该病的防控增加了难度。本研究对四川省绵阳地区主要猪场PRRS流行毒株 ORF5基因进行了克隆和测序，并将测序获得的ORF5 序列与GenBank 中的参考毒株序列进行了比较分析，确定PRRSV 在绵阳地区猪场的遗传变异情况和分子流行病学特征，为PRRSV疫苗毒株的选择和综合防控提供了参考。
1材料与方法
1.1试验材料
采集绵阳猪场疑似PRRS发病猪的血，分离血清-20 ℃保存备用。
1.2主要试剂
Trizol LS Reagent，M-MuLV反转录酶，AxyPrepTM PlasmidMiniprep Kit、Agarose Gel DNA Purification Kit，rTaq DNA 聚合酶、DNA Marker DL 2000等购自TaKaRa 公司。
1.3引物设计与合成
根据GenBank 中收录的HP-PRRSV JXA1的基因序列（GenBank 登录号：EF112445.1），利用Primer 5.0 软件设计合成能扩增出区分经典株和HP-PRRSV株 Nsp2基因的引物P1、P2（P1：5′-CAAAGAYCAGATGGAGGAG-3′，P2：5′-ATRATGGCTTGAGCTGAG-3′）以及扩增ORF5全基因的引物P3、P4（P3：5′-GTTTACCCAACGCTCCTTA-3′，P4：5′-ACTGGCGTGTAGGTAATGG-3′）。引物由生工生物工程（上海）有限公司合成，纯度级别为PAGE。基因预计扩增长度分别为 768 bp（经典株）或678 bp（变异株）和801 bp。
1.4病毒总RNA 的提取
按RNA Trizol试剂说明书提取总RNA，具体方法如下：取500 μL血清，加入1 mL Trizol试剂，匀浆，室温静置2～3 min；加入200 μL的三氯甲烷，剧烈振荡，室温静置2～3 min；4 ℃ 12 000 r/min离心15 min；取上清，加入等体积的异丙醇，室温静置10 min，4 ℃ 12 000 r/min离心10 min；弃上清，加入1.0 mL 75%乙醇，振摇，4 ℃ 12 000 r/min离心 5 min；弃去上清，干燥沉淀物（室温约5 min）；用适量无RNase 水溶解沉淀，-20 ℃保存备用。 1.5RT-PCR 扩增
取10 μL RNA 与1 μL 的20 pmol/μL引物混匀，在PCR 仪中70 ℃下反应 5 min，立即冰浴5 min，再加入5×Reaction Buffer 4 μL、2.5 mmol/μL dNTP 4 μL 、RNase Inhibitor 0.5 μL、M-MuLV逆转录酶 1 μL，混匀后置于PCR 仪中，于42 ℃ 1 h、70 ℃ 10 min 下反应，获得cDNA 模板，将反转录产物用于PCR 反应。取cDNA 3 μL、10×Buffer 和MgCl2各5 μL、2.5 mmol/L dNTP 4 μL、rTaq DNA 聚合酶0.5 μL、20 pmol/μL上下游引物各1 μL，加ddH2O至终体系50 μL。反应程序：95 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃ 延伸30 s（ORF5 片段为1 min），共40 个循环；最后72 ℃延伸10 min。反应结束后，琼脂糖凝胶电泳观察。
1.6ORF5基因的克隆及测序
参照DNA Purification Kit 说明书回收针对ORF5扩增的目的片段，于4 ℃下与pMD18-T 载体过夜连接，再连接产物转化DH5α感受态细胞，涂布于含有IPTG 和X-gal的LB 平板上，挑取白斑接种LB 液体培养基后按照说明书提取质粒，酶切鉴定后，将鉴定正确的质粒送往生工生物工程（上海）有限公司进行序列测定。
1.7ORF5基因的变异和进化分析
利用DNAStar 软件，将测序获得的PRRSV ORF5 序列与GenBank 已公布的PRRSV 参考毒株序列进行比对分析，并绘制系统进化树。
2结果与分析
2.1PRRSV Nsp2基因的RT-PCR扩增结果
