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摘要：为研究出一套完整的互叶白千层快繁技术体系，以互叶白千层幼苗茎段为外植体，分别以诱导率、增殖倍数、生根率为指标，采用正交试验对芽诱导培养基、丛生芽增殖培养基、生根培养基进行优化。结果表明，最佳诱导培养基为MS 0.01%活性炭 0.1 mg/L 6-BA 0.05 mg/L NAA，诱导率为82.8%；最佳增殖培养基为MS 30 g/L蔗糖 0.25 mg/L 6-BA，增殖倍数为31倍；最佳生根培养基为1/2 MS 30 g/L蔗糖 0.1 mg/L NAA，生根率达100%，移栽30 d后成活率达80%以上。研究结果为互叶白千层的工厂化育苗提供了技术参考。
关键词：互叶白千层；快速繁殖；正交试验；芽诱导；丛生芽增殖；生根
中图分类号： Q945.51 文献标志码： A
文章编号：1002-1302（2015）03-0020-04
互叶白千层（Melaleuca alternifolia）为桃金娘科（Myrtaceae）白千层属 （Melateuca）常绿小乔木，原产于澳大利亚的新南威尔士州和新西兰的部分地区[1]，是近年我国成功引进的高价值经济植物及绿化树种。互叶白千层对污染物有很强的净化能力[2-4]，可用于构建植物浮床[5]。互叶白千层的新鲜枝叶和树干提取的精油俗称茶树油，可以高效、无毒、无刺激地杀死人体皮肤表面的真菌和细菌[6-9]，并对某些病毒也有抑制作用[10-11]，是一种强效的抗菌剂[12-17]、杀虫剂[18-20]、芳香剂[21]、防腐剂[22]，是不可多得的天然保健医药材料，广泛应用于制药、日化、食品、香料等行业。因此，种植互叶白千层具有巨大的生态和经济效益。
目前，国内外對互叶白千层的研究主要集中在其精油的提取、成分分析及作用等方面[23-24]，而对利用组织培养技术进行再生植株的研究较少，目前尚没有完整的快繁技术体系。依据精油化学成分含量的不同，互叶白千层分为6种[25]，其中仅松油醇-4型优良品种提取的精油成分满足国际标准[26]。为获得品种优良的互叶白千层，使用种子繁殖多败育，发芽率很低[27]，且后代易产生变异，难以保持亲本优良性状；扦插繁殖生根率虽高[28]，但成活率较低[29]。组织培养既可以保持亲本的优良性状，又可以将获得的优良株系快速推广应用于生产，有望成为互叶白千层产业化育苗的主要繁殖手段。
本试验以互叶白千层茎段为材料，进行表面灭菌处理，对诱导培养基、增殖培养基、生根培养基进行筛选，并对试管苗驯化移栽，拟建立一套完整的互叶白千层快繁技术体系，为互叶白千层的优株选育提供理论依据，为其工厂化育苗提供技术参考。
1 材料与方法
1.1 材料
互叶白千层为温室栽培植株，株高20 cm，由江西抚州市森源生物科技有限公司提供。
1.2 仪器
W-CJ-2FD洁净工作台（苏州安泰空气技术有限公司生产），LMQJ型立式灭菌锅（山东新华医疗器械股份有限公司生产），JY2002电子分析天平（精密科学仪器有限公司生产），JA1003N电子天平（精密科学仪器有限公司生产）。
1.3 方法
1.3.1 外植体的表面灭菌及预处理 培养60 d的温室种植的互叶白千层幼苗，株高30 cm，在20 cm处去顶。30 d后，随机剪取5 cm的幼苗茎段，剪去部分叶片，用洗衣粉液浸泡30 min，流水冲洗2 h；70%乙醇处理30 s，无菌水洗3次，然后用 0.1% HgCl2处理3 min，无菌水洗4次，待用；去掉茎段顶部，剪取约1 cm、含4～5个节点的茎段，接种到诱导培养基中。为了降低酚类物质氧化褐变引起的生长抑制，在第3 天将茎段转接到新的培养基中。
