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摘 要 针对中国南方砖红土壤的特点，通过比较和优化土壤微生物总DNA的提取方法，获得较高质量的DNA，从而进行土壤细菌16S rDNA基因扩增和真菌ITS rDNA基因扩增。结果表明：方法一提取的土壤微生物DNA受到腐殖质等影响无法进行基因扩增；方法二提取的DNA可以進行土壤微生物基因组16S rDNA基因扩增，提取时间大大减少，但无法进行ITS rDNA基因扩增；方法三提取的DNA质量最好，可以进行细菌16S rDNA和真菌ITS rDNA基因组扩增。
关键词 土壤微生物 ；DNA提取 ；16S rDNA ；ITS rDNA
中图分类号 Q939.1 文献标识码 A Doi：10.12008/j.issn.1009-2196.2019.01.010
Abstract According to the characteristics of latosols in southern China， extraction methods for soil microbial total DNA were compared and optimized to produce high quality total DNA s from the soil microbes in latosols， and the soil bacteria were identified by using the 16S rDNA amplification and the soil fungi by using ITS rDNA. The results showed that the soil microbial DNA extracted by the first method could not be amplified by the ITS and 16s primers because of the existence of humus and others. The DNA extracted by the second method could be used to amplify the 16S rDNA gene of soil microbial genome with shorter extraction time， but the ITS rDNA gene amplification could not be performed. The extracted DNA by the third method was best in quality and could be used for bacterial and fungal genome amplification.
Keywords soil microbe ； DNA extraction ； 16S rDNA ； ITS rDNA
土壤是微生物的主要栖息地，但是，99%的微生物都难被纯培养。土壤微生物的多样性研究有利于稳定生态系统和维护生态平衡。利用宏基因组学和分子生物学技术，可以获得土壤微生物多样性信息，直接从土壤环境中提取和纯化DNA是土壤宏基因组学技术的构建关键步骤[1]。
“砖红壤”（Latosols）指富含铁与铝氧化物， 出现在地下层呈松软状，或者由于其上层物质受侵蚀后流失而变为坚硬的红色覆盖层。在中国长江以南广大地区分布着砖红壤[1]。与其他土壤相比，砖红壤发生富铁铝化和生物富集过程，矿化作用强烈，形成腐殖质，而腐殖质污染会影响土壤DNA提取与后续研究。因此，砖红壤的土壤DNA提取具有重要意义。
直接裂解法和细胞分离提取法是常用的提取土壤DNA的方法。直接裂解法是破碎土壤中的微生物细胞而得到DNA的方法；细胞分离提取法是先从土壤中将微生物细胞分离出来后再进行裂解以得到DNA的方法。直接裂解法效率较高，所得DNA比细胞分离提取法更能代表土壤所含微生物的种类，但它对DNA的剪切力较强，且提取DNA易受土壤中多种PCR的抑制物的污染[2]。细胞分离提取法主要有物理法、化学法和酶法3种。物理法的主要措施是振荡、液氮研磨、研钵研磨、冻融、超声波等；化学法的主要化学试剂是能够溶解细胞膜的疏水成分的SDS，CTAB、高盐、异硫氰酸胍等；酶法常用溶菌酶、蛋白酶K、裂解酶等处理。物理法、化学法和酶法可以联合使用。在前人工作的基础上，通过了解氯化钙、PVP、焦磷酸钠、Triton X-100[3]、PVPP[4]、硫酸铵铝[5]、粉末活性炭（PAC）[6]、无水乙醇[7]、异丙醇、液氮[8]、纤维素酶、蜗牛酶、溶菌酶[9]、磁珠[10-11]等试剂以及方法的优点与缺陷，优化土壤微生物总DNA的提取方法。
