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摘要 玉米单倍体育种技术以遗传诱导为基础，已成为玉米育种的关键技术，快速、准确地识别单倍体对玉米单倍体育种非常重要。本文就玉米单倍体鉴定方法的研究进展做一综述性探讨。
关键词 玉米；单倍体；鉴定；研究进展
中图分类号 S513 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2017）20-0024-02
Research Progress on Identifying Method of Maize Haploid
ZHANG Rui-ping ZHOU Lian-dong WANG Wen-jie
（Xinxiang Academy of Agricultural Sciences in Henan Province，Xinxiang Henan 453002）
Abstract Basing on the genetic introduction，the technology of haploid breeding of maize has become the key way of maize breeding，gradually.It′s very necessary to identify maize haploid fastly and accurately.Now we have had a review discussion on the ways of identification of maize haploid.
Key words maize；haploid；identification；research progress
单倍体技术是指通过自然发生或人工诱导获得单倍体，然后经过自然或人工染色体加倍恢复其倍性，并在此基础上进行选择从而获得所需纯系的方法。与传统育种方法相比，单倍体育种技术在自交系选育上具有快速、准确、高效的特点，因而越来越受到育种家的重视[1]。但是玉米单倍体自然产生率极低，一般不超过0.1%[2]，人工诱导概率也仅有10%[3]。
因此，快速准确地鉴定玉米单倍体尤为关键。目前，玉米单倍体的鉴定方法主要有形态学鉴定、解剖学鉴定、细胞学鉴定、放射性方法鉴定和遗传标记鉴定及分子标记鉴定等[4-6]。近年来，有学者研究出其他的玉米单倍体鉴定方法，比如在遗传标记基础上的可见光光谱以及近红外漫透射鉴定等方法。
1 玉米单倍体鉴定方法
1.1 形态学鉴定
利用形态学方法鉴定单倍体是一种直观、便捷的鉴定方法。玉米单倍体细胞染色体是正常二倍体细胞染色体数目的1/2，因而，相较于二倍体细胞，单倍体的细胞和细胞核都要小很多，正常生长状态下的植株也比较细弱。Chase[7-9]指出，单倍体玉米植株的株高、叶长、茎粗及各部分叶宽相当于二倍体植株的70%，而雄穗分枝数、苞叶数、节间数、穗行数和每行小穗数约为二倍体植株的90%。单倍体玉米植株在幼苗生长早期主根和芽鞘长短区别明显；在苗期第1片叶较短；在拔节期生长缓慢，叶片上冲窄小，株高、穗位高显著低于二倍体；且发育较快，开花期比二倍体早1～2 d。根据以上区别能够比较容易地区分出单倍体和二倍体。
1.2 解剖学鉴定
植株转变成单倍体后会引起解剖学上的變化，比如单倍体的体细胞、细胞核变小，叶绿体数目减少等。一般通过分析气孔保卫细胞的大小和数目来鉴定单倍体。65 μm是区分小麦单倍体和二倍体气孔保卫细胞直径长度的可靠标准，鉴定准确率超过90%[10]。而玉米单倍体的鉴定标准定为气孔保卫细胞长度≤29 μm[11]。
1.3 细胞学鉴定
鉴定植物体细胞或减数分裂细胞中染色体数目是确定倍性的最基本和最精确的方法。细胞学鉴定法通常是进行根尖分生组织细胞或减数分裂细胞压片，通过观察细胞中染色体数目区分单倍体和二倍体。流式细胞仪也是很好地用来判断细胞倍性的方法[12]。流式细胞仪应用于倍性判断上，通过对处于旺盛分裂期的细胞进行DNA含量检测，从而检测单个细胞的总核酸量。
