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[摘要]目的调查分析本地区HBV P基因区的RT基因序列变异及基因型耐药情况。指导临床对核苷（酸）类似物的合理应用。方法对核苷（酸）类似物抗病毒治疗中出现HBV P基因区耐药的患者进行调查分析。结果LAM相关变异中，以rtM204V变异为主。ADV相关变异中，以rtA181V位点变异为主。181A为拉米夫定和阿德福韦酯耐药发生的交叉位点。结论在长期应用NA抗病毒治疗时，定期检测HBV-DNA，并对出现病毒学突破的病例进行HBV P基因耐药检测，依据检测结果实行个体化治疗，避免无效治疗。
关键词：乙肝核苷（酸）类似物P基因区耐药变异
中图分类号：R511 文献标识码：B 文章编号：1004-7484（2011）11-0222-03
HBV P基因区表达HBV聚合酶，NA抗病毒作用是因为可以抑制聚合酶的活性，因此HBV P区基因位点变异可引起相关NA的耐药导致治疗无效。通过检测这些与耐药相关的基因位点是否存在变异，就可断定治疗中的HBV是否产生了耐药性。耐药基因监测早期发现乙肝病毒耐药变异对于临床给予有效的挽救治疗，包括撤换或增加其他NA具有重要意义。
1材料与方法
1.1 研究对象来源及入选标准
2009年7月21日～2011年2月10日潍坊地区各医院门诊及住院的乙肝患者，符合2005版《慢性乙型肝炎防治指南》诊断标准，HBsAg阳性、患者在服用核苷（酸）类似物过程中，发生了病毒学突破或者不充分病毒学应答。
1.2 主要检测项目和方法
HBV P区变异检测：HBV P区耐药变异检测试剂盒：美国ABI BigDye 3.1 测序试剂盒，日本TaKaRa生物公司的ExTaq酶。仪器为美国ABI 310遗传分析仪，采用基因直接测序法，检测已知的核苷（酸）类似物相关HBV P区变异。本次研究检测HBV P基因RT区已知的13个耐药基因位点：80、169、173、180、181、184、194、202、204、233、236、241、250位点。
1.3 统计学分析
用SPSS16.0软件进行统计分析。符合正态分布的计量指标用均数±标准差(x±S)来表示。
2结果
2.1 病人资料
在接受抗病毒药物治疗前，患者的年龄、性别以及HBeAg等基本情况，见表1。
表174例CHB患者治疗前基本资料
年龄
(岁） 性别(
例数) HBeA
g(例数) ALT(
U/L) HBV-DN
A(log
10copies/
ml) 肝
硬
化
男 女 阳性 阴性
38.1±11.3 42 32 39 35 95±18.5 7.8±2.4 无
2.2 HBV PCR产物扩增产物直接测序法检测结果
HBV P基因区阳性的样本共60例，阳性率为81.1%（60/74）。拉米夫定相关50例，阳性率为87.7%（50/57），ADV相关变异共检出10例，阳性率为58.8%（10/17），见表2。
表2HBV PCR 产物扩增测序结果
药物 耐药例数 阳性率(%)
拉米夫定 50 87.7
阿德福韦酯 10 58.8
替比福定 0 0
恩替卡韦 0 0
合计 60 81.1
2.3 拉米夫定相关变异
本研究共检测出拉米夫定相关的耐药点有5个，5个突变位点了组合10种模式。92%（23/25）rtM204V伴有rtL180M，25%（4/16）rtM204I伴有rtL180M，21.9%（7/32）rtM204+rtL180M伴有rtV173L变异，见表3。
表350例拉米夫定相关突变的模式及构成情况
变异模式 耐药情况 例数 构成比（%）
rtM204V+rtL180M LAM耐药，LdT耐药，ETV敏感性下降 15 30
rtM204I LAM耐药，LdT耐药 11 22
rtM204V+rtV173L+rtL180M LAM耐药，LdT耐药，ETV敏感性下降 7 14
rtM204V/I+rtL180M LAM耐药，LdT耐药，ETV敏感性下降 5 10