常用提取土壤DNA方法只适用于扩增细菌基因组，提取土壤DNA进行真菌ITS rDNA基因组扩增是一个瓶颈。针对砖红壤，加强DNA杂质去除这一步，主要是前期预处理和后期纯化，同时处理好土壤微生物的裂解。本研究的主要目的是比较和优化土壤微生物总DNA的提取方法，以解决提取土壤DNA进行真菌ITS rDNA基因组扩增的瓶颈，为后期研究土壤微生物多样性奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 试剂
Biosharp DNA 上样缓冲液（6×）；Bioteke 2×Power Taq PCR MasterMix；上海领骏生物磁珠（Magnetic beads）；方法一磷酸钠缓冲液PBS（0.12 mol/L，pH 8.0）；裂解液Ⅰ：0.15 mol/L NaCl，0.1 mol/L EDTA，pH 8.0；裂解液Ⅱ ：0.1 mol/L NaCl，0.5 mol/L Tris-HCl pH 8.0，10% SDS；腐殖质去除溶液：0.1 mol/L Tris，0.3 mol/L Na2EDTA，0.1 mol/L NaCl 0.292 g，pH 10；方法二DNA提取缓冲液：0.1 mol/L Tris-HCl，1.5 mol/L NaCl，3% CTAB，pH 8.0；0.5mol/L氯化钙溶液；方法三DNA提取缓冲液：0.1 mol/L Tris，0.1 mol/L EDTA，1.5 mol/L NaCl，2%CTAB，pH 8.0；Bio TEKE 生产的 2× Power Taq PCR MasterMix；细菌和真菌通用引物27F，1492R，ITS1，ITS4由上海生工合成。 1.1.2 主要仪器
凝胶成像系统，英国Fire Read公司生产；超纯水制备系统，美国Millipore公司产；VELOCITY 18R 台式冷冻离心机，澳大利亚Dynamica公司生产；双模块PCR仪，新加坡Bio-Rad公司产品；电泳仪，中国北京市六一仪器厂公司生产；电热恒温水槽，中国上海一恒科技有限公司生产；涡旋混合器，Qilinbeier公司生产；超微量紫外分光光度计，美国Nanodrop公司生产。
1.1.3 土样采集
土样采自海南儋州市宝岛新村、广西武鸣县培桂村和广东乐昌农科所香蕉种植地，取回实验室后放置在-40℃冰箱。土壤各项指标见表1。
1.2 方法
1.2.1 土壤微生物DNA提取
本研究采用3种方法，每种方法提取3种不同土壤样品DNA。
方法一：参照陈邦等[12]方法，使用冻干机冻干后并且研磨的土壤提取。
方法二：设计使用磁珠提取土壤DNA的方法。 取1 g冻干研磨土样放入2 mL离心管，加0.3 g玻璃珠和1 mL 15%硫酸铵铝溶液，在最大速度下匀化2 min，室温下12 000 r/min离心2 min，然后倾析上清液；加入1 mL腐殖质去除溶液，在最大速度下匀化2 min，室温下12 000 r/min离心2 min，然后倾析上清液；加入氯化钙溶液，以最大速度匀浆2 min，室温下12 000 r/min离心2 min，然后倾析上清液；加入DNA提取缓冲液800 μL，以最大速度均质5 s，加200 μL SDS，上下混合，并在65℃下孵育20 min，12 000 r/min离心5 min；取上清液，放冷至室温后，沿管壁加人0.6倍体积异丙醇立即混匀，然后加人 10 μL磁珠溶液涡旋30 s，置于磁力架上磁分离，吸除废液；依次加人500 μL 70% 乙醇、预冷的无水乙醇，室温晾干后加人50 μL TE洗脱，加入RNAase，37℃下水浴10 min，置于磁力架吸附得到DNA提纯液体。
方法三：参照林先贵[13]的方法，使用冻干研磨土并改良提取缓冲液。DNA提取缓冲液：0.1 mol/L Tris，0.1 mol/L EDTA，1.5 mol/L NaCl，2% CTAB，pH 8.0。