1.3.2 诱导培养基的优化 采用3因素4水平L16（43）正交试验。各因素水平见表1。共16组固体培养基，每组8瓶，每瓶5个茎段；30 d后统计长芽的外植体数、芽数，并计算诱导率。诱导率的计算公式如下：
诱导率=诱导出芽的外植体数÷接种的外植体数×100%。
1.3.3 增殖培养基的优化 采用3因素4水平L16（43）正交试验。各因素水平见表2。共16组液体培养基，每组16瓶，每瓶5个诱导出单芽的茎段；60 d后统计丛生芽数，并计算增殖倍数。增殖倍数的计算公式如下：
增殖倍数=丛生芽数÷接种的外植体数×100%。
1.3.4 生根培养基的优化 采用4因素3水平L9（34）正交试验。各因素水平见表3。共9组固体培养基，每组10瓶，每瓶5个幼枝茎段；30 d后统计生根的外植体数，并计算生根率。生根率的计算公式如下：
生根率=生根的外植体数÷接种的外植体数×100%。
1.3.5 移栽 生根培养30 d后，将试管苗转移到室外炼苗，散射光光照培养10～20 d，当组培苗抽高生长，木质化程度加强时，即可移栽。取出试管苗，清洗根部，再用0.1%高锰酸钾溶液消毒30 s，自来水清洗除去残留的高锰酸钾，然后把试管苗移栽至含基质（泥炭 ∶[KG-*3]珍珠岩=1 ∶[KG-*3]1）的花盆里，遮阳网遮阳，将1 L的塑料饮料容器底部剪掉，罩在试管苗上，保持幼苗周围湿润。14 d后，遮阳网部分移除，容器一侧抬起以露出植物。再过7 d后，遮阳网移除，移走容器。移栽30 d后统计成活率。
1.4 培养条件
温度（25±2） ℃，光照12 h/d，光照强度2 500～3 000 lx。诱导培养基、增殖培养基和生根培养基的基础培养基均为MS培养基，通过添加各种不同浓度的激素或蔗糖、MS成分减半进行优化；固体培养基中加7.0 g/L琼脂，调pH值为5.8；液体培养基不加琼脂，不调节pH值，实际测得pH值为5.2。 2 结果与分析
2.1 诱导培养基的优化
互叶白千层茎段在诱导培养基上培养30 d，统计结果见表4。极差分析表明，3个因素对互叶白千层芽诱导的影响大小依次为：NAA>活性炭6-BA。随着NAA浓度的增加，诱导率呈下降趋势；当活性炭浓度为0.01%、6-BA浓度为 0.1 mg/L、NAA 浓度为0.05 mg/L时，诱导出芽数是2.46个，诱导率是82.8%。方差分析表明，3个因素对诱导率及芽数无显著影响（表5、表6）。
芽诱导主要是已有芽原基在解除顶端优势之后的萌发。本试验结果表明，不同培养基对外植体的诱导率及芽数无显著影响，最佳诱导效果的培养基为：MS 0.01%活性炭 0.1 mg/L 6-BA 0.05 mg/L NAA。
2.2 增殖培养基的优化
互叶白千层芽诱导后在液体培养基中增殖培养60 d，增殖倍数的统计结果见表7。极差分析表明，3个因素对互叶白千层芽增殖的影响大小依次为：NAA>6-BA>蔗糖。随着NAA浓度的增加，增殖倍数呈下降趋势，当NAA浓度为0时增殖倍数最高。随着6-BA浓度的增加，增殖倍数先增大后减小，当6-BA浓度达0.250 mg/L时增殖倍数最高，这可能是由于低浓度的6-BA促进细胞分裂，而高浓度的6-BA则抑制细胞分裂。随着蔗糖浓度的增加，增殖倍数先增大后减小，当蔗糖浓度达30 g/L时，增殖倍数最高。方差分析表明（表8），NAA对增殖倍数影响达显著水平（P<0.05）。互叶白千层芽增殖的最佳培养基组合为：MS 30 g/L蔗糖 025 mg/L 6-BA，增殖倍数达31倍。