rtM204I+rtL180M LAM耐药，LdT耐药，ETV敏感性下降 4 8
rtM204V LAM耐药，LdT耐药 2 4
rtM204V/I LAM耐药，LdT耐药 2 4
rtA181T LAM耐药，ADV耐药 2 4
rtM204I+rtV173L LAM耐药，LdT耐药 1 2
rtM204V+rtL180M+rtT184S LAM耐药，LdT耐药，ETV敏感性下降 1 2
2.4 ADV相关变异
本研究共检测出ADV相关的耐药点有2个，2个突变位点组合了4种模式。rtA181V变异共6例（60%），其中（3/6）伴有rtN236T，见表4。
表410例阿德福韦酯相关突变的模式及构成情况
变异模式 耐药情况 例数 构成比（%）
rtA181V+rtN236T ADV耐药 3 30
rtA181V ADV耐药 3 30
rtN236T ADV耐药 2 20
rtA181T LAM耐药， ADV耐药 2 20
2.5 拉米夫定和阿德福韦酯耐药位点的比较
HBV P基因位点181A为拉米夫定和阿德福韦酯耐药发生的重合位点。变异为181T时表现为LAM和ADV的双重耐药。变异为181V时仅发生ADV耐药。
2.6 核苷（酸）类似物耐药情况
通过耐药基因分析显示，与LAM和ADV相关HBV的基因发生了耐药突变。本文60个病例均未服用过替比夫定和恩替卡韦。由于有些变异位点表现NA交叉耐药，LAM的相关基因（rtA181T除外）变异也导致了LdT的耐药发生，替比夫定对LAM相关变异的耐药率为96%（48/50）；LAM相关变异（rtM204V/I+rtL180M）会造成ETV的抗病毒敏感性下降，发生率为10%（5/50）。
2.7 耐药变异后的病毒学特征
拉米夫定常见突变的模式间HBV-DNA、ALT、TBIL差异无统计学意义（p=0.504），见表5。
表550例拉米夫定5种常见突变的模式HBV-DNA、ALT、TBIL
变异模式 HBV-DNA
(log10 copies/ml) ALT
(U/L) TBIL
(mmol/l)
rtM204V+rtL180M 7.03±1.13 45±5.2 29±8.5
rtM204I 6.92±0.95 51±4.8 26±7.8
rtM204V+rtV173L+rtL180M 7.17±1.12 48±6.0 31±8.7
rtM204V/I+rtL180M 6.85±1.21 53±5.7 28±6.2
rtM204I+rtL180M 6.76±0.98 50±5.4 27±7.0
3讨论
3.1 拉米夫定
1998年底美国批准用于慢性乙型肝炎病毒抗病毒治疗，是治疗CHB的第一个NA。1999年拉米夫定作为一类新药在中国上市。目前研究发现与拉米夫定耐药相关的变异包括rtM204V/I，rtL180M，rtV173L，rtA181T[1]等。与以往报道一致[1]，本次检测共发现了10种LAM相关耐药组合模式，rtM204V+rtL180M和rtM204I的组合模式所占比例最高。检测的耐药患者50例中有48例样本存在位点rtM204变异，说明LAM相关的耐药在潍坊地区主要以rtM204为突变位点。单位点的rtM204V变异HBV复制能力较弱，存在该位点变异的HBV复制能力要提高，需要其他位点补偿变异：rtL180M或rtV173L。本次检测的rtM204V变异株伴rtL180M变异的占92%（23/25）。rtM240I 26.7%（4/15）伴rtL180M，与体外结果一致。有1例rtV173L在rtL180M+rtM240V/I联合变异基础上出现。一般rtV173L在rtL180M+rtM240V/I联合变异基础上出现，1例rtM204I+rtV173L和有2例不伴有rtL180M的rtM204V出现，推测可能是有本次测定外的其他变异存在，有待进一步研究。拉米夫定5种常见突变的模式间HBV-DNA、ALT、TBIL水平无差异（p=0.504）。
3.2 阿德福韦酯
