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〔摘要〕 目的 采用網络药理学方法及分子对接技术探讨鬼箭羽治疗糖尿病肾病（diabetic kidney disease， DKD）的作用机制。方法 通过文献查找、TCMSP数据库、BATMAN-TCM数据库及TCM@TAIWAN中医数据库筛选鬼箭羽主要成分及作用靶点，在Drugbank、TTD、OMIM、GeneCards数据库获取DKD相关靶点，利用Cytoscape软件分别构建“中药-成分-靶点”“中药-成分-靶点-疾病”相互作用网络;运用STRING数据库构建蛋白互作网络，并根据拓扑学参数筛选鬼箭羽治疗DKD的关键靶点;对关键靶点进行GO功能富集和KEGG通路分析，并构建“成分-靶点-通路”网络图，运用AutoDock Tools和Pymol将得到的主要活性成分与关键靶点进行分子对接。结果 共获得鬼箭羽有效成分14个，作用于564个潜在靶点，DKD靶点1 106个，拓扑分析得到关键靶点41个，其中度值大于50的靶点有23个，包括IL-6、TNF、AKT1、VEGFA等。GO功能富集分析得到生物过程主要涉及氧化物的反应、活性氧的调控、细胞凋亡的调控等;KEGG通路富集分析主要包括AGE-RAGE信号通路、流体剪切应力与动脉粥样硬化、TNF信号通路等。分子对接结果显示，槲皮素、山柰酚、β-谷甾醇、木犀草素与4个核心靶点均具有较好的结合活性。结论 鬼箭羽可能通过槲皮素、山柰酚、β-谷甾醇、木犀草素等多种活性成分作用于多个靶点，参与调节多条信号通路，发挥抗炎、抗氧化应激、抗缺氧、抑制细胞凋亡以及改善肾血流动力学等作用，从而保护肾功能，延缓糖尿病肾病的进展。
〔关键词〕 鬼箭羽;糖尿病肾病;网络药理学;分子对接;槲皮素;山柰酚;β-谷甾醇;木犀草素
〔中图分类号〕R285.5 〔文献标志码〕A 〔文章编号〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2021.10.017
Mechanism of Ramulus Euonymi in Treatment of Diabetic Nephropathy Based on Network Pharmacology and Molecular Docking
BU Xianghui， AN Haiyan*， AN Xiaona， ZHANG Chengcheng， GUO Xiaoyuan
（Dongfang Hospital of Beijing University of Chinese Medicine， Beijing 100029， China）
〔Abstract〕 Objective To explore the mechanism of Ramulus Euonymi in the treatment of diabetic dephropathy （DKD） based on network pharmacology and molecular docking technology. Methods The main components and targets of Ramulus Euonymi were screened by literature search， TCMSP database， BATMAN-TCM database and TCM@TAIWAN TCM database. The targets of DKD were obtained from the databases of Drugbank， TTD， OMIM and GeneCards. The interaction network of "drug-component-target" and “drug-component-target-disease” were constructed by Cytoscape. The protein interaction network was constructed by STRING platform， and the key targets for the treatment of DKD were screened according to the topological parameters. GO function enrichment and KEGG pathway analysis were carried out for key targets， and the "component-target-pathway" network was constructed. The main components obtained were docked with the key targets by AutoDock Tools and Pymol. Results A total of 14 active components were obtained， which acted on 564 targets， 1 106 DKD targets， 41 key targets were obtained by topological analysis， among them， there were 23 targets with a degree greater than 50， including IL-6， TNF， AKT1， VEGFA， etc. GO function enrichment analysis showed that biological processes were