1.4 放射性方法鉴定
随着成长的植株、幼苗、种子倍性的增加，其对辐射的抵抗力提高，这种规律性同样表现在叶片上。研究表明，在X射线剂量为54.18 C/kg时，单倍体玉米辐射2 d后出现坏死，而二倍体要20 d才出现坏死。放射性方法可以在很短的时间内照射成千上万张叶片，鉴定快速。
1.5 遗传标记法鉴定
1.5.1 人工肉眼分选。利用孤雌生殖诱导系为材料，并根据籽粒Navajo标记和ABPI紫色植株显性双标记系统对诱导产生的单倍体进行鉴定[13]。首先根据籽粒Navajo标记性状选出可能的单倍体籽粒，再经过有无苗期叶鞘色素或胚根色素确定单倍体的真伪。由此可将杂交籽粒可分为3类[14]：①胚盾状体、胚乳糊粉层均着色，为杂合二倍体；②盾状体、糊粉层均未着色，为花粉污染所致；③盾状体未着色、糊粉层着色，为拟单倍体籽粒，其具有正常3n胚乳和可能由未受精的雌配子发育成的胚。种植第③类籽粒，若幼苗叶鞘为绿色即为单倍体或双单倍体。
1.5.2 基于机器视觉玉米单倍体分选。在遗传标记的基础上，李卫军等[15]根据玉米籽粒胚面颜色标记不同，设计了一套单倍体分选系统，包括斜面翻滚部件、传动部件、信号采集与处理部件、籽粒分选部件。该系统基于机器视觉，可以在运动过程中全自动、高通量地分选单倍体籽粒，其原理是采集具有胚面的玉米籽粒图片，并判断胚部区域是否有颜色标记，以此来鉴别籽粒是单倍体还是二倍体。当玉米籽粒为多倍体时，控制器向电机发送信号，电机带动玉米挡板滑动，打开筛选窗口，籽粒落入收容盒；若为单倍体，则电机不运动，籽粒保留。
值得注意的是该系统的斜面翻滚部件，可产生玉米籽粒的多姿态信息，使获得含胚面图片的成功率达到90%，解决了人工摆设籽粒的问题。 1.5.3 基于可见光光谱高效鉴别玉米单倍体籽粒。近年刘 金等[16]已证明利用可见光光谱分析建立玉米单倍体籽粒鉴别方法，并使模型可鉴别未参与建模材料的单倍体具有可行性，并且基于该方法有望建立玉米单倍体籽粒的自动化快速筛选系统。
1.5.4 基于近红外漫透射光谱鉴别玉米单倍体。覃 鸿等[17]证明基于近红外的漫透射可实现分析光程纵深信息全累加，得到样品内部信息，对胚面朝向不敏感，能有效鉴别随机摆放的玉米单倍体和多倍体。近红外方法为实现实用化的自动鉴别提供了条件。
1.6 油分标记鉴定
陈绍江和宋同明[5]最先提出利用油分的花粉直感效应鉴定单倍体。用高油的单倍体诱导系作父本的杂交籽粒油分相对于母本自交的油分大大提高，而由于单倍性，单倍体籽粒不存在花粉直感，油分较低。再利用近红外光谱仪或核磁共振测定籽粒油分，从而分选出拟单倍体。
1.7 其他鉴定方法
另外，也有报道用除草剂抗性方法、SSR标记、SNP标记、室内发芽等方法鉴别玉米单倍体。
2 各鉴定方法的优缺点
形态鉴定法鉴定速度快。在生长发育上，单倍体与其相应的二倍体具有高度相关性，株高是鉴定单倍体准确的方法[18]，但形态鉴定法要求鉴定者经验丰富。细胞学和解剖学鉴定准确，但速度较慢，不适合大批量材料的鉴定。放射法鉴定单倍体速度快，但是工作量大，且会对玉米植株造成不可逆的损伤。遗传标记系统是由2个不同遗传标记性状组合而成，可靠性和鉴别效率较高，但在不同的杂交组合中，标记系统中籽粒标记的表现差异很大，并且要花费大量的人力、物力。
在遗传基础上基于机器视觉的玉米单倍体分选、基于可见光光谱以及基于近红外漫透射光谱鉴别玉米单倍体籽粒是近年来新兴的技术，这几种方法辨识度高、效率高，并且有望实现全自动鉴别玉米单倍体籽粒，是一个值得深入探究的方向。
油分标记鉴定法，虽然基于核磁共振测油技术研发的单倍体自动分选仪已经成功，但该技术只能筛选高油型诱导系诱导的籽粒，目前常规诱导系是否能利用油分进行分选还在探索中。
3 前景展望
在前人研究成果的基础上，科研工作者们不断改进和创新，在不久的将来有望实现高效自动化玉米单倍体鉴别。特别是利用光谱学原理对玉米籽粒胚面的鉴别，给玉米单倍体籽粒鉴别提供了新的方向。
4 参考文献
[1] 邢锦丰，张如养，段民孝，等.单倍体技术在玉米育种中的应用及其问题探讨[J].作物杂志，2012（2）：15-17.