以扩增能区分经典株和变异株 Nsp2基因的引物P1、P2，对血清样品进行RT-PCR扩增，得到与PRRSV变异株预期大小一致的特异性片段（678 bp），详细结果见图1。
2.2PRRSV ORF5基因的克隆及测序
选取15份 Nsp2扩增阳性的样品，用可以扩增PRRSV ORF5全基因的引物P3、P4进行RT-PCR扩增，PCR产物用1.5%琼脂糖凝胶进行电泳，结果表明，15 份样品均出现了特异性条带，长度均约为801 bp（图2），与预期大小一致。将PCR产物进行回收、克隆及测序，得到15个PRRSV流行毒株
的ORF5 全基因组序列。
2.3PRRSV ORF5基因的变异分析
基因测序结果表明，15株ORF5 基因均由603 bp编码、200 个氨基酸组成，各毒株之间的氨基酸同源性为87.6%～100.0%，与GenBank 中13 株参考毒株的序列差异性不同，其同源性为57.2%～99.0%。15个克隆株与HUN4、JXA1、TJM、GXHZ12等HP-PRRSV 代表株ORF5 的相似性高达90%～99%，多数毒株与JXA1高度同源。通过推导氨基酸分析结果可知，PRRSV各分离株的ORF5 氨基酸序列因各场的不同而差异显著，存在一些突变位点，同时同一场内的不同毒株间差异也较大。另外，克隆到的多数毒株在信号肽、跨膜功能区都存在突变位点，各毒株含有的潜在糖基化位点也有所差异，具体结果见图3。
2.4系统进化树分析
将15 株ORF5 序列与GenBank 中13株参考毒株进行比对分析，结果表明15 株ORF5 序列均属于北美株，大部分毒株序列与2006年暴发的JXA1和TJM株高度同源。综合分析各毒株的分布情况可知，总体上各毒株的分群未呈现出明显的地域性，具体结果见图4。
3结论与讨论
PRRSV自1987年在美国发现首例病例后，迅速向各国蔓延，目前已成为危害世界养猪业的主要疫病之一。我国自1996年首次分离到PRRSV后，该病很快传播到国内各猪场。特别是2006 年5 月以后在中国暴发的由PRRSV 变异毒株引起的“高热病”造成猪大量死亡，更是引起人们对该病的高度重视，该病已成为危害我国养猪业的主要疾病之一。本研究收集了绵阳地区主要规模化猪场的病料，针对PRRSV Nsp2 设计可以区分PRRSV 经典株和PRRSV 变异株的特异性引物进行PRRSV 检测，结果表明，HP-PRRSV 阳性率为100%，说明绵阳猪场PRRSV 变异株是主要的流行毒株。
PRRSV 难以防控的一个重要原因是PRRSV 的异质性，PRRSV 可通过碱基突变、缺失甚至重组等发生变异，产生变异毒株。国内外流行的PRRSV 分离株之间的序列同源性仅为60%，不同地区的分离株也存在一定的基因突变，特别是与病毒抗原性相关的ORF5 编码的蛋白GP5 变异率最大[19-20]。GP5 变异明显可能是因为其暴露在囊膜表面并且可以诱导中和抗体的产生，这就意味着GP5 暴露在抗体选择的压力下，因而易发生变异。GP5 的变异会直接导致PRRS 疫苗株的交叉保护率降低，因此对GP5 基因进行分析有助于深入了解不同分离株间的基因关系，众多关于PRRSV 多样性
和进化的研究也都是基于GP5 序列的多样性分析[21-23]。本研究利用DNAStar 软件对获得的15株ORF5 序列与GenBank 中的13 株参考毒株进行同源性分析，结果显示，ORF5 序列之间的氨基酸同源性为57.2%～100.0%，流行毒株与GenBank 中13 株参考毒株的序列差异性不同，其同源性为57.2%～99.0%，15株分离株与JXA1、TJM、HUN4、GXHZ12等HP-PRRSV 代表株ORF5 的相似性高达90%～99%，多数毒株与JXA1高度同源。通过推导氨基酸分析结果可知，PRRSV各分离株的ORF5 氨基酸序列因各场的不同而存在差异。同时，克隆到的多数毒株在信号肽、跨膜功能区都存在突变位点，各毒株含有的潜在糖基化位点也有所不同。 GP5 是PRRSV 等3个主要结构蛋白中唯一的一种糖蛋白，有研究表明，北美型ORF5 基因存在多个糖基化位点，分别位于30/33/34/35/44/51位氨基酸。这些糖基化位点在病毒蛋白的正确折叠、生物学特性等方面具有重要作用[24]。由糖基化位点所引起的“糖基屏蔽效应”可能导致病毒逃避中和免疫应答，使病毒在体内持续感染[25]。Zhou等研究发现，不同亚群间糖基化位点的数量也不同[20]。本研究结果表明，各场流行毒株毒株在信号肽、跨膜功能区都存在突变位点，各毒株含有的潜在糖基化位点也有所不同，这些特异性突变位点的发现为今后PRRSV进化关系的分析提供了参考依据。