mainly involved oxide response， regulation of reactive oxygen species， regulation of apoptosis， etc. KEGG pathway enrichment analysis mainly included AGE-RAGE signal pathway， fluid shear stress and atherosclerosis， TNF signal pathway， etc. The results of molecular docking showed that quercetin， kaempferol， β-sitosterol and luteolin all had good binding activity to the four core targets. Conclusion Ramulus Euonymi may act on multiple targets and regulate multiple signal pathways through many active components such as quercetin， kaempferol， β-sitosterol and luteolin， playing anti-inflammation， antioxidant stress， anti-hypoxia， inhibition of apoptosis and improvement of renal hemodynamics， so as to protect renal function and delay the progress of DKD. 〔Keywords〕 Ramulus Euonymi; diabetic nephropathy; network pharmacology; molecular docking; quercetin; kaempferol; β-sitosterol; luteolin
糖尿病肾病（diabetic kidney disease， DKD）是糖尿病主要微血管并发症之一，也是导致终末期肾脏病（end-stage renal disease， ESRD）的主要原因[1]。在我国，DKD所占慢性肾脏病（chronic kidney disease， CKD）比例已经超过慢性肾小球肾炎，成为住院患者中慢性肾脏病的首要病因[2]。目前，DKD的发病机制尚不完全清楚，已被证明的机制包括肾小球血流动力学改变、肾素-血管紧张素-醛固酮系统（RAAS）过度活跃、氧化应激的增加、足细胞自噬和遗传以及表观遗传失调等[3]，最终引起肾小球基底膜增厚、系膜基质增生及肾脏纤维化。临床针对DKD的治疗以降糖、降压、降脂及改善生活方式为主，但仍不能完全阻断DKD的进程，部分患者仍可能发展为ESRD。随着传统中医药的发展，在西医治疗的基础上通过合理应用中医药而延缓甚至阻止疾病的发展显得尤为重要。
DKD属于中医学“肾消病”或“消渴病肾病”范畴，其基本病机为消渴病日久，治不得法，伤阴耗气，痰、热、郁、瘀互相积聚于肾之络脉，形成“微型癥瘕”，而导致肾体受损、肾用失司的虚实夹杂之证[4]。鬼箭羽始载于《神农本草经》，味苦，性寒，善下行，具有破血通经、解毒消肿的功效，主治癥瘕结块、心腹疼痛、瘀滞痈肿等。Meta分析[5]示，临床应用含有鬼箭羽的中成药或复方合剂治疗DKD疗效显著。多项临床试验[6-7]表明，鬼箭羽单药可降低尿蛋白、保护肾小管上皮细胞、减少细胞外基质的沉积，从而延缓肾小球硬化，对防治DKD具有独特的优势。本研究采用网络药理学及分子对接技术探索鬼箭羽的主要化学成分、核心靶点以及与DKD之间的相互关系，为进一步阐明鬼箭羽治疗DKD的作用机制提供思路和理论基础。
1 资料与方法
1.1 数据库与软件
全文涉及的数据库、分析平台及与软件来源：中药系统药理学分析平台（TCMSP， http：//www.tcmspw.com/tcmsp.php）;中医分子机制生物信息学分析工具（BATMAN-TCM， http：//bionet.ncpsb.org.cn/batman-tcm）;中医药数据库（TCM@TAIWAN， http：//tcm.cmu.edu.tw/zh-tw/）;有机小分子生物活性数据库（PubChem， https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）;通用蛋白质数据库（Uniprot， http：//www.uniprot.org）;小分子结构数据库（ZINC15， http：//zinc15.docking.org）;蛋白结构数据库（RCSB PDB， http：//www.rcsb.org）;药物靶标数据库（TTD， http：//db.idrblab.net/ttd/）;人类基因数据库（GeneCards， https：//www.genecards.org/）;药物银行数据库（DrugBank， http：//www.Drugbank.ca/）;在线人类孟德尔遗传数据库（OMIM; http：//www.Omim.org/）;网络在线绘图软件Venny2.1（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）;STRING数据库（https：//string-db.org/）;在线云平台OmicShare网站（https：//www.omicshare.com/）;网络拓扑属性分析软件Cytoscape 3.7.1（http：//cytoscape.org/）;分子对接软件AutoDock4.2.6/AutoDock