List等采用单因素试验获得的增殖培养基为MS固体培养基 1.0 mg/L BA，培养时间为63 d，增殖倍数为5.5倍[30]。De Oliveira等同样用单因素试验获得的增殖培养基为MS液体培养基 0.25 mg/L BA，培养时间为56 d，增殖倍数为118倍[31]。樊吉尤等用不同激素组合进行试验，结果表明较好的激素组合是0.8 mg/L 6-BA 0.01 mg/L 2，4-D，增殖倍数为14.88倍[32]。本研究通过正交试验，获得了最佳的增殖培养基，增殖倍数达31倍，而且丛生芽较粗壮，呈深绿色（图1-C），结果显著好于已往报道。主要原因有：（1）互叶白千层通常生长在沼泽中[33]，喜酸性或微酸性土壤[34-35]，本试验使用的液体培养基，pH值为5.2，适合其生长；（2）以往研究一般在培养基中仅添加NAA，本试验将其设定为因素之一，结果表明，NAA与增殖倍数呈负相关，不加NAA的第6处理的培养基效果最佳；（3）本试验使用的是液体培养基，养分交换非常充分，营养物质可以更好地被吸收[31]。
由表7可知，第8处理的培养基中外植体的增殖倍数为0，观察发现该组培养基中的外植体无明显生长，逐渐变成褐色，可能原因是激素配比不利于芽的生长，同时液體培养基中氧气含量比较低，外植体易发生缺氧坏死。
2.3 生根培养基的优化
生根培养30 d后，生根率统计结果见表9。极差分析表明，对互叶白千层生根率的影响大小依次是：NAA>基本培养基=IAA>蔗糖。由表9可知，所有培养基的生根率都在80%以上，第6处理的生根率和根系发达程度最高。观察可知，该处理试管苗根系发达，有3级根，一级根上生成粗细不同的二级根，并且在粗二级根上形成三级根，各级根上均有少量根毛；在以后炼苗时发现，这样的根系更加有利于移栽成活。因此，最佳生根培养基是含30 g/L蔗糖、0.1 mg/L NAA和 0 mg/L IAA的1/2MS培养基。
2.4 移栽
幼苗移栽是试管苗从实验室适宜生长环境到复杂外界环境，并发生从异养到自养的转变过程。因此，移栽前要进行炼苗，让试管苗更好地适应自然环境。在本试验中，经过炼苗，幼苗的地上、地下部分均具有较强木质化，移栽成活率达80%以上；其中，茎部粗壮、叶片浓绿、根系发达的幼苗，移栽时更易成活。
3 结论
通过正交试验得出互叶白千层外植体的最佳诱导培养基为MS 0.01
关键词：互叶白千层；快速繁殖；正交试验；芽诱导；丛生芽增殖；生根
中图分类号： Q945.51 文献标志码： A
文章编号：1002-1302（2015）03-0020-04
互叶白千层（Melaleuca alternifolia）为桃金娘科（Myrtaceae）白千层属 （Melateuca）常绿小乔木，原产于澳大利亚的新南威尔士州和新西兰的部分地区[1]，是近年我国成功引进的高价值经济植物及绿化树种。互叶白千层对污染物有很强的净化能力[2-4]，可用于构建植物浮床[5]。互叶白千层的新鲜枝叶和树干提取的精油俗称茶树油，可以高效、无毒、无刺激地杀死人体皮肤表面的真菌和细菌[6-9]，并对某些病毒也有抑制作用[10-11]，是一种强效的抗菌剂[12-17]、杀虫剂[18-20]、芳香剂[21]、防腐剂[22]，是不可多得的天然保健医药材料，广泛应用于制药、日化、食品、香料等行业。因此，种植互叶白千层具有巨大的生态和经济效益。
目前，国内外對互叶白千层的研究主要集中在其精油的提取、成分分析及作用等方面[23-24]，而对利用组织培养技术进行再生植株的研究较少，目前尚没有完整的快繁技术体系。依据精油化学成分含量的不同，互叶白千层分为6种[25]，其中仅松油醇-4型优良品种提取的精油成分满足国际标准[26]。为获得品种优良的互叶白千层，使用种子繁殖多败育，发芽率很低[27]，且后代易产生变异，难以保持亲本优良性状；扦插繁殖生根率虽高[28]，但成活率较低[29]。组织培养既可以保持亲本的优良性状，又可以将获得的优良株系快速推广应用于生产，有望成为互叶白千层产业化育苗的主要繁殖手段。