[2] 才卓，徐国良.玉米单倍体育种研究进展[J].玉米科学，2008，16（1）：1-5.
[3] 才卓，徐国良，刘向辉，等.玉米高频率单倍生殖诱导系吉高诱系3号的选育[J].玉米科学，2007，15（1）：1-4.
[4] 韩赞平，王彬，张泽民.玉米的单倍体育种[J].种子，2010，29（1）：120-122.HAN Zanping，WANG Bin，ZHANG Zemin.Haploid breeding of maize[J].Seed，2010，29（1）：120-122.
[5] 陈绍江，宋同明.利用高油分的花粉直感效应鉴别玉米单倍体[J].作物学报，2003，29（4）：587-590.CHEN Shaojiang，SONG Tongming.Identification haploid with high oil xenia effect in maize[J].Acta Agrono-mica Siniea，2003，29（4）：587-590.
[6] 汤飞宇，丁菲，王国英.利用SSR标记检测来源于玉米孤雌生殖的双单倍体[J].江西农业大学学报，2004，26（6）：859-862.TANG Feiyu，DING Fei，WANG Guoying.Identification of doubled haploid plants from maize gynogenesis by SSR molecular marker[J].Acta Agriculturae Unive-rsitatis Jiangxiensis，2004，26（6）：859-862.
[7] CHASE S S.Monoploid frequencies in a commercial double scross hybrid maize，and in its compenent single cross hybrids and inbred lines[J].Genetics，1949，34：328.
[8] CHASE S S.Production of homozygous diploids of maize from monoplloids[J].Agron J，1952，44：263-267.
[9] CHASE S S.Monoploids and monoploid derivatives of maize（Zae mays L.）[J].Bot Review，1969，35：117-167.
[10] 王培，陳玉蓉，方仁，等.用保卫细胞鉴定花粉植株倍性方法的研究[J].中国农业大学学报，1989，15（2）：141-145.
[11] 李春红，孟祥启，蒋有绎.玉米花药培养及再生植株倍性鉴[J].华北农学报，1993，8（2）：64-68.
[12] 吴雅琴，常瑞丰，程和禾.流式细胞术进行倍性分析的原理和方法[J].云南农业大学学报，2006（4）：407-409.
[13] COE E H.A line of maize with haploid frequency[J].Aner Nat，1959，93：381-382.
[14] 梁文科，戚延香，徐尚忠.单倍体技术在玉米育种中的应用和新进展[J].玉米科学，2004，12（3）：13-15.
[15] 李卫军，刘玉梅，陈绍江，等.基于机器视觉的玉米单倍体自动分选系统[J].农机化研究，2016，1（1）：81-84.
[16] 刘金，郭婷婷，李浩川，等.基于可见光光谱高效鉴别玉米单倍体籽粒[J].光谱学与光谱分析，2015，35（11）：3268-3274.
[17] 覃鸿，马竞一，陈绍江，等.基于近红外漫反射与漫透射光谱的玉米单倍体鉴别比较研究[J].光谱学与光谱分析，2016，36（1）：292-297.