Tools1.5.6（http：//autodock.scripps.edu）;分子对接可视化软件Pymol（http：//pymol.org/2/）。
1.2 鬼箭羽活性成分获取及靶点筛选
以“鬼箭羽”“卫矛”和“Ramulus Euonymi”为检索词条分别在TCMSP、BATMAN-TCM、TCM@TAIWAN数据库进行搜索，以生物利用度（OB）≥30%和类药性（DL）≥0.18为条件[8]，并结合相关文献报道筛选出有效成分及作用靶点，将有效成分导入ZINC15数据库，保存有效成分的mol2式;利用Uniprot数据库的对靶点进行蛋白名称标准化，通过Cytoscape构建“中药-成分-靶点”网络。
1.3 DKD靶点及交集靶点获取
在TTD、OMIM、DrugBank、GeneCards数据库中，以“diabetic nephropathy”和“nephropathy，diabetic”为检索词条，搜索DKD靶点，利用在线绘图软件Venny将总疾病靶点和鬼箭羽的作用靶点取交集，即得鬼箭羽治疗DKD的潜在作用靶点。
1.4 “中药-成分-靶点-疾病”网络的构建及分析
将鬼箭羽有效成分及与DKD的共同靶点导入Cytoscape，构建“中药-成分-靶点-疾病”网络，利用Cytoscape中NetworkAnalyzer对网络进行分析获取相关拓扑参数。
1.5 蛋白质相互作用（PPI）网络构建及关键靶点筛选
将共同靶点导入STRING数据库，蛋白种类设置为“homo sapiens”，置信度“medium confidence”设置为0.4，隐藏网络中无关联节点，输出TSV格式文件，并导入Cytoscape，对网络进行拓扑分析，以degree（自由度）、betweenness centrality（介度中心性）、closeness centrality（接近中心性）均大于或等于中位数，average shortest path length（平均最短路径长度）小于或等于中位數为筛选条件，获取关键靶点。 1.6 GO富集分析和KEGG通路分析
利用Cytoscape中ClueGO插件对关键靶点进行GO富集分析，选择“Biological Process”，设置参数为P<0.05、Min Level为6、Max Level为8、Min Gene为7，进行可视化分析;将富集目的基因导入在线云平台Omicshare，背景基因选择“homo sapiens”，对关键靶点进行KEGG通路分析，以P<0.05为筛选条件，对排名前20的信号通路以柱状图形式表示，为进一步从信号通路角度分析鬼箭羽治疗DKD可能的作用机制，以P<0.01、富集基因数>10为筛选条件，并排除与DKD不相关的通路，在此基础上绘制“成分-靶点-通路”网络图。
1.7 鬼箭羽活性成分与关键靶点分子对接
选取“1.5”项中的核心靶点与“1.6”项“成分-靶点-通路”网络中度值排名靠前活性成分进行分子对接验证。通过RCSB PDB数据库获取关鍵基因的晶体结构，采用AutoDock Tools对靶蛋白添加非极性氢、删除水分子及小分子配体。将活性成分的mol2式导入AutoDockTools，添加原子电荷，分配原子类型，运行AutoDock和AutoGrid进行半柔对接，选取最低结合能的组合结果，并用Pymol2.4软件对结果进行可视化。一般而言，结合能<-5 kcal/mol说明可形成稳定的对接结构[9]，且所需结合能越低，则说明其结合构象越稳定。
2 结果
2.1 鬼箭羽主要活性成分靶点筛选结果
通过检索TCMSP、BATMAN-TCM、TCM@TAIWAN 3个中药数据平台共得到鬼箭羽有效成分38个，结合相关文献检索补充[10-11]，共筛选出鬼箭羽主要活性成分14个，其编号及ADME关键参数见表1。利用TCMSP数据库筛选出对应的靶点564个，通过Uniprot对蛋白名称标准化，去重整合后，得到鬼箭羽主要活性成分的作用靶点241个。利用Cytoscape绘制鬼箭羽“成分-靶点”网络图，在此网络中共有256个节点，578条边，见图1。
2.2 “中药-成分-靶点-疾病”网络构建
在TTD、OMIM、DrugBank及GeneCards数据库数据库中分别检索到22、251、110、879个DKD潜在靶点，去掉重复靶点后，得到1 106个DKD相关靶点，疾病靶点韦恩图见图2。将鬼箭羽主要成分的作用靶点与DKD疾病靶点取交集，得到97个共同靶点，见图3。利用Cytoscape构建鬼箭羽“中药-成分-靶点-疾病”网络图，见图4。该网络中共有节点123个，251条边。对网络进行拓扑分析，结果显示，度值排名前4的成分是槲皮素、山柰酚、β-谷甾醇和木犀草素。
2.3 PPI网络构建及关键靶点筛选
将97个共同靶点导入STRING数据库得到网络，如图5，此网络中共有97个节点，1 682条边。将TSV式文件导入Cytoscape，进行拓扑分析，获取鬼箭羽治疗DKD的关键靶点，并提取关键靶点相互作用网络图，见图6。
2.4 GO富集分析
运用ClueGO插件进行GO功能富集分析，构建生物过程网络图（见图7），共得到生物过程条目278条（P<0.05），其中P<0.01的条目有140条，显著性排名靠前的生物过程主要涉及含氧化物的反应、活性氧的调控、细胞凋亡的调控、细胞增殖的调节、脂质的反应等。
2.5 KEGG通路富集分析
通过Omicshare平台对关键靶点进行KEGG通路分析，共得到148条信号通路（P<0.05），其中显著富集P<0.01的有117条，根据P值由小到大筛选排名前20的通路绘制气泡图，见图8。以基因数>10个为筛选条件，并排除与DKD不相关的通路，最后确定了12条通路，包括AGE-RAGE信号通路、流体剪切应力与动脉粥样硬化、肿瘤坏死因子信号通路、白细胞介素-17信号通路、缺氧诱导因子-1信号通路等。根据成分、靶点与信号通路之间的联系，建立成分-靶点-通路网络图，见图9。在关键的AGE-RAGE信号通路上标注出鬼箭羽的作用位点，见图10。