本试验以互叶白千层茎段为材料，进行表面灭菌处理，对诱导培养基、增殖培养基、生根培养基进行筛选，并对试管苗驯化移栽，拟建立一套完整的互叶白千层快繁技术体系，为互叶白千层的优株选育提供理论依据，为其工厂化育苗提供技术参考。
1 材料与方法
1.1 材料
互叶白千层为温室栽培植株，株高20 cm，由江西抚州市森源生物科技有限公司提供。
1.2 仪器
W-CJ-2FD洁净工作台（苏州安泰空气技术有限公司生产），LMQJ型立式灭菌锅（山东新华医疗器械股份有限公司生产），JY2002电子分析天平（精密科学仪器有限公司生产），JA1003N电子天平（精密科学仪器有限公司生产）。
1.3 方法
1.3.1 外植体的表面灭菌及预处理 培养60 d的温室种植的互叶白千层幼苗，株高30 cm，在20 cm处去顶。30 d后，随机剪取5 cm的幼苗茎段，剪去部分叶片，用洗衣粉液浸泡30 min，流水冲洗2 h；70%乙醇处理30 s，无菌水洗3次，然后用 0.1% HgCl2处理3 min，无菌水洗4次，待用；去掉茎段顶部，剪取约1 cm、含4～5个节点的茎段，接种到诱导培养基中。为了降低酚类物质氧化褐变引起的生长抑制，在第3 天将茎段转接到新的培养基中。
1.3.2 诱导培养基的优化 采用3因素4水平L16（43）正交试验。各因素水平见表1。共16组固体培养基，每组8瓶，每瓶5个茎段；30 d后统计长芽的外植体数、芽数，并计算诱导率。诱导率的计算公式如下：
诱导率=诱导出芽的外植体数÷接种的外植体数×100%。
1.3.3 增殖培养基的优化 采用3因素4水平L16（43）正交试验。各因素水平见表2。共16组液体培养基，每组16瓶，每瓶5个诱导出单芽的茎段；60 d后统计丛生芽数，并计算增殖倍数。增殖倍数的计算公式如下：
增殖倍数=丛生芽数÷接种的外植体数×100%。
1.3.4 生根培养基的优化 采用4因素3水平L9（34）正交试验。各因素水平见表3。共9组固体培养基，每组10瓶，每瓶5个幼枝茎段；30 d后统计生根的外植体数，并计算生根率。生根率的计算公式如下：
生根率=生根的外植体数÷接种的外植体数×100%。
1.3.5 移栽 生根培养30 d后，将试管苗转移到室外炼苗，散射光光照培养10～20 d，当组培苗抽高生长，木质化程度加强时，即可移栽。取出试管苗，清洗根部，再用0.1%高锰酸钾溶液消毒30 s，自来水清洗除去残留的高锰酸钾，然后把试管苗移栽至含基质（泥炭 ∶[KG-*3]珍珠岩=1 ∶[KG-*3]1）的花盆里，遮阳网遮阳，将1 L的塑料饮料容器底部剪掉，罩在试管苗上，保持幼苗周围湿润。14 d后，遮阳网部分移除，容器一侧抬起以露出植物。再过7 d后，遮阳网移除，移走容器。移栽30 d后统计成活率。
1.4 培养条件
温度（25±2） ℃，光照12 h/d，光照强度2 500～3 000 lx。诱导培养基、增殖培养基和生根培养基的基础培养基均为MS培养基，通过添加各种不同浓度的激素或蔗糖、MS成分减半进行优化；固体培养基中加7.0 g/L琼脂，调pH值为5.8；液体培养基不加琼脂，不调节pH值，实际测得pH值为5.2。 2 结果与分析
2.1 诱导培养基的优化
互叶白千层茎段在诱导培养基上培养30 d，统计结果见表4。极差分析表明，3个因素对互叶白千层芽诱导的影响大小依次为：NAA>活性炭6-BA。随着NAA浓度的增加，诱导率呈下降趋势；当活性炭浓度为0.01%、6-BA浓度为 0.1 mg/L、NAA 浓度为0.05 mg/L时，诱导出芽数是2.46个，诱导率是82.8%。方差分析表明，3个因素对诱导率及芽数无显著影响（表5、表6）。