1.2.2 土壤微生物总DNA浓度及纯度测定
使用美国Nanodrop 公司生产的超微量紫外分光光度计检测。
1.2.3 土壤微生物基因组16S rDNA基因扩增和ITS rDNA基因扩增
细菌引物为通用引物27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）[13]，1492R（5'-TACGGCTACTTA CGACT
T-3'）。真菌引物为通用引物ITS1（5'-GGACTACNNGGGTATCTAAT-3'），ITS4（5'-GGACTACNNGGGTATCTAAT -3'）。细菌及真菌PCR扩增体系：Taq PCR MasterMix 12.5 μL，引物各1 μL，土壤微生物总DNA 1 μL，加超纯水至 25 μL。细菌PCR扩增程序：94℃ 5 min； 94℃ 44 s，57℃退火60 s，72℃ 2 min，30个循环；72℃ 5 min。真菌PCR扩增程序：94℃ 4 min； 94℃ 30 s，58℃退火50 s，72℃ 1 min，35个循环；72℃ 10 min。凝胶电泳检测。
1.3 数据处理
使用Microsoft Excel处理数据，Microsoft PowerPoint制图。
2 结果与分析
2.1 提取土壤DNA的浓度与纯度
在土壤样品提取过程中，DNA很容易受到重金属、腐植酸、酚类物质等的污染。通常检测DNA样品纯度的指标有A260/A280和A260/A230比值，其中A260/A280比值主要用来检测蛋白质和酚等物质的污染情况，理想比值是1.8，小于1.7时表明有蛋白质或酚污染，大于2.0时表明可能有异硫氰酸残存；A260/A230比值主要用来检测碳水化合物、盐类或有机物等杂质污染情况，理想比值是2.5，若比值小于2.0，表明样品被碳水化合物、盐类或有机溶剂污染。如表2所示，3种方法提取的DNA均受到不同程度的蛋白质、酚、碳水化合物、盐类或有机溶剂污染。方法一提取DNA浓度较高；方法二使用时间最短，提取DNA浓度低；方法三提取DNA浓度最低，因为方法三过程处理步骤较多，造成了核酸的损失，纯度最高（表2）。
2.2 总DNA质量检测
土壤微生物 DNA 的电泳检测结果（图1）可以看出，利用方法一提取到的同种土壤样本的微生物基因组DNA有条带，但是不清晰，是受到腐殖质等的影响。方法二及三未出现条带，可能是DNA含量过低。
2.3 土壤微生物基因组16S rDNA基因扩增
从土壤中提取的微生物总DNA中常有腐植酸等的污染，抑制DNA聚合酶的活性，最终导致土壤微生物基因组PCR扩增无法进行。土壤微生物16S rDNA基因的扩增结果（图2）显示，方法二、三提取到的土壤微生物DNA未经进一步纯化可扩增出16S rDNA基因。
2.4 土壤微生物基因組ITS rDNA基因扩增
如图3所示，方法一和方法二均未扩增到真菌DNA，方法三提取到的土壤微生物DNA未经进一步纯化可扩增出ITS rDNA基因。结果显示，土壤微生物基因组ITS rDNA基因扩增比16S rDNA基因扩增更易受到腐植酸等污染影响。结果进一步说明，方法三能适用于土壤微生物多样性的下一步实验。
2.5 提取方法的稳定性与应用性
本研究优化了方法三预处理方式与裂解方法。利用方法三提取3个不同土壤样品DNA，进行细菌和真菌基因扩增，所提DNA均可扩增。可知方法三所提取DNA具有一定的稳定性与应用性。 3 讨论
随着宏基因组学和分子生物学技术的快速发展，从土壤中获得高纯度、高得率和完整性好的总DNA 是在基因水平上研究土壤微生物群落多样性的基础[14-15]。从土壤中提取微生物总DNA主要有两步：（1）土壤微生物的裂解；（2）DNA 杂质的去除。土壤微生物裂解是为了提取DNA，陆文利等[16]为了提高土壤微生物的提取率，增加了土壤微生物的裂解次数，但是提取次数的增加代表大量时间的增加，本文为了节约时间，未采用该方法。
在土壤微生物的裂解这一步，本文3种方法均采用直接裂解法提取DNA，从土壤中直接裂解微生物以获取总微生物DNA与细胞分离提取法比较，其优势在于微生物种类采集较多；其缺点在于这样得到的DNA含有较多影响后续研究的腐殖质、重金属离子等[17]。方法一采用溶菌酶、SDS和冻融法；方法二采用CTAB和SDS；方法三结合CTAB、SDS和溶菌酶裂解土壤微生物。方法三可以进行细菌和真菌基因扩增，说明将CTAB、SDS和溶菌酶结合裂解土壤微生物较好。