[18] 韩学莉，唐祈林，曹墨菊，等.用Stock6杂交诱导的单倍体鉴定方法初探[J].玉米科学，2006（1）：64-66.
关键词 玉米；单倍体；鉴定；研究进展
中图分类号 S513 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2017）20-0024-02
Research Progress on Identifying Method of Maize Haploid
ZHANG Rui-ping ZHOU Lian-dong WANG Wen-jie
（Xinxiang Academy of Agricultural Sciences in Henan Province，Xinxiang Henan 453002）
Abstract Basing on the genetic introduction，the technology of haploid breeding of maize has become the key way of maize breeding，gradually.It′s very necessary to identify maize haploid fastly and accurately.Now we have had a review discussion on the ways of identification of maize haploid.
Key words maize；haploid；identification；research progress
单倍体技术是指通过自然发生或人工诱导获得单倍体，然后经过自然或人工染色体加倍恢复其倍性，并在此基础上进行选择从而获得所需纯系的方法。与传统育种方法相比，单倍体育种技术在自交系选育上具有快速、准确、高效的特点，因而越来越受到育种家的重视[1]。但是玉米单倍体自然产生率极低，一般不超过0.1%[2]，人工诱导概率也仅有10%[3]。
因此，快速准确地鉴定玉米单倍体尤为关键。目前，玉米单倍体的鉴定方法主要有形态学鉴定、解剖学鉴定、细胞学鉴定、放射性方法鉴定和遗传标记鉴定及分子标记鉴定等[4-6]。近年来，有学者研究出其他的玉米单倍体鉴定方法，比如在遗传标记基础上的可见光光谱以及近红外漫透射鉴定等方法。
1 玉米单倍体鉴定方法
1.1 形态学鉴定
利用形态学方法鉴定单倍体是一种直观、便捷的鉴定方法。玉米单倍体细胞染色体是正常二倍体细胞染色体数目的1/2，因而，相较于二倍体细胞，单倍体的细胞和细胞核都要小很多，正常生长状态下的植株也比较细弱。Chase[7-9]指出，单倍体玉米植株的株高、叶长、茎粗及各部分叶宽相当于二倍体植株的70%，而雄穗分枝数、苞叶数、节间数、穗行数和每行小穗数约为二倍体植株的90%。单倍体玉米植株在幼苗生长早期主根和芽鞘长短区别明显；在苗期第1片叶较短；在拔节期生长缓慢，叶片上冲窄小，株高、穗位高显著低于二倍体；且发育较快，开花期比二倍体早1～2 d。根据以上区别能够比较容易地区分出单倍体和二倍体。
1.2 解剖学鉴定
植株转变成单倍体后会引起解剖学上的變化，比如单倍体的体细胞、细胞核变小，叶绿体数目减少等。一般通过分析气孔保卫细胞的大小和数目来鉴定单倍体。65 μm是区分小麦单倍体和二倍体气孔保卫细胞直径长度的可靠标准，鉴定准确率超过90%[10]。而玉米单倍体的鉴定标准定为气孔保卫细胞长度≤29 μm[11]。
1.3 细胞学鉴定
鉴定植物体细胞或减数分裂细胞中染色体数目是确定倍性的最基本和最精确的方法。细胞学鉴定法通常是进行根尖分生组织细胞或减数分裂细胞压片，通过观察细胞中染色体数目区分单倍体和二倍体。流式细胞仪也是很好地用来判断细胞倍性的方法[12]。流式细胞仪应用于倍性判断上，通过对处于旺盛分裂期的细胞进行DNA含量检测，从而检测单个细胞的总核酸量。
1.4 放射性方法鉴定