2005年在中国上市。患者产生拉米夫定耐药后，阿德福韦酯是目前临床进行挽救治疗的首选药物。研究报道，对拉米夫定耐药后，加用阿德福韦酯，可以提高疗效，同时可以降低阿德福韦酯的耐药率。阿德福韦酯是阿德福韦的前体，在胃肠吸收后转变成有抗病毒作用阿德福韦。报道的ADV相关主要耐药变异为rtA181V、rtN236T，这两个耐药变异单独或联合均可出现。本次检测的10例ADV相关耐药变异中，共检测到6例（40%）rtA181V，与以往报道一致[2]。2例（20%）与ADV相关的rtA181T的出现与以往报道相比偏高，可能与样本量少有关，有待扩大样本进一步研究。
3.3 替比夫定
研究证实rtM204I、rtM204V+rtL180M变异均使LdT的敏感性下降。本研究无LdT服药病例，因为交叉耐药问题，凡是出现rt M 204I位点变异的，核苷酸类似物相关HBV P基因分析结果均为耐药。这与以往报道一致[3]。
3.4 恩替卡韦
2005年在中国上市。目前研究显示，在rtM204V+rtL180M变异基础之上，至少再联合rtT184\rtS202或rtM250中的一点变异，才可产生ETV耐药相关变异。本次研究中LAM抗病毒治疗者中发生了rtM204V+rtL180M变异，虽未导致ETV的基因型耐药，但为以后的ETV抗病毒治疗埋下隐患，应用此类药物时应加强核苷酸类似物相关HBV P基因耐药的检测分析。
参考文献
[1]赵卫峰,邵幼林,甘建和,等.拉米夫定耐药HBV毒株RT区变异分析[J].中国实用内科杂志,2008,28(2):119～121.
[2]刘峰,王磊,王丽娜,等.阿德福韦酯治疗慢性乙型肝炎过程中发生病毒突破患者的（HBV）P基因变异分析[J].山东大学学报（医学版）,2008,46(4):407～410.
[3] Maria Seifer, April Patty, Ilaria Serra, et al. Telbivudine, a nucleoside analog inhibitor of HBV polymerase, has a different in vitro cross-resistance profile than the nucleotide analog inhibitors adefovir and tenofovir[J].Antiviral Research, 2009,81(2):147～155.
关键词：乙肝核苷（酸）类似物P基因区耐药变异
中图分类号：R511 文献标识码：B 文章编号：1004-7484（2011）11-0222-03
HBV P基因区表达HBV聚合酶，NA抗病毒作用是因为可以抑制聚合酶的活性，因此HBV P区基因位点变异可引起相关NA的耐药导致治疗无效。通过检测这些与耐药相关的基因位点是否存在变异，就可断定治疗中的HBV是否产生了耐药性。耐药基因监测早期发现乙肝病毒耐药变异对于临床给予有效的挽救治疗，包括撤换或增加其他NA具有重要意义。
1材料与方法
1.1 研究对象来源及入选标准
2009年7月21日～2011年2月10日潍坊地区各医院门诊及住院的乙肝患者，符合2005版《慢性乙型肝炎防治指南》诊断标准，HBsAg阳性、患者在服用核苷（酸）类似物过程中，发生了病毒学突破或者不充分病毒学应答。
1.2 主要检测项目和方法
HBV P区变异检测：HBV P区耐药变异检测试剂盒：美国ABI BigDye 3.1 测序试剂盒，日本TaKaRa生物公司的ExTaq酶。仪器为美国ABI 310遗传分析仪，采用基因直接测序法，检测已知的核苷（酸）类似物相关HBV P区变异。本次研究检测HBV P基因RT区已知的13个耐药基因位点：80、169、173、180、181、184、194、202、204、233、236、241、250位点。
1.3 统计学分析
用SPSS16.0软件进行统计分析。符合正态分布的计量指标用均数±标准差(x±S)来表示。
2结果
2.1 病人资料
在接受抗病毒药物治疗前，患者的年龄、性别以及HBeAg等基本情况，见表1。
表174例CHB患者治疗前基本资料