2.6 分子对接
选择度值超过双倍均值的核心靶点（IL-6、TNF、AKT1、VEGFA）与“成分-靶点-通路”网络图中度值排名前4的化合物（槲皮素、山柰酚、β-谷甾醇、木犀草素）进行分子对接，选取最低结合能组合，见表2。使用Pymol进行绘图，展示前8个结合力较好的分子对接模式图，见图11。结果表明鬼箭羽主要化合物与4个靶蛋白的结合能均小于-5 kcal/mol，两者之间能够形成氢健，具有较强的结合能力。
3 讨论
鬼箭羽在《神农本草经》中列为木部中品，既可活血通络、推陈出新，又可清热坚阴、破血消癥，与现代研究认为的DKD的“虚”“瘀”等病因病机相一致[12]。国医大师吕仁和等[4]认为肾小球系膜细胞外基质的增生积聚，是一个由癥聚逐渐发展为癥积的过程，指出DKD治疗的关键应在活血化瘀的基础上，重视软坚散结之法。方用含鬼箭羽以期消癥化结，不仅缓解血络中已经形成的微型癥瘕，更可防止新的癥瘕形成，延缓疾病的发展。
本研究通过多个中药数据库筛选出鬼箭羽活性成分14个，其中槲皮素、山柰酚、β-谷甾醇和木犀草素可能是鬼箭羽治疗DKD的关键成分。张杰等[13]发现槲皮素能下调AngⅡ诱导下的系膜细胞的MCP-1的分泌，减少肾脏系膜增生;王兴红等[14]研究表明，槲皮素能通过抑制p38MAPK、NF-κB来减少炎症因子IL-8、TGF-β1表达，减少肾组织炎症反应，发挥抗纤维化作用。山柰酚具有良好的抗炎活性，能通过调节MAPK、AKT通路，抑制IL-1β、IL-6、CXCL8、TNF-α等炎症因子的表达，对肾功能具有保护作用，此外，山柰酚还能减少活性氧的生成并促进其清除，起到抗氧化应激和抗细胞凋亡的作用[15]。血脂代谢紊乱可直接或间接损害肾小球系膜细胞，进而促进DKD的发展[16]，动物实验表明，β-谷甾醇除可激活2型糖尿病大鼠脂肪组织中的IR和GLUT4来改善血糖，还可显著降低大鼠血清TC、TG，抑制脂质过氧化，调节脂代谢，降低全血黏度[17]。木犀草素属于黄酮类化合物，王超超等[18]发现，木犀草素可以抑制高糖诱导下肾小球系膜细胞过度增生，促进其凋亡，改善肾脏损伤，其机制可能与激活AMPK/SIRT-1/PGC-1α蛋白表达，从而发挥抗肾小球炎症反应、抗增生作用。本研究发现AMPK信号通路、TNF信号通路以及AKT信号通路是鬼箭羽治疗DKD的关键通路，基于分子对接结果，推测槲皮素、山柰酚、β-谷甾醇和木犀草素为鬼箭羽通过多途径协同治疗DKD的极具潜力的药效物质基础。 PPI网络拓扑分析显示，鬼箭羽治疗DKD的关键靶点有41个。包括IL-6、CXCL8、VEGFA、EGFR、ICAM-1、CXCL2等与炎症反应、免疫反应及血管生成相关的靶点，以及AKT1、MAPK1、MAPK8、MMP-9、CASP3等涉及细胞凋亡和细胞增殖的相关靶点。
IL-6、ICAM-1等诸多促炎症因子参与DKD病理生理过程，其中IL-6被认为是调控诸多慢性炎症进展和转归的关键基因[19]。DKD患者机体内IL-6水平明显升高，且随着蛋白尿程度的增加，IL-6水平也逐渐增加，提示DKD患者肾组织高水平表达的IL-6可能参与了DKD发生发展的病理生理过程[20]。有研究[21]表明，肾脏在受到某些抗原刺激后，系膜细胞可持续分泌IL-6，同样高糖和晚期糖基化产物均能诱导肾小管上皮细胞表达和分泌IL-6。AKT1是P13K下游的一个重要靶激酶，是PI3K/AKT信号传导途径的中心环节，参与DKD肾纖维化的病理过程[22]。VEGFA是血管内皮生长因子家族中主要影响微血管形成的细胞因子，而VEGFA的表达，可活化系膜细胞，增加基底膜通透性，使多种炎症因子渗出，加剧炎症反应和肾组织缺氧，而肾髓质过低的氧分压会刺激HIF产生，进而上调VEGF mRNA的转录[23]。张思泉等[24]研究表明，通过抑制ATF6/CHOP途径，下调Caspase-3表达，可减少内质网应激引起的细胞凋亡，保护肾组织。
KEGG富集分析结果显示多条通路与DKD有关。富集结果涉及炎症信号通路（AGE-RAGE信号通路、TNF信号通路、MAPK信号通路、IL-17信号通路等）、自噬-凋亡通路（PI3K-AKT信号通路、FoxO信号通路）和低氧诱导通路（HIF-1信号通路）等。AGEs-RAGE信号通路是DKD发生发展的关键环节，肾脏在持续高血糖环境中产生大量AGEs上调AGE受体（RAGE）表达，AGEs结合RAGE激活一系列信号通路，包括MAPK、JAK/STAT、Caspase-3/7、NF-κB等通路，引起大量黏附分子、生长因子和促炎因子（如IL-6、CXCL8、VEGFA、TNF-α、TGF-β1、CXCL2等）的表达和释放，其中IL-6、CXCL8、TNF-α等促进肾脏慢性炎症状态的建立;VEGFA在肾脏足突细胞过度表达，可增加血管的通透性，进而产生蛋白尿;TGF-β1可通过控制蛋白酶的合成与降解而导致肾小球细胞外基质的产生以及肾小管上皮间质化，造成肾脏组织纤维化，而TGF-β1以及VEGFA的表达又可上调系膜细胞CXCL2表达，促进单核细胞浸润，引起肾小球损伤，最终导致肾脏结构和功能逐渐丧失[25]。MAPK信号通路通过3级激酶级联反应，促进p38MAPK活化，通过促进炎症介质表达、干预细胞因子产生等途径而导致肾组织炎症性损伤以及肾纤维化，同时，p38MAPK信号通路激活还可进一步活化细胞凋亡因子Caspase-3引起足细胞凋亡[26]。本研究表明，MAPK信号通路中包含CASP3、TNF、IL-1B等关键基因，推测鬼箭羽可通过调控上述基因表达、参与调节MAPK信号通路，从而发挥抗炎、抗纤维化及抑制足细胞凋亡的作用，为后续探讨鬼箭羽治疗DKD的作用机制提供思路。在PI3K/AKT信号通路中，PI3K是该通路的起始因子，PTEN是该通路的关键负调节因子，AKT则是该通路的中心环节，AKT被活化后，能够通过调节GLUT-4、Fox O1、mTOR等的活性调控机体糖脂代谢、细胞自噬和凋亡、氧化应激水平，从而参与DKD的发生发展。