参考文献：
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关键词：绵阳；猪繁殖与呼吸综合征；ORF5基因；克隆；遗传变异
中图分类号： S852.6文献标志码： A文章编号：1002-1302（2014）09-0026-04
收稿日期：2013-12-05
基金项目：四川省应用基础研究计划（编号：2013JY0127）；四川省教育厅自然科学研究项目（编号：09ZB033）；绵阳师范学院科研项目（编号：QD204A004）。
作者简介：陈希文（1977—），男，四川宜宾人，博士，副教授，从事动物疾病防控研究。Tel：（0816）2200065；E-mail：[email protected]。猪繁殖与呼吸综合征（porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）是一种流行于全球的猪烈性传染病，该病于1987年在美国发现首例病例后很快就在欧美各国的猪群中引发了一场空前的“流产风暴”，使有关国家的养猪业蒙受了灾难性的经济损失。这种曾被称为猪神秘病（mystery swine disease，MSD）、猪蓝耳病（blue-eared disease of pigs）的猪病现已蔓延至世界各国，是目前造成全球养猪业经济损失严重的疾病之一[1-9]。该病的病原为猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV），Wensvoort等在荷兰首次分离到该病毒[10]，以后在美国、加拿大、欧洲国家、中国以及日本也陆续分离到[11-13]。该病毒为有襄膜的单股正链RNA病毒，含有8个读码框，由于其基因组结构和转录机制与动脉炎病毒相似，1995年国际病毒分类委员会将PRRSV归属于动脉炎病毒科 （Arteriuiridae）动脉炎病毒属 （Arteriuirus）。2006年在中国暴发的猪高热病的主要病原就是PRRSV 变异株（高致病性PRRSV），其显著特点是高发病率和高死亡率，并引起育肥猪的发病死亡[14]。PRRSV有8个读码框，其中ORF5编码囊膜糖蛋白GP5，该蛋白是PRRSV 异质性最高的结构蛋白，2个基因型间氨基酸的相似性仅50%～55%，北美型不同分离株间GP5 的同源性为89%～94%，欧洲株间的同源性为87.10%～9925%。GP5 也是PRRSV 主要的宿主保护性抗原，参与细胞免疫和体液免疫，GP5 的变异直接导致PRRSV疫苗株的交叉保护率降低，给该病的防控带来了更大的挑战[15-18]。有研究表明，中国北美型流行毒株可被分为多个亚型，近来又有研究表明中国同时存在着欧洲型PRRSV，这些无疑给该病的防控增加了难度。本研究对四川省绵阳地区主要猪场PRRS流行毒株 ORF5基因进行了克隆和测序，并将测序获得的ORF5 序列与GenBank 中的参考毒株序列进行了比较分析，确定PRRSV 在绵阳地区猪场的遗传变异情况和分子流行病学特征，为PRRSV疫苗毒株的选择和综合防控提供了参考。
1材料与方法
1.1试验材料
采集绵阳猪场疑似PRRS发病猪的血，分离血清-20 ℃保存备用。
1.2主要试剂
Trizol LS Reagent，M-MuLV反转录酶，AxyPrepTM PlasmidMiniprep Kit、Agarose Gel DNA Purification Kit，rTaq DNA 聚合酶、DNA Marker DL 2000等购自TaKaRa 公司。
