目的:观察成人骨髓间充质干细胞体外分离培养方法及其生物学特性,为骨髓间充质干细胞的临床应用奠定技术基础。方法:实验于2005-12在吉林省四平市中心医院中心实验室进行。实验材料:人骨髓间充质干细胞,Ficoll淋巴细胞分离液,胎牛血清,牛血清白蛋白,α-MEM培养基,胰蛋白酶,FITC标记的CD44和CD90。实验方法:①人骨髓间充质干细胞的分离与培养:采集成人骨髓,密度梯度法分离单个核细胞,条件培养基培养和扩增,倒置光学显微镜下观察细胞形态及生长情况。②人骨髓间充质干细胞生长曲线的测定:取生长良好的P1,P5,P10细胞,用胰酶消化,接种于24孔板培养,每天各取3孔消化计数细胞,取平均值,连续培养7d,绘制生长曲线。③人骨髓间充质干细胞表面标志的测定:取生长良好P5细胞进行免疫荧光染色鉴定(CD44,CD90并设同型对照)。④人骨髓间充质干细胞的冻存及复苏:收集生长良好细胞,计数细胞密度及冻前存活率。将细胞加入到细胞冻存液中液氮冷冻保存。30d后复苏细胞,每日倒置光学显微镜下观察细胞生长状况。结果:①倒置显微镜下观察细胞形态:倒置显微镜下观察细胞呈纤维形,漩涡状生长。②人骨髓间充质干细胞的生长曲线分析:传代的细胞生长较原代要快,从第10代开始细胞生长开始出现缓慢征象。③细胞表面标记检测结果:免疫荧光染色后细胞膜着色明显,CD44,CD90阳性率均大于90%。④细胞冻存及复苏生长特性分析:椎虫蓝计数细胞存活率90%以上,增殖能力强,和未冻存过的传代细胞具有同样的生长特性。结论:应用密度梯度法分离法能获得较高纯度的骨髓间充质干细胞,能在体外长期培养,在传代培养5代内生长旺盛且生物学特性稳定。