综上所述，鬼箭羽可能通过槲皮素、山柰酚、β-谷甾醇和木犀草素等主要活性成分，作用于IL-6、AKT1、VEGFA、CASP3等相关靶点，干预AGE-RAGE、PI3K-AKT、HIF-1、MAPK等信号通路，协作产生抗炎、抗缺氧、降低氧化应激、抗纤维化、抑制细胞凋亡及改善肾血流动力学等作用来防治DKD。
参考文献
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〔关键词〕 鬼箭羽;糖尿病肾病;网络药理学;分子对接;槲皮素;山柰酚;β-谷甾醇;木犀草素
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Mechanism of Ramulus Euonymi in Treatment of Diabetic Nephropathy Based on Network Pharmacology and Molecular Docking
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〔Abstract〕 Objective To explore the mechanism of Ramulus Euonymi in the treatment of diabetic dephropathy （DKD） based on network pharmacology and molecular docking technology. Methods The main components and targets of Ramulus Euonymi were screened by literature search， TCMSP database， BATMAN-TCM database and TCM@TAIWAN TCM database. The targets of DKD were obtained from the databases of Drugbank， TTD， OMIM and GeneCards. The interaction network of "drug-component-target" and “drug-component-target-disease” were constructed by Cytoscape. The protein interaction network was constructed by STRING platform， and the key targets for the treatment of DKD were screened according to the topological parameters. GO function enrichment and KEGG pathway analysis were carried out for key targets， and the "component-target-pathway" network was constructed. The main components obtained were docked with the key targets by AutoDock Tools and Pymol. Results A total of 14 active components were obtained， which acted on 564 targets， 1 106 DKD targets， 41 key targets were obtained by topological analysis， among them， there were 23 targets with a degree greater than 50， including IL-6， TNF， AKT1， VEGFA， etc. GO function enrichment analysis showed that biological processes were mainly involved oxide response， regulation of reactive oxygen species， regulation of apoptosis， etc. KEGG pathway enrichment analysis mainly included AGE-RAGE signal pathway， fluid shear stress and atherosclerosis， TNF signal pathway， etc. The results of molecular docking showed that quercetin， kaempferol， β-sitosterol and luteolin all had good binding activity to the four core targets. Conclusion Ramulus Euonymi may act on multiple targets and regulate multiple signal pathways through many active components such as quercetin， kaempferol， β-sitosterol and luteolin， playing anti-inflammation， antioxidant stress， anti-hypoxia， inhibition of apoptosis and improvement of renal hemodynamics， so as to protect renal function and delay the progress of DKD. 