芽诱导主要是已有芽原基在解除顶端优势之后的萌发。本试验结果表明，不同培养基对外植体的诱导率及芽数无显著影响，最佳诱导效果的培养基为：MS 0.01%活性炭 0.1 mg/L 6-BA 0.05 mg/L NAA。
2.2 增殖培养基的优化
互叶白千层芽诱导后在液体培养基中增殖培养60 d，增殖倍数的统计结果见表7。极差分析表明，3个因素对互叶白千层芽增殖的影响大小依次为：NAA>6-BA>蔗糖。随着NAA浓度的增加，增殖倍数呈下降趋势，当NAA浓度为0时增殖倍数最高。随着6-BA浓度的增加，增殖倍数先增大后减小，当6-BA浓度达0.250 mg/L时增殖倍数最高，这可能是由于低浓度的6-BA促进细胞分裂，而高浓度的6-BA则抑制细胞分裂。随着蔗糖浓度的增加，增殖倍数先增大后减小，当蔗糖浓度达30 g/L时，增殖倍数最高。方差分析表明（表8），NAA对增殖倍数影响达显著水平（P<0.05）。互叶白千层芽增殖的最佳培养基组合为：MS 30 g/L蔗糖 025 mg/L 6-BA，增殖倍数达31倍。
List等采用单因素试验获得的增殖培养基为MS固体培养基 1.0 mg/L BA，培养时间为63 d，增殖倍数为5.5倍[30]。De Oliveira等同样用单因素试验获得的增殖培养基为MS液体培养基 0.25 mg/L BA，培养时间为56 d，增殖倍数为118倍[31]。樊吉尤等用不同激素组合进行试验，结果表明较好的激素组合是0.8 mg/L 6-BA 0.01 mg/L 2，4-D，增殖倍数为14.88倍[32]。本研究通过正交试验，获得了最佳的增殖培养基，增殖倍数达31倍，而且丛生芽较粗壮，呈深绿色（图1-C），结果显著好于已往报道。主要原因有：（1）互叶白千层通常生长在沼泽中[33]，喜酸性或微酸性土壤[34-35]，本试验使用的液体培养基，pH值为5.2，适合其生长；（2）以往研究一般在培养基中仅添加NAA，本试验将其设定为因素之一，结果表明，NAA与增殖倍数呈负相关，不加NAA的第6处理的培养基效果最佳；（3）本试验使用的是液体培养基，养分交换非常充分，营养物质可以更好地被吸收[31]。
由表7可知，第8处理的培养基中外植体的增殖倍数为0，观察发现该组培养基中的外植体无明显生长，逐渐变成褐色，可能原因是激素配比不利于芽的生长，同时液體培养基中氧气含量比较低，外植体易发生缺氧坏死。
2.3 生根培养基的优化
生根培养30 d后，生根率统计结果见表9。极差分析表明，对互叶白千层生根率的影响大小依次是：NAA>基本培养基=IAA>蔗糖。由表9可知，所有培养基的生根率都在80%以上，第6处理的生根率和根系发达程度最高。观察可知，该处理试管苗根系发达，有3级根，一级根上生成粗细不同的二级根，并且在粗二级根上形成三级根，各级根上均有少量根毛；在以后炼苗时发现，这样的根系更加有利于移栽成活。因此，最佳生根培养基是含30 g/L蔗糖、0.1 mg/L NAA和 0 mg/L IAA的1/2MS培养基。
2.4 移栽
幼苗移栽是试管苗从实验室适宜生长环境到复杂外界环境，并发生从异养到自养的转变过程。因此，移栽前要进行炼苗，让试管苗更好地适应自然环境。在本试验中，经过炼苗，幼苗的地上、地下部分均具有较强木质化，移栽成活率达80%以上；其中，茎部粗壮、叶片浓绿、根系发达的幼苗，移栽时更易成活。
3 结论
通过正交试验得出互叶白千层外植体的最佳诱导培养基为MS 0.01