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摘 要 为探索淀粉对四川三大烟区烤烟品质、香气特征的影响，以四川主要栽培品种红花大金元和云烟87为材料，在攀西烟区（攀枝花、凉山）、川南烟区（泸州）、川北烟区（广元）驻点采样，研究烟株旺长期、现蕾期和成熟期碳代谢重要产物淀粉相关分解酶活性及基因表达情况。研究发现：1）各地淀粉酶均呈现先降后升的规律，酶活性在烟草成熟期最高；各地淀粉去分支酶活性变化与淀粉酶活性变化相似，在旺长期、现蕾期酶活性较低，进入成熟期后酶活性升高。2）攀西烟区淀粉酶活性在不同时期均最高，且与川北、川南两烟区差异显著，而其淀粉去分支酶活性在三烟区中最低，淀粉酶活性差异有可能是导致各烟区烟叶香型不同的因素。淀粉去分支酶活性较弱，各烟区差异相对较小。β-amylase基因表达量相对较高，且三大烟区之间表达量差异较为明显，也是影响各烟区香型不同的因素之一。
关键词 烤烟；淀粉分解酶类活性；基因表达量；四川三大烟区
中图分类号：S572；Q946.5 文献标志码：A DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2017.25.008
知网出版网址：http：//kns.cnki.net/kcms/detail/50.1186.S.20170908.1504.011.html 网络出版时间：2017/9/8 15：04：15
烟草（Nicotiana tabacum L.）为双子叶植物管花目茄科烟草属植物，是以收获叶片为目标的一种应用价值极高的重要经济作物，烟叶品质的好坏直接决定烤烟最终的经济价值。国内外研究表明，生态环境的不同通过影响烟株内部的生理生化反应成为影响烟叶质量的关键因素，是优良烟叶品质形成的基础与前提[1-2]。
四川作为我国最为重要的烟叶主产区之一，各烟区区域气候特征差异明显，土壤类型分布多样，海拔跨度较大，生态环境不一，因而烤烟抽吸风格特色各有特色，综合来看可将四川分为攀西烟区、川南烟区和川北烟区三大烟区。其中，攀西地区烟叶香气量较足，香气质佳，加工性好，香气特性兼有清香型和中间型；川南地区烟叶外观质量和物理特性均不如攀西地区，化学成分协调性好，该地区的部分烟叶产区烟碱含量偏高，劲头偏大，香气特性为中间型；川北地区烟叶外观质量和物理特性较好，化学成分较为协调，该地区烟叶还原糖含量较高，烟叶香气特性为中间型[3-4]。
淀粉是烟草碳代谢的主要产物之一，是烟草光合作用的主要产物。烟草作为以积累淀粉为主的粉叶类植物，新鲜烟叶中淀粉含量很高，含量常达到干重的40%，其中直链淀粉与支链淀粉的比例约为23∶77[5]。淀粉在烟叶中既可作为主要的营养物质积累，也可在需要能量时部分水解为葡萄糖供机体利用。烟叶品质与其淀粉含量密切有关。一方面，卷烟制品中，以淀粉形态存在的糖类在烟支燃吸时，对烟气质量会产生不良影响：1）影响燃烧速度以及燃烧完全性；2）淀粉在烟支燃烧时产生的糊焦气味，会使烟草香味变差，口感欠佳，使人通过吸食卷烟得到的愉悦程度下降。所以从卷烟制品的角度来讲，淀粉含量越低越好。另一方面，立足于烟叶生长，要达到充分的成熟，则淀粉的积累必须达到最高峰。在烤烟的烘烤的过程中，约有80%的淀粉经过酶的作用转化为糖，只有少量淀粉被分解为中间产物如糊精等，因此通常情况下，鲜烟叶中淀粉积累越多，烟叶成熟越充分，烘烤调制过程淀粉水解越完全，淀粉转化为有利物质就越多，烟叶的品质越佳[6-7]。所以，淀粉是影响烤烟品质的重要因素之一。