〔Keywords〕 Ramulus Euonymi; diabetic nephropathy; network pharmacology; molecular docking; quercetin; kaempferol; β-sitosterol; luteolin
糖尿病肾病（diabetic kidney disease， DKD）是糖尿病主要微血管并发症之一，也是导致终末期肾脏病（end-stage renal disease， ESRD）的主要原因[1]。在我国，DKD所占慢性肾脏病（chronic kidney disease， CKD）比例已经超过慢性肾小球肾炎，成为住院患者中慢性肾脏病的首要病因[2]。目前，DKD的发病机制尚不完全清楚，已被证明的机制包括肾小球血流动力学改变、肾素-血管紧张素-醛固酮系统（RAAS）过度活跃、氧化应激的增加、足细胞自噬和遗传以及表观遗传失调等[3]，最终引起肾小球基底膜增厚、系膜基质增生及肾脏纤维化。临床针对DKD的治疗以降糖、降压、降脂及改善生活方式为主，但仍不能完全阻断DKD的进程，部分患者仍可能发展为ESRD。随着传统中医药的发展，在西医治疗的基础上通过合理应用中医药而延缓甚至阻止疾病的发展显得尤为重要。
DKD属于中医学“肾消病”或“消渴病肾病”范畴，其基本病机为消渴病日久，治不得法，伤阴耗气，痰、热、郁、瘀互相积聚于肾之络脉，形成“微型癥瘕”，而导致肾体受损、肾用失司的虚实夹杂之证[4]。鬼箭羽始载于《神农本草经》，味苦，性寒，善下行，具有破血通经、解毒消肿的功效，主治癥瘕结块、心腹疼痛、瘀滞痈肿等。Meta分析[5]示，临床应用含有鬼箭羽的中成药或复方合剂治疗DKD疗效显著。多项临床试验[6-7]表明，鬼箭羽单药可降低尿蛋白、保护肾小管上皮细胞、减少细胞外基质的沉积，从而延缓肾小球硬化，对防治DKD具有独特的优势。本研究采用网络药理学及分子对接技术探索鬼箭羽的主要化学成分、核心靶点以及与DKD之间的相互关系，为进一步阐明鬼箭羽治疗DKD的作用机制提供思路和理论基础。
1 资料与方法
1.1 数据库与软件
全文涉及的数据库、分析平台及与软件来源：中药系统药理学分析平台（TCMSP， http：//www.tcmspw.com/tcmsp.php）;中医分子机制生物信息学分析工具（BATMAN-TCM， http：//bionet.ncpsb.org.cn/batman-tcm）;中医药数据库（TCM@TAIWAN， http：//tcm.cmu.edu.tw/zh-tw/）;有机小分子生物活性数据库（PubChem， https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）;通用蛋白质数据库（Uniprot， http：//www.uniprot.org）;小分子结构数据库（ZINC15， http：//zinc15.docking.org）;蛋白结构数据库（RCSB PDB， http：//www.rcsb.org）;药物靶标数据库（TTD， http：//db.idrblab.net/ttd/）;人类基因数据库（GeneCards， https：//www.genecards.org/）;药物银行数据库（DrugBank， http：//www.Drugbank.ca/）;在线人类孟德尔遗传数据库（OMIM; http：//www.Omim.org/）;网络在线绘图软件Venny2.1（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）;STRING数据库（https：//string-db.org/）;在线云平台OmicShare网站（https：//www.omicshare.com/）;网络拓扑属性分析软件Cytoscape 3.7.1（http：//cytoscape.org/）;分子对接软件AutoDock4.2.6/AutoDock
Tools1.5.6（http：//autodock.scripps.edu）;分子对接可视化软件Pymol（http：//pymol.org/2/）。
1.2 鬼箭羽活性成分获取及靶点筛选
以“鬼箭羽”“卫矛”和“Ramulus Euonymi”为检索词条分别在TCMSP、BATMAN-TCM、TCM@TAIWAN数据库进行搜索，以生物利用度（OB）≥30%和类药性（DL）≥0.18为条件[8]，并结合相关文献报道筛选出有效成分及作用靶点，将有效成分导入ZINC15数据库，保存有效成分的mol2式;利用Uniprot数据库的对靶点进行蛋白名称标准化，通过Cytoscape构建“中药-成分-靶点”网络。
1.3 DKD靶点及交集靶点获取
在TTD、OMIM、DrugBank、GeneCards数据库中，以“diabetic nephropathy”和“nephropathy，diabetic”为检索词条，搜索DKD靶点，利用在线绘图软件Venny将总疾病靶点和鬼箭羽的作用靶点取交集，即得鬼箭羽治疗DKD的潜在作用靶点。