随着成长的植株、幼苗、种子倍性的增加，其对辐射的抵抗力提高，这种规律性同样表现在叶片上。研究表明，在X射线剂量为54.18 C/kg时，单倍体玉米辐射2 d后出现坏死，而二倍体要20 d才出现坏死。放射性方法可以在很短的时间内照射成千上万张叶片，鉴定快速。
1.5 遗传标记法鉴定
1.5.1 人工肉眼分选。利用孤雌生殖诱导系为材料，并根据籽粒Navajo标记和ABPI紫色植株显性双标记系统对诱导产生的单倍体进行鉴定[13]。首先根据籽粒Navajo标记性状选出可能的单倍体籽粒，再经过有无苗期叶鞘色素或胚根色素确定单倍体的真伪。由此可将杂交籽粒可分为3类[14]：①胚盾状体、胚乳糊粉层均着色，为杂合二倍体；②盾状体、糊粉层均未着色，为花粉污染所致；③盾状体未着色、糊粉层着色，为拟单倍体籽粒，其具有正常3n胚乳和可能由未受精的雌配子发育成的胚。种植第③类籽粒，若幼苗叶鞘为绿色即为单倍体或双单倍体。
1.5.2 基于机器视觉玉米单倍体分选。在遗传标记的基础上，李卫军等[15]根据玉米籽粒胚面颜色标记不同，设计了一套单倍体分选系统，包括斜面翻滚部件、传动部件、信号采集与处理部件、籽粒分选部件。该系统基于机器视觉，可以在运动过程中全自动、高通量地分选单倍体籽粒，其原理是采集具有胚面的玉米籽粒图片，并判断胚部区域是否有颜色标记，以此来鉴别籽粒是单倍体还是二倍体。当玉米籽粒为多倍体时，控制器向电机发送信号，电机带动玉米挡板滑动，打开筛选窗口，籽粒落入收容盒；若为单倍体，则电机不运动，籽粒保留。
值得注意的是该系统的斜面翻滚部件，可产生玉米籽粒的多姿态信息，使获得含胚面图片的成功率达到90%，解决了人工摆设籽粒的问题。 1.5.3 基于可见光光谱高效鉴别玉米单倍体籽粒。近年刘 金等[16]已证明利用可见光光谱分析建立玉米单倍体籽粒鉴别方法，并使模型可鉴别未参与建模材料的单倍体具有可行性，并且基于该方法有望建立玉米单倍体籽粒的自动化快速筛选系统。
1.5.4 基于近红外漫透射光谱鉴别玉米单倍体。覃 鸿等[17]证明基于近红外的漫透射可实现分析光程纵深信息全累加，得到样品内部信息，对胚面朝向不敏感，能有效鉴别随机摆放的玉米单倍体和多倍体。近红外方法为实现实用化的自动鉴别提供了条件。
1.6 油分标记鉴定
陈绍江和宋同明[5]最先提出利用油分的花粉直感效应鉴定单倍体。用高油的单倍体诱导系作父本的杂交籽粒油分相对于母本自交的油分大大提高，而由于单倍性，单倍体籽粒不存在花粉直感，油分较低。再利用近红外光谱仪或核磁共振测定籽粒油分，从而分选出拟单倍体。
1.7 其他鉴定方法
另外，也有报道用除草剂抗性方法、SSR标记、SNP标记、室内发芽等方法鉴别玉米单倍体。
2 各鉴定方法的优缺点
形态鉴定法鉴定速度快。在生长发育上，单倍体与其相应的二倍体具有高度相关性，株高是鉴定单倍体准确的方法[18]，但形态鉴定法要求鉴定者经验丰富。细胞学和解剖学鉴定准确，但速度较慢，不适合大批量材料的鉴定。放射法鉴定单倍体速度快，但是工作量大，且会对玉米植株造成不可逆的损伤。遗传标记系统是由2个不同遗传标记性状组合而成，可靠性和鉴别效率较高，但在不同的杂交组合中，标记系统中籽粒标记的表现差异很大，并且要花费大量的人力、物力。
在遗传基础上基于机器视觉的玉米单倍体分选、基于可见光光谱以及基于近红外漫透射光谱鉴别玉米单倍体籽粒是近年来新兴的技术，这几种方法辨识度高、效率高，并且有望实现全自动鉴别玉米单倍体籽粒，是一个值得深入探究的方向。
油分标记鉴定法，虽然基于核磁共振测油技术研发的单倍体自动分选仪已经成功，但该技术只能筛选高油型诱导系诱导的籽粒，目前常规诱导系是否能利用油分进行分选还在探索中。
3 前景展望
在前人研究成果的基础上，科研工作者们不断改进和创新，在不久的将来有望实现高效自动化玉米单倍体鉴别。特别是利用光谱学原理对玉米籽粒胚面的鉴别，给玉米单倍体籽粒鉴别提供了新的方向。
4 参考文献
[1] 邢锦丰，张如养，段民孝，等.单倍体技术在玉米育种中的应用及其问题探讨[J].作物杂志，2012（2）：15-17.