年龄
(岁） 性别(
例数) HBeA
g(例数) ALT(
U/L) HBV-DN
A(log
10copies/
ml) 肝
硬
化
男 女 阳性 阴性
38.1±11.3 42 32 39 35 95±18.5 7.8±2.4 无
2.2 HBV PCR产物扩增产物直接测序法检测结果
HBV P基因区阳性的样本共60例，阳性率为81.1%（60/74）。拉米夫定相关50例，阳性率为87.7%（50/57），ADV相关变异共检出10例，阳性率为58.8%（10/17），见表2。
表2HBV PCR 产物扩增测序结果
药物 耐药例数 阳性率(%)
拉米夫定 50 87.7
阿德福韦酯 10 58.8
替比福定 0 0
恩替卡韦 0 0
合计 60 81.1
2.3 拉米夫定相关变异
本研究共检测出拉米夫定相关的耐药点有5个，5个突变位点了组合10种模式。92%（23/25）rtM204V伴有rtL180M，25%（4/16）rtM204I伴有rtL180M，21.9%（7/32）rtM204+rtL180M伴有rtV173L变异，见表3。
表350例拉米夫定相关突变的模式及构成情况
变异模式 耐药情况 例数 构成比（%）
rtM204V+rtL180M LAM耐药，LdT耐药，ETV敏感性下降 15 30
rtM204I LAM耐药，LdT耐药 11 22
rtM204V+rtV173L+rtL180M LAM耐药，LdT耐药，ETV敏感性下降 7 14
rtM204V/I+rtL180M LAM耐药，LdT耐药，ETV敏感性下降 5 10
rtM204I+rtL180M LAM耐药，LdT耐药，ETV敏感性下降 4 8
rtM204V LAM耐药，LdT耐药 2 4
rtM204V/I LAM耐药，LdT耐药 2 4
rtA181T LAM耐药，ADV耐药 2 4
rtM204I+rtV173L LAM耐药，LdT耐药 1 2
rtM204V+rtL180M+rtT184S LAM耐药，LdT耐药，ETV敏感性下降 1 2
2.4 ADV相关变异
本研究共检测出ADV相关的耐药点有2个，2个突变位点组合了4种模式。rtA181V变异共6例（60%），其中（3/6）伴有rtN236T，见表4。
表410例阿德福韦酯相关突变的模式及构成情况
变异模式 耐药情况 例数 构成比（%）
rtA181V+rtN236T ADV耐药 3 30
rtA181V ADV耐药 3 30
rtN236T ADV耐药 2 20
rtA181T LAM耐药， ADV耐药 2 20
2.5 拉米夫定和阿德福韦酯耐药位点的比较
HBV P基因位点181A为拉米夫定和阿德福韦酯耐药发生的重合位点。变异为181T时表现为LAM和ADV的双重耐药。变异为181V时仅发生ADV耐药。
2.6 核苷（酸）类似物耐药情况
通过耐药基因分析显示，与LAM和ADV相关HBV的基因发生了耐药突变。本文60个病例均未服用过替比夫定和恩替卡韦。由于有些变异位点表现NA交叉耐药，LAM的相关基因（rtA181T除外）变异也导致了LdT的耐药发生，替比夫定对LAM相关变异的耐药率为96%（48/50）；LAM相关变异（rtM204V/I+rtL180M）会造成ETV的抗病毒敏感性下降，发生率为10%（5/50）。
2.7 耐药变异后的病毒学特征
拉米夫定常见突变的模式间HBV-DNA、ALT、TBIL差异无统计学意义（p=0.504），见表5。
表550例拉米夫定5种常见突变的模式HBV-DNA、ALT、TBIL
变异模式 HBV-DNA
(log10 copies/ml) ALT
(U/L) TBIL
(mmol/l)
rtM204V+rtL180M 7.03±1.13 45±5.2 29±8.5
rtM204I 6.92±0.95 51±4.8 26±7.8
rtM204V+rtV173L+rtL180M 7.17±1.12 48±6.0 31±8.7