1.4 “中药-成分-靶点-疾病”网络的构建及分析
将鬼箭羽有效成分及与DKD的共同靶点导入Cytoscape，构建“中药-成分-靶点-疾病”网络，利用Cytoscape中NetworkAnalyzer对网络进行分析获取相关拓扑参数。
1.5 蛋白质相互作用（PPI）网络构建及关键靶点筛选
将共同靶点导入STRING数据库，蛋白种类设置为“homo sapiens”，置信度“medium confidence”设置为0.4，隐藏网络中无关联节点，输出TSV格式文件，并导入Cytoscape，对网络进行拓扑分析，以degree（自由度）、betweenness centrality（介度中心性）、closeness centrality（接近中心性）均大于或等于中位数，average shortest path length（平均最短路径长度）小于或等于中位數为筛选条件，获取关键靶点。 1.6 GO富集分析和KEGG通路分析
利用Cytoscape中ClueGO插件对关键靶点进行GO富集分析，选择“Biological Process”，设置参数为P<0.05、Min Level为6、Max Level为8、Min Gene为7，进行可视化分析;将富集目的基因导入在线云平台Omicshare，背景基因选择“homo sapiens”，对关键靶点进行KEGG通路分析，以P<0.05为筛选条件，对排名前20的信号通路以柱状图形式表示，为进一步从信号通路角度分析鬼箭羽治疗DKD可能的作用机制，以P<0.01、富集基因数>10为筛选条件，并排除与DKD不相关的通路，在此基础上绘制“成分-靶点-通路”网络图。
1.7 鬼箭羽活性成分与关键靶点分子对接
选取“1.5”项中的核心靶点与“1.6”项“成分-靶点-通路”网络中度值排名靠前活性成分进行分子对接验证。通过RCSB PDB数据库获取关鍵基因的晶体结构，采用AutoDock Tools对靶蛋白添加非极性氢、删除水分子及小分子配体。将活性成分的mol2式导入AutoDockTools，添加原子电荷，分配原子类型，运行AutoDock和AutoGrid进行半柔对接，选取最低结合能的组合结果，并用Pymol2.4软件对结果进行可视化。一般而言，结合能<-5 kcal/mol说明可形成稳定的对接结构[9]，且所需结合能越低，则说明其结合构象越稳定。
2 结果
2.1 鬼箭羽主要活性成分靶点筛选结果
通过检索TCMSP、BATMAN-TCM、TCM@TAIWAN 3个中药数据平台共得到鬼箭羽有效成分38个，结合相关文献检索补充[10-11]，共筛选出鬼箭羽主要活性成分14个，其编号及ADME关键参数见表1。利用TCMSP数据库筛选出对应的靶点564个，通过Uniprot对蛋白名称标准化，去重整合后，得到鬼箭羽主要活性成分的作用靶点241个。利用Cytoscape绘制鬼箭羽“成分-靶点”网络图，在此网络中共有256个节点，578条边，见图1。
2.2 “中药-成分-靶点-疾病”网络构建
在TTD、OMIM、DrugBank及GeneCards数据库数据库中分别检索到22、251、110、879个DKD潜在靶点，去掉重复靶点后，得到1 106个DKD相关靶点，疾病靶点韦恩图见图2。将鬼箭羽主要成分的作用靶点与DKD疾病靶点取交集，得到97个共同靶点，见图3。利用Cytoscape构建鬼箭羽“中药-成分-靶点-疾病”网络图，见图4。该网络中共有节点123个，251条边。对网络进行拓扑分析，结果显示，度值排名前4的成分是槲皮素、山柰酚、β-谷甾醇和木犀草素。
2.3 PPI网络构建及关键靶点筛选
将97个共同靶点导入STRING数据库得到网络，如图5，此网络中共有97个节点，1 682条边。将TSV式文件导入Cytoscape，进行拓扑分析，获取鬼箭羽治疗DKD的关键靶点，并提取关键靶点相互作用网络图，见图6。
2.4 GO富集分析
运用ClueGO插件进行GO功能富集分析，构建生物过程网络图（见图7），共得到生物过程条目278条（P<0.05），其中P<0.01的条目有140条，显著性排名靠前的生物过程主要涉及含氧化物的反应、活性氧的调控、细胞凋亡的调控、细胞增殖的调节、脂质的反应等。
2.5 KEGG通路富集分析
通过Omicshare平台对关键靶点进行KEGG通路分析，共得到148条信号通路（P<0.05），其中显著富集P<0.01的有117条，根据P值由小到大筛选排名前20的通路绘制气泡图，见图8。以基因数>10个为筛选条件，并排除与DKD不相关的通路，最后确定了12条通路，包括AGE-RAGE信号通路、流体剪切应力与动脉粥样硬化、肿瘤坏死因子信号通路、白细胞介素-17信号通路、缺氧诱导因子-1信号通路等。根据成分、靶点与信号通路之间的联系，建立成分-靶点-通路网络图，见图9。在关键的AGE-RAGE信号通路上标注出鬼箭羽的作用位点，见图10。
2.6 分子对接
选择度值超过双倍均值的核心靶点（IL-6、TNF、AKT1、VEGFA）与“成分-靶点-通路”网络图中度值排名前4的化合物（槲皮素、山柰酚、β-谷甾醇、木犀草素）进行分子对接，选取最低结合能组合，见表2。使用Pymol进行绘图，展示前8个结合力较好的分子对接模式图，见图11。结果表明鬼箭羽主要化合物与4个靶蛋白的结合能均小于-5 kcal/mol，两者之间能够形成氢健，具有较强的结合能力。
3 讨论