在DNA杂质去除这一步，主要是前期预处理和后期纯化。对土壤样品进行预处理，可以达到去除腐植酸等污染的目的，陈邦等[12]使用磷酸钠缓冲液PBS洗涤土样2次；赵勇等[18]在微生物细胞裂解前采用TENP 缓冲液、PBS缓冲液对土壤样品进行了2次洗涤；王澍等[19]采用 CaCO3悬浮液对样品进行预处理。后期纯化方式有CsCl密度梯度超速离心、层析、胶回收等。同时在土壤微生物DNA的获得过程中，土壤矿物类型、质地、有机质含量以及pH值等因素，均会影响DNA提取效率和质量[20-21]。方法一前期预处理是PBS缓冲液；方法二使用硫酸铵铝溶液、腐殖质去除溶液、氯化钙溶液3种溶液进行预处理；方法三前期预处理是进行冻干研磨，后期进行二次沉淀再纯化，可降低腐植酸等的影响。方法三与其他研究明显差异在前期预处理采用冻干研磨，冻干研磨是否对土壤微生物种类多样性有影响还需进一步研究。
实验结果显示，方法一提取DNA浓度较高，但是不能直接进行PCR扩增，可能原因为受到腐植酸等的影响，方法一有大量腐植酸等的污染，提取时间长，方法繁琐。方法二只能进行16S rDNA PCR扩增，可能原因是ITS rDNA PCR比16S rDNA PCR更易受到腐植酸等污染的影响，方法二提取DNA有轻微污染。综合来看，方法三最好，方法三进行前期预处理为冻干研磨；土壤微生物的裂解使用CTAB、SDS和溶菌酶结合方法；后期纯化方法为二次沉淀纯化，与其他方法不同，从而加强抑制腐殖质、重金属离子等污染，提高DNA纯度，提取DNA可以进行土壤微生物基因组16S rDNA基因扩增和ITS rDNA基因扩增。与本研究以外的方法相比，方法三纯度较低，如果进一步提高纯度，可以采用胶回收或者吸附柱等方法。
参考文献
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关键词 土壤微生物 ；DNA提取 ；16S rDNA ；ITS rDNA
中图分类号 Q939.1 文献标识码 A Doi：10.12008/j.issn.1009-2196.2019.01.010
Abstract According to the characteristics of latosols in southern China， extraction methods for soil microbial total DNA were compared and optimized to produce high quality total DNA s from the soil microbes in latosols， and the soil bacteria were identified by using the 16S rDNA amplification and the soil fungi by using ITS rDNA. The results showed that the soil microbial DNA extracted by the first method could not be amplified by the ITS and 16s primers because of the existence of humus and others. The DNA extracted by the second method could be used to amplify the 16S rDNA gene of soil microbial genome with shorter extraction time， but the ITS rDNA gene amplification could not be performed. The extracted DNA by the third method was best in quality and could be used for bacterial and fungal genome amplification.