rtM204V/I+rtL180M 6.85±1.21 53±5.7 28±6.2
rtM204I+rtL180M 6.76±0.98 50±5.4 27±7.0
3讨论
3.1 拉米夫定
1998年底美国批准用于慢性乙型肝炎病毒抗病毒治疗，是治疗CHB的第一个NA。1999年拉米夫定作为一类新药在中国上市。目前研究发现与拉米夫定耐药相关的变异包括rtM204V/I，rtL180M，rtV173L，rtA181T[1]等。与以往报道一致[1]，本次检测共发现了10种LAM相关耐药组合模式，rtM204V+rtL180M和rtM204I的组合模式所占比例最高。检测的耐药患者50例中有48例样本存在位点rtM204变异，说明LAM相关的耐药在潍坊地区主要以rtM204为突变位点。单位点的rtM204V变异HBV复制能力较弱，存在该位点变异的HBV复制能力要提高，需要其他位点补偿变异：rtL180M或rtV173L。本次检测的rtM204V变异株伴rtL180M变异的占92%（23/25）。rtM240I 26.7%（4/15）伴rtL180M，与体外结果一致。有1例rtV173L在rtL180M+rtM240V/I联合变异基础上出现。一般rtV173L在rtL180M+rtM240V/I联合变异基础上出现，1例rtM204I+rtV173L和有2例不伴有rtL180M的rtM204V出现，推测可能是有本次测定外的其他变异存在，有待进一步研究。拉米夫定5种常见突变的模式间HBV-DNA、ALT、TBIL水平无差异（p=0.504）。
3.2 阿德福韦酯
2005年在中国上市。患者产生拉米夫定耐药后，阿德福韦酯是目前临床进行挽救治疗的首选药物。研究报道，对拉米夫定耐药后，加用阿德福韦酯，可以提高疗效，同时可以降低阿德福韦酯的耐药率。阿德福韦酯是阿德福韦的前体，在胃肠吸收后转变成有抗病毒作用阿德福韦。报道的ADV相关主要耐药变异为rtA181V、rtN236T，这两个耐药变异单独或联合均可出现。本次检测的10例ADV相关耐药变异中，共检测到6例（40%）rtA181V，与以往报道一致[2]。2例（20%）与ADV相关的rtA181T的出现与以往报道相比偏高，可能与样本量少有关，有待扩大样本进一步研究。
3.3 替比夫定
研究证实rtM204I、rtM204V+rtL180M变异均使LdT的敏感性下降。本研究无LdT服药病例，因为交叉耐药问题，凡是出现rt M 204I位点变异的，核苷酸类似物相关HBV P基因分析结果均为耐药。这与以往报道一致[3]。
3.4 恩替卡韦
2005年在中国上市。目前研究显示，在rtM204V+rtL180M变异基础之上，至少再联合rtT184\rtS202或rtM250中的一点变异，才可产生ETV耐药相关变异。本次研究中LAM抗病毒治疗者中发生了rtM204V+rtL180M变异，虽未导致ETV的基因型耐药，但为以后的ETV抗病毒治疗埋下隐患，应用此类药物时应加强核苷酸类似物相关HBV P基因耐药的检测分析。
参考文献
[1]赵卫峰,邵幼林,甘建和,等.拉米夫定耐药HBV毒株RT区变异分析[J].中国实用内科杂志,2008,28(2):119～121.
[2]刘峰,王磊,王丽娜,等.阿德福韦酯治疗慢性乙型肝炎过程中发生病毒突破患者的（HBV）P基因变异分析[J].山东大学学报（医学版）,2008,46(4):407～410.
[3] Maria Seifer, April Patty, Ilaria Serra, et al. Telbivudine, a nucleoside analog inhibitor of HBV polymerase, has a different in vitro cross-resistance profile than the nucleotide analog inhibitors adefovir and tenofovir[J].Antiviral Research, 2009,81(2):147～155.