鬼箭羽在《神农本草经》中列为木部中品，既可活血通络、推陈出新，又可清热坚阴、破血消癥，与现代研究认为的DKD的“虚”“瘀”等病因病机相一致[12]。国医大师吕仁和等[4]认为肾小球系膜细胞外基质的增生积聚，是一个由癥聚逐渐发展为癥积的过程，指出DKD治疗的关键应在活血化瘀的基础上，重视软坚散结之法。方用含鬼箭羽以期消癥化结，不仅缓解血络中已经形成的微型癥瘕，更可防止新的癥瘕形成，延缓疾病的发展。
本研究通过多个中药数据库筛选出鬼箭羽活性成分14个，其中槲皮素、山柰酚、β-谷甾醇和木犀草素可能是鬼箭羽治疗DKD的关键成分。张杰等[13]发现槲皮素能下调AngⅡ诱导下的系膜细胞的MCP-1的分泌，减少肾脏系膜增生;王兴红等[14]研究表明，槲皮素能通过抑制p38MAPK、NF-κB来减少炎症因子IL-8、TGF-β1表达，减少肾组织炎症反应，发挥抗纤维化作用。山柰酚具有良好的抗炎活性，能通过调节MAPK、AKT通路，抑制IL-1β、IL-6、CXCL8、TNF-α等炎症因子的表达，对肾功能具有保护作用，此外，山柰酚还能减少活性氧的生成并促进其清除，起到抗氧化应激和抗细胞凋亡的作用[15]。血脂代谢紊乱可直接或间接损害肾小球系膜细胞，进而促进DKD的发展[16]，动物实验表明，β-谷甾醇除可激活2型糖尿病大鼠脂肪组织中的IR和GLUT4来改善血糖，还可显著降低大鼠血清TC、TG，抑制脂质过氧化，调节脂代谢，降低全血黏度[17]。木犀草素属于黄酮类化合物，王超超等[18]发现，木犀草素可以抑制高糖诱导下肾小球系膜细胞过度增生，促进其凋亡，改善肾脏损伤，其机制可能与激活AMPK/SIRT-1/PGC-1α蛋白表达，从而发挥抗肾小球炎症反应、抗增生作用。本研究发现AMPK信号通路、TNF信号通路以及AKT信号通路是鬼箭羽治疗DKD的关键通路，基于分子对接结果，推测槲皮素、山柰酚、β-谷甾醇和木犀草素为鬼箭羽通过多途径协同治疗DKD的极具潜力的药效物质基础。 PPI网络拓扑分析显示，鬼箭羽治疗DKD的关键靶点有41个。包括IL-6、CXCL8、VEGFA、EGFR、ICAM-1、CXCL2等与炎症反应、免疫反应及血管生成相关的靶点，以及AKT1、MAPK1、MAPK8、MMP-9、CASP3等涉及细胞凋亡和细胞增殖的相关靶点。
IL-6、ICAM-1等诸多促炎症因子参与DKD病理生理过程，其中IL-6被认为是调控诸多慢性炎症进展和转归的关键基因[19]。DKD患者机体内IL-6水平明显升高，且随着蛋白尿程度的增加，IL-6水平也逐渐增加，提示DKD患者肾组织高水平表达的IL-6可能参与了DKD发生发展的病理生理过程[20]。有研究[21]表明，肾脏在受到某些抗原刺激后，系膜细胞可持续分泌IL-6，同样高糖和晚期糖基化产物均能诱导肾小管上皮细胞表达和分泌IL-6。AKT1是P13K下游的一个重要靶激酶，是PI3K/AKT信号传导途径的中心环节，参与DKD肾纖维化的病理过程[22]。VEGFA是血管内皮生长因子家族中主要影响微血管形成的细胞因子，而VEGFA的表达，可活化系膜细胞，增加基底膜通透性，使多种炎症因子渗出，加剧炎症反应和肾组织缺氧，而肾髓质过低的氧分压会刺激HIF产生，进而上调VEGF mRNA的转录[23]。张思泉等[24]研究表明，通过抑制ATF6/CHOP途径，下调Caspase-3表达，可减少内质网应激引起的细胞凋亡，保护肾组织。
KEGG富集分析结果显示多条通路与DKD有关。富集结果涉及炎症信号通路（AGE-RAGE信号通路、TNF信号通路、MAPK信号通路、IL-17信号通路等）、自噬-凋亡通路（PI3K-AKT信号通路、FoxO信号通路）和低氧诱导通路（HIF-1信号通路）等。AGEs-RAGE信号通路是DKD发生发展的关键环节，肾脏在持续高血糖环境中产生大量AGEs上调AGE受体（RAGE）表达，AGEs结合RAGE激活一系列信号通路，包括MAPK、JAK/STAT、Caspase-3/7、NF-κB等通路，引起大量黏附分子、生长因子和促炎因子（如IL-6、CXCL8、VEGFA、TNF-α、TGF-β1、CXCL2等）的表达和释放，其中IL-6、CXCL8、TNF-α等促进肾脏慢性炎症状态的建立;VEGFA在肾脏足突细胞过度表达，可增加血管的通透性，进而产生蛋白尿;TGF-β1可通过控制蛋白酶的合成与降解而导致肾小球细胞外基质的产生以及肾小管上皮间质化，造成肾脏组织纤维化，而TGF-β1以及VEGFA的表达又可上调系膜细胞CXCL2表达，促进单核细胞浸润，引起肾小球损伤，最终导致肾脏结构和功能逐渐丧失[25]。MAPK信号通路通过3级激酶级联反应，促进p38MAPK活化，通过促进炎症介质表达、干预细胞因子产生等途径而导致肾组织炎症性损伤以及肾纤维化，同时，p38MAPK信号通路激活还可进一步活化细胞凋亡因子Caspase-3引起足细胞凋亡[26]。本研究表明，MAPK信号通路中包含CASP3、TNF、IL-1B等关键基因，推测鬼箭羽可通过调控上述基因表达、参与调节MAPK信号通路，从而发挥抗炎、抗纤维化及抑制足细胞凋亡的作用，为后续探讨鬼箭羽治疗DKD的作用机制提供思路。在PI3K/AKT信号通路中，PI3K是该通路的起始因子，PTEN是该通路的关键负调节因子，AKT则是该通路的中心环节，AKT被活化后，能够通过调节GLUT-4、Fox O1、mTOR等的活性调控机体糖脂代谢、细胞自噬和凋亡、氧化应激水平，从而参与DKD的发生发展。
综上所述，鬼箭羽可能通过槲皮素、山柰酚、β-谷甾醇和木犀草素等主要活性成分，作用于IL-6、AKT1、VEGFA、CASP3等相关靶点，干预AGE-RAGE、PI3K-AKT、HIF-1、MAPK等信号通路，协作产生抗炎、抗缺氧、降低氧化应激、抗纤维化、抑制细胞凋亡及改善肾血流动力学等作用来防治DKD。
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