Keywords soil microbe ； DNA extraction ； 16S rDNA ； ITS rDNA
土壤是微生物的主要栖息地，但是，99%的微生物都难被纯培养。土壤微生物的多样性研究有利于稳定生态系统和维护生态平衡。利用宏基因组学和分子生物学技术，可以获得土壤微生物多样性信息，直接从土壤环境中提取和纯化DNA是土壤宏基因组学技术的构建关键步骤[1]。
“砖红壤”（Latosols）指富含铁与铝氧化物， 出现在地下层呈松软状，或者由于其上层物质受侵蚀后流失而变为坚硬的红色覆盖层。在中国长江以南广大地区分布着砖红壤[1]。与其他土壤相比，砖红壤发生富铁铝化和生物富集过程，矿化作用强烈，形成腐殖质，而腐殖质污染会影响土壤DNA提取与后续研究。因此，砖红壤的土壤DNA提取具有重要意义。
直接裂解法和细胞分离提取法是常用的提取土壤DNA的方法。直接裂解法是破碎土壤中的微生物细胞而得到DNA的方法；细胞分离提取法是先从土壤中将微生物细胞分离出来后再进行裂解以得到DNA的方法。直接裂解法效率较高，所得DNA比细胞分离提取法更能代表土壤所含微生物的种类，但它对DNA的剪切力较强，且提取DNA易受土壤中多种PCR的抑制物的污染[2]。细胞分离提取法主要有物理法、化学法和酶法3种。物理法的主要措施是振荡、液氮研磨、研钵研磨、冻融、超声波等；化学法的主要化学试剂是能够溶解细胞膜的疏水成分的SDS，CTAB、高盐、异硫氰酸胍等；酶法常用溶菌酶、蛋白酶K、裂解酶等处理。物理法、化学法和酶法可以联合使用。在前人工作的基础上，通过了解氯化钙、PVP、焦磷酸钠、Triton X-100[3]、PVPP[4]、硫酸铵铝[5]、粉末活性炭（PAC）[6]、无水乙醇[7]、异丙醇、液氮[8]、纤维素酶、蜗牛酶、溶菌酶[9]、磁珠[10-11]等试剂以及方法的优点与缺陷，优化土壤微生物总DNA的提取方法。
常用提取土壤DNA方法只适用于扩增细菌基因组，提取土壤DNA进行真菌ITS rDNA基因组扩增是一个瓶颈。针对砖红壤，加强DNA杂质去除这一步，主要是前期预处理和后期纯化，同时处理好土壤微生物的裂解。本研究的主要目的是比较和优化土壤微生物总DNA的提取方法，以解决提取土壤DNA进行真菌ITS rDNA基因组扩增的瓶颈，为后期研究土壤微生物多样性奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 试剂
Biosharp DNA 上样缓冲液（6×）；Bioteke 2×Power Taq PCR MasterMix；上海领骏生物磁珠（Magnetic beads）；方法一磷酸钠缓冲液PBS（0.12 mol/L，pH 8.0）；裂解液Ⅰ：0.15 mol/L NaCl，0.1 mol/L EDTA，pH 8.0；裂解液Ⅱ ：0.1 mol/L NaCl，0.5 mol/L Tris-HCl pH 8.0，10% SDS；腐殖质去除溶液：0.1 mol/L Tris，0.3 mol/L Na2EDTA，0.1 mol/L NaCl 0.292 g，pH 10；方法二DNA提取缓冲液：0.1 mol/L Tris-HCl，1.5 mol/L NaCl，3% CTAB，pH 8.0；0.5mol/L氯化钙溶液；方法三DNA提取缓冲液：0.1 mol/L Tris，0.1 mol/L EDTA，1.5 mol/L NaCl，2%CTAB，pH 8.0；Bio TEKE 生产的 2× Power Taq PCR MasterMix；细菌和真菌通用引物27F，1492R，ITS1，ITS4由上海生工合成。 1.1.2 主要仪器
凝胶成像系统，英国Fire Read公司生产；超纯水制备系统，美国Millipore公司产；VELOCITY 18R 台式冷冻离心机，澳大利亚Dynamica公司生产；双模块PCR仪，新加坡Bio-Rad公司产品；电泳仪，中国北京市六一仪器厂公司生产；电热恒温水槽，中国上海一恒科技有限公司生产；涡旋混合器，Qilinbeier公司生产；超微量紫外分光光度计，美国Nanodrop公司生产。