1.3引物设计与合成
根据GenBank 中收录的HP-PRRSV JXA1的基因序列（GenBank 登录号：EF112445.1），利用Primer 5.0 软件设计合成能扩增出区分经典株和HP-PRRSV株 Nsp2基因的引物P1、P2（P1：5′-CAAAGAYCAGATGGAGGAG-3′，P2：5′-ATRATGGCTTGAGCTGAG-3′）以及扩增ORF5全基因的引物P3、P4（P3：5′-GTTTACCCAACGCTCCTTA-3′，P4：5′-ACTGGCGTGTAGGTAATGG-3′）。引物由生工生物工程（上海）有限公司合成，纯度级别为PAGE。基因预计扩增长度分别为 768 bp（经典株）或678 bp（变异株）和801 bp。
1.4病毒总RNA 的提取
按RNA Trizol试剂说明书提取总RNA，具体方法如下：取500 μL血清，加入1 mL Trizol试剂，匀浆，室温静置2～3 min；加入200 μL的三氯甲烷，剧烈振荡，室温静置2～3 min；4 ℃ 12 000 r/min离心15 min；取上清，加入等体积的异丙醇，室温静置10 min，4 ℃ 12 000 r/min离心10 min；弃上清，加入1.0 mL 75%乙醇，振摇，4 ℃ 12 000 r/min离心 5 min；弃去上清，干燥沉淀物（室温约5 min）；用适量无RNase 水溶解沉淀，-20 ℃保存备用。 1.5RT-PCR 扩增
取10 μL RNA 与1 μL 的20 pmol/μL引物混匀，在PCR 仪中70 ℃下反应 5 min，立即冰浴5 min，再加入5×Reaction Buffer 4 μL、2.5 mmol/μL dNTP 4 μL 、RNase Inhibitor 0.5 μL、M-MuLV逆转录酶 1 μL，混匀后置于PCR 仪中，于42 ℃ 1 h、70 ℃ 10 min 下反应，获得cDNA 模板，将反转录产物用于PCR 反应。取cDNA 3 μL、10×Buffer 和MgCl2各5 μL、2.5 mmol/L dNTP 4 μL、rTaq DNA 聚合酶0.5 μL、20 pmol/μL上下游引物各1 μL，加ddH2O至终体系50 μL。反应程序：95 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃ 延伸30 s（ORF5 片段为1 min），共40 个循环；最后72 ℃延伸10 min。反应结束后，琼脂糖凝胶电泳观察。
1.6ORF5基因的克隆及测序
参照DNA Purification Kit 说明书回收针对ORF5扩增的目的片段，于4 ℃下与pMD18-T 载体过夜连接，再连接产物转化DH5α感受态细胞，涂布于含有IPTG 和X-gal的LB 平板上，挑取白斑接种LB 液体培养基后按照说明书提取质粒，酶切鉴定后，将鉴定正确的质粒送往生工生物工程（上海）有限公司进行序列测定。
1.7ORF5基因的变异和进化分析
利用DNAStar 软件，将测序获得的PRRSV ORF5 序列与GenBank 已公布的PRRSV 参考毒株序列进行比对分析，并绘制系统进化树。
2结果与分析
2.1PRRSV Nsp2基因的RT-PCR扩增结果
以扩增能区分经典株和变异株 Nsp2基因的引物P1、P2，对血清样品进行RT-PCR扩增，得到与PRRSV变异株预期大小一致的特异性片段（678 bp），详细结果见图1。
2.2PRRSV ORF5基因的克隆及测序
选取15份 Nsp2扩增阳性的样品，用可以扩增PRRSV ORF5全基因的引物P3、P4进行RT-PCR扩增，PCR产物用1.5%琼脂糖凝胶进行电泳，结果表明，15 份样品均出现了特异性条带，长度均约为801 bp（图2），与预期大小一致。将PCR产物进行回收、克隆及测序，得到15个PRRSV流行毒株
的ORF5 全基因组序列。
2.3PRRSV ORF5基因的变异分析