[2] 才卓，徐国良.玉米单倍体育种研究进展[J].玉米科学，2008，16（1）：1-5.
[3] 才卓，徐国良，刘向辉，等.玉米高频率单倍生殖诱导系吉高诱系3号的选育[J].玉米科学，2007，15（1）：1-4.
[4] 韩赞平，王彬，张泽民.玉米的单倍体育种[J].种子，2010，29（1）：120-122.HAN Zanping，WANG Bin，ZHANG Zemin.Haploid breeding of maize[J].Seed，2010，29（1）：120-122.
[5] 陈绍江，宋同明.利用高油分的花粉直感效应鉴别玉米单倍体[J].作物学报，2003，29（4）：587-590.CHEN Shaojiang，SONG Tongming.Identification haploid with high oil xenia effect in maize[J].Acta Agrono-mica Siniea，2003，29（4）：587-590.
[6] 汤飞宇，丁菲，王国英.利用SSR标记检测来源于玉米孤雌生殖的双单倍体[J].江西农业大学学报，2004，26（6）：859-862.TANG Feiyu，DING Fei，WANG Guoying.Identification of doubled haploid plants from maize gynogenesis by SSR molecular marker[J].Acta Agriculturae Unive-rsitatis Jiangxiensis，2004，26（6）：859-862.
[7] CHASE S S.Monoploid frequencies in a commercial double scross hybrid maize，and in its compenent single cross hybrids and inbred lines[J].Genetics，1949，34：328.
[8] CHASE S S.Production of homozygous diploids of maize from monoplloids[J].Agron J，1952，44：263-267.
[9] CHASE S S.Monoploids and monoploid derivatives of maize（Zae mays L.）[J].Bot Review，1969，35：117-167.
[10] 王培，陳玉蓉，方仁，等.用保卫细胞鉴定花粉植株倍性方法的研究[J].中国农业大学学报，1989，15（2）：141-145.
[11] 李春红，孟祥启，蒋有绎.玉米花药培养及再生植株倍性鉴[J].华北农学报，1993，8（2）：64-68.
[12] 吴雅琴，常瑞丰，程和禾.流式细胞术进行倍性分析的原理和方法[J].云南农业大学学报，2006（4）：407-409.
[13] COE E H.A line of maize with haploid frequency[J].Aner Nat，1959，93：381-382.
[14] 梁文科，戚延香，徐尚忠.单倍体技术在玉米育种中的应用和新进展[J].玉米科学，2004，12（3）：13-15.
[15] 李卫军，刘玉梅，陈绍江，等.基于机器视觉的玉米单倍体自动分选系统[J].农机化研究，2016，1（1）：81-84.
[16] 刘金，郭婷婷，李浩川，等.基于可见光光谱高效鉴别玉米单倍体籽粒[J].光谱学与光谱分析，2015，35（11）：3268-3274.
[17] 覃鸿，马竞一，陈绍江，等.基于近红外漫反射与漫透射光谱的玉米单倍体鉴别比较研究[J].光谱学与光谱分析，2016，36（1）：292-297.
[18] 韩学莉，唐祈林，曹墨菊，等.用Stock6杂交诱导的单倍体鉴定方法初探[J].玉米科学，2006（1）：64-66.