1.1.3 土样采集
土样采自海南儋州市宝岛新村、广西武鸣县培桂村和广东乐昌农科所香蕉种植地，取回实验室后放置在-40℃冰箱。土壤各项指标见表1。
1.2 方法
1.2.1 土壤微生物DNA提取
本研究采用3种方法，每种方法提取3种不同土壤样品DNA。
方法一：参照陈邦等[12]方法，使用冻干机冻干后并且研磨的土壤提取。
方法二：设计使用磁珠提取土壤DNA的方法。 取1 g冻干研磨土样放入2 mL离心管，加0.3 g玻璃珠和1 mL 15%硫酸铵铝溶液，在最大速度下匀化2 min，室温下12 000 r/min离心2 min，然后倾析上清液；加入1 mL腐殖质去除溶液，在最大速度下匀化2 min，室温下12 000 r/min离心2 min，然后倾析上清液；加入氯化钙溶液，以最大速度匀浆2 min，室温下12 000 r/min离心2 min，然后倾析上清液；加入DNA提取缓冲液800 μL，以最大速度均质5 s，加200 μL SDS，上下混合，并在65℃下孵育20 min，12 000 r/min离心5 min；取上清液，放冷至室温后，沿管壁加人0.6倍体积异丙醇立即混匀，然后加人 10 μL磁珠溶液涡旋30 s，置于磁力架上磁分离，吸除废液；依次加人500 μL 70% 乙醇、预冷的无水乙醇，室温晾干后加人50 μL TE洗脱，加入RNAase，37℃下水浴10 min，置于磁力架吸附得到DNA提纯液体。
方法三：参照林先贵[13]的方法，使用冻干研磨土并改良提取缓冲液。DNA提取缓冲液：0.1 mol/L Tris，0.1 mol/L EDTA，1.5 mol/L NaCl，2% CTAB，pH 8.0。
1.2.2 土壤微生物总DNA浓度及纯度测定
使用美国Nanodrop 公司生产的超微量紫外分光光度计检测。
1.2.3 土壤微生物基因组16S rDNA基因扩增和ITS rDNA基因扩增
细菌引物为通用引物27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）[13]，1492R（5'-TACGGCTACTTA CGACT
T-3'）。真菌引物为通用引物ITS1（5'-GGACTACNNGGGTATCTAAT-3'），ITS4（5'-GGACTACNNGGGTATCTAAT -3'）。细菌及真菌PCR扩增体系：Taq PCR MasterMix 12.5 μL，引物各1 μL，土壤微生物总DNA 1 μL，加超纯水至 25 μL。细菌PCR扩增程序：94℃ 5 min； 94℃ 44 s，57℃退火60 s，72℃ 2 min，30个循环；72℃ 5 min。真菌PCR扩增程序：94℃ 4 min； 94℃ 30 s，58℃退火50 s，72℃ 1 min，35个循环；72℃ 10 min。凝胶电泳检测。
1.3 数据处理
使用Microsoft Excel处理数据，Microsoft PowerPoint制图。
2 结果与分析
2.1 提取土壤DNA的浓度与纯度
在土壤样品提取过程中，DNA很容易受到重金属、腐植酸、酚类物质等的污染。通常检测DNA样品纯度的指标有A260/A280和A260/A230比值，其中A260/A280比值主要用来检测蛋白质和酚等物质的污染情况，理想比值是1.8，小于1.7时表明有蛋白质或酚污染，大于2.0时表明可能有异硫氰酸残存；A260/A230比值主要用来检测碳水化合物、盐类或有机物等杂质污染情况，理想比值是2.5，若比值小于2.0，表明样品被碳水化合物、盐类或有机溶剂污染。如表2所示，3种方法提取的DNA均受到不同程度的蛋白质、酚、碳水化合物、盐类或有机溶剂污染。方法一提取DNA浓度较高；方法二使用时间最短，提取DNA浓度低；方法三提取DNA浓度最低，因为方法三过程处理步骤较多，造成了核酸的损失，纯度最高（表2）。
2.2 总DNA质量检测