基因测序结果表明，15株ORF5 基因均由603 bp编码、200 个氨基酸组成，各毒株之间的氨基酸同源性为87.6%～100.0%，与GenBank 中13 株参考毒株的序列差异性不同，其同源性为57.2%～99.0%。15个克隆株与HUN4、JXA1、TJM、GXHZ12等HP-PRRSV 代表株ORF5 的相似性高达90%～99%，多数毒株与JXA1高度同源。通过推导氨基酸分析结果可知，PRRSV各分离株的ORF5 氨基酸序列因各场的不同而差异显著，存在一些突变位点，同时同一场内的不同毒株间差异也较大。另外，克隆到的多数毒株在信号肽、跨膜功能区都存在突变位点，各毒株含有的潜在糖基化位点也有所差异，具体结果见图3。
2.4系统进化树分析
将15 株ORF5 序列与GenBank 中13株参考毒株进行比对分析，结果表明15 株ORF5 序列均属于北美株，大部分毒株序列与2006年暴发的JXA1和TJM株高度同源。综合分析各毒株的分布情况可知，总体上各毒株的分群未呈现出明显的地域性，具体结果见图4。
3结论与讨论
PRRSV自1987年在美国发现首例病例后，迅速向各国蔓延，目前已成为危害世界养猪业的主要疫病之一。我国自1996年首次分离到PRRSV后，该病很快传播到国内各猪场。特别是2006 年5 月以后在中国暴发的由PRRSV 变异毒株引起的“高热病”造成猪大量死亡，更是引起人们对该病的高度重视，该病已成为危害我国养猪业的主要疾病之一。本研究收集了绵阳地区主要规模化猪场的病料，针对PRRSV Nsp2 设计可以区分PRRSV 经典株和PRRSV 变异株的特异性引物进行PRRSV 检测，结果表明，HP-PRRSV 阳性率为100%，说明绵阳猪场PRRSV 变异株是主要的流行毒株。
PRRSV 难以防控的一个重要原因是PRRSV 的异质性，PRRSV 可通过碱基突变、缺失甚至重组等发生变异，产生变异毒株。国内外流行的PRRSV 分离株之间的序列同源性仅为60%，不同地区的分离株也存在一定的基因突变，特别是与病毒抗原性相关的ORF5 编码的蛋白GP5 变异率最大[19-20]。GP5 变异明显可能是因为其暴露在囊膜表面并且可以诱导中和抗体的产生，这就意味着GP5 暴露在抗体选择的压力下，因而易发生变异。GP5 的变异会直接导致PRRS 疫苗株的交叉保护率降低，因此对GP5 基因进行分析有助于深入了解不同分离株间的基因关系，众多关于PRRSV 多样性
和进化的研究也都是基于GP5 序列的多样性分析[21-23]。本研究利用DNAStar 软件对获得的15株ORF5 序列与GenBank 中的13 株参考毒株进行同源性分析，结果显示，ORF5 序列之间的氨基酸同源性为57.2%～100.0%，流行毒株与GenBank 中13 株参考毒株的序列差异性不同，其同源性为57.2%～99.0%，15株分离株与JXA1、TJM、HUN4、GXHZ12等HP-PRRSV 代表株ORF5 的相似性高达90%～99%，多数毒株与JXA1高度同源。通过推导氨基酸分析结果可知，PRRSV各分离株的ORF5 氨基酸序列因各场的不同而存在差异。同时，克隆到的多数毒株在信号肽、跨膜功能区都存在突变位点，各毒株含有的潜在糖基化位点也有所不同。 GP5 是PRRSV 等3个主要结构蛋白中唯一的一种糖蛋白，有研究表明，北美型ORF5 基因存在多个糖基化位点，分别位于30/33/34/35/44/51位氨基酸。这些糖基化位点在病毒蛋白的正确折叠、生物学特性等方面具有重要作用[24]。由糖基化位点所引起的“糖基屏蔽效应”可能导致病毒逃避中和免疫应答，使病毒在体内持续感染[25]。Zhou等研究发现，不同亚群间糖基化位点的数量也不同[20]。本研究结果表明，各场流行毒株毒株在信号肽、跨膜功能区都存在突变位点，各毒株含有的潜在糖基化位点也有所不同，这些特异性突变位点的发现为今后PRRSV进化关系的分析提供了参考依据。
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