土壤微生物 DNA 的电泳检测结果（图1）可以看出，利用方法一提取到的同种土壤样本的微生物基因组DNA有条带，但是不清晰，是受到腐殖质等的影响。方法二及三未出现条带，可能是DNA含量过低。
2.3 土壤微生物基因组16S rDNA基因扩增
从土壤中提取的微生物总DNA中常有腐植酸等的污染，抑制DNA聚合酶的活性，最终导致土壤微生物基因组PCR扩增无法进行。土壤微生物16S rDNA基因的扩增结果（图2）显示，方法二、三提取到的土壤微生物DNA未经进一步纯化可扩增出16S rDNA基因。
2.4 土壤微生物基因組ITS rDNA基因扩增
如图3所示，方法一和方法二均未扩增到真菌DNA，方法三提取到的土壤微生物DNA未经进一步纯化可扩增出ITS rDNA基因。结果显示，土壤微生物基因组ITS rDNA基因扩增比16S rDNA基因扩增更易受到腐植酸等污染影响。结果进一步说明，方法三能适用于土壤微生物多样性的下一步实验。
2.5 提取方法的稳定性与应用性
本研究优化了方法三预处理方式与裂解方法。利用方法三提取3个不同土壤样品DNA，进行细菌和真菌基因扩增，所提DNA均可扩增。可知方法三所提取DNA具有一定的稳定性与应用性。 3 讨论
随着宏基因组学和分子生物学技术的快速发展，从土壤中获得高纯度、高得率和完整性好的总DNA 是在基因水平上研究土壤微生物群落多样性的基础[14-15]。从土壤中提取微生物总DNA主要有两步：（1）土壤微生物的裂解；（2）DNA 杂质的去除。土壤微生物裂解是为了提取DNA，陆文利等[16]为了提高土壤微生物的提取率，增加了土壤微生物的裂解次数，但是提取次数的增加代表大量时间的增加，本文为了节约时间，未采用该方法。
在土壤微生物的裂解这一步，本文3种方法均采用直接裂解法提取DNA，从土壤中直接裂解微生物以获取总微生物DNA与细胞分离提取法比较，其优势在于微生物种类采集较多；其缺点在于这样得到的DNA含有较多影响后续研究的腐殖质、重金属离子等[17]。方法一采用溶菌酶、SDS和冻融法；方法二采用CTAB和SDS；方法三结合CTAB、SDS和溶菌酶裂解土壤微生物。方法三可以进行细菌和真菌基因扩增，说明将CTAB、SDS和溶菌酶结合裂解土壤微生物较好。
在DNA杂质去除这一步，主要是前期预处理和后期纯化。对土壤样品进行预处理，可以达到去除腐植酸等污染的目的，陈邦等[12]使用磷酸钠缓冲液PBS洗涤土样2次；赵勇等[18]在微生物细胞裂解前采用TENP 缓冲液、PBS缓冲液对土壤样品进行了2次洗涤；王澍等[19]采用 CaCO3悬浮液对样品进行预处理。后期纯化方式有CsCl密度梯度超速离心、层析、胶回收等。同时在土壤微生物DNA的获得过程中，土壤矿物类型、质地、有机质含量以及pH值等因素，均会影响DNA提取效率和质量[20-21]。方法一前期预处理是PBS缓冲液；方法二使用硫酸铵铝溶液、腐殖质去除溶液、氯化钙溶液3种溶液进行预处理；方法三前期预处理是进行冻干研磨，后期进行二次沉淀再纯化，可降低腐植酸等的影响。方法三与其他研究明显差异在前期预处理采用冻干研磨，冻干研磨是否对土壤微生物种类多样性有影响还需进一步研究。
实验结果显示，方法一提取DNA浓度较高，但是不能直接进行PCR扩增，可能原因为受到腐植酸等的影响，方法一有大量腐植酸等的污染，提取时间长，方法繁琐。方法二只能进行16S rDNA PCR扩增，可能原因是ITS rDNA PCR比16S rDNA PCR更易受到腐植酸等污染的影响，方法二提取DNA有轻微污染。综合来看，方法三最好，方法三进行前期预处理为冻干研磨；土壤微生物的裂解使用CTAB、SDS和溶菌酶结合方法；后期纯化方法为二次沉淀纯化，与其他方法不同，从而加强抑制腐殖质、重金属离子等污染，提高DNA纯度，提取DNA可以进行土壤微生物基因组16S rDNA基因扩增和ITS rDNA基因扩增。与本研究以外的方法相比，方法三纯度较低，如果进一步提高纯度，可以采用胶回收或者吸附柱等方法。
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