淀粉酶作为一类促进淀粉水解的酶，左右着烟叶中淀粉含量的多少。淀粉酶主要包括α-淀粉酶、β-淀粉酶、异淀粉酶等[8-9]，在烟叶生长、调制的过程中起着将淀粉水解成糖类供细胞代谢、化学成分的平衡调节等作用。在烤烟中，淀粉酶主要以α-淀粉酶、β-淀粉酶以及淀粉去分支酶的形式存在。本研究以四川主要栽培种红花大金元和云烟87为材料，在攀枝花、凉山、泸州、广元驻点采样，通过研究烤烟旺长期、现蕾期和成熟期淀粉分解的相关酶活性及其基因表达情况，系统分析四川不同产区烟叶淀粉分解相关酶活性及其基因表达规律，以探索烤烟淀粉酶及其基因分解代谢对于四川省不同烟区特色烟叶风格的影响，为优质烟叶的生产提供理论基础，为进一步优化四川省烤烟风格特色提供依据。
1 材料与方法
1.1 试验点及试验品种选取
四川烤烟全年出产约为19万t，其中攀西地区生产烟叶12.5万t。因此在试验点的选取上，偏重于攀枝花和西昌地区。攀枝花地区选取米易、仁和两个地区，凉山选取的3个点分别为冕宁、会理、西昌。川南和川北采集点选取泸州古蔺县、广元剑阁县。本试验所选品种为当前四川烤烟的主推品种红花大金元和云烟87，以H代表红花大金元品种，Y代表云烟87品種；烟区地名中，JG为剑阁，GL为古蔺，HL为会理，MY为米易，XC为西昌，MN为冕宁，RH为攀枝花仁和。
1.2 试验材料采集
2013年、2014年2年在烤烟旺长期、现蕾期、成熟期的晴朗天气上午采集各地区试验田中长势基本一致且无病虫害的烟株，按“S”型取样方法，选取30株采集中部烟叶（从下往上数第10片烟叶），每个地区每个品种采集3管烟叶，液氮速冻。2年共计在攀西烟区的西昌（XC）、会理（HL）、冕宁（MN）、仁和（RH）、米易（MY），川南烟区的古蔺（GL），川北烟区的剑阁（JG）7个不同取样点采集样品252份，带回实验室分装后冻存于-80℃冰箱，用于酶活性及基因表达水平测定。
1.3 淀粉酶的提取和测定
称取2 g烟叶，置研钵中加少许石英砂，磨成匀浆倒入25 mL刻度试管中，用蒸馏水定容，混匀室温下放置，每隔5 min震荡1次，放置20 min后离心，取上清液备用。
酶活性的测定：
1）取制备的酶液5 mL，放入100 mL容量瓶中，蒸馏水定容至刻度，混匀。取4支试管，2支做对照，2支做测定，各加入稀释酶液1 mL以及1 mL pH为5.6的柠檬酸缓冲液；对照管中加入4 mL 0.4 mol/L NaOH，以鈍化酶活性。将4支试管置于40℃恒温水浴中保温15 min，再分别向各管加入预热（40℃）的淀粉溶液2 mL，摇匀，再保温5 min取出，向另外2支测定管中分别加入4 mL 0.4 mol/L NaOH，终止酶活性。备用。 2）标准曲线的制作。
3）取2号、3号管中酶作用后的溶液以及对照管的溶液各2 mL，分别加入25 mL刻度试管中，再加入2 mL 3，5—二硝基水杨酸，置沸水浴煮沸5 min，冷却，用蒸馏水定容至25 mL，混匀，在波长520 nm处测光密度值，从曲线中测出糖含量，用以表示酶活性。实验重复3次。
1.4 DBE活性的测定
参照文迪等的方法进行[10]，重复3次。酶活性以每分钟生成1 mg还原性糖为活性单位（U）。提取酶粗液，并制作标准曲线。取100 μL酶粗提取液加入100 μL反应液[MES-NaOH（pH=6.5） 50 mmol/L，5mg Amylopetin]，30℃保温2 h，加入100 μL 1 mol/L Na2CO3终止反应，取出迅速冷却，定容至500 μL，加1.5 mL 3，5-二硝基水杨酸[3.25 g 3，5-二硝基水杨酸（DNS）溶于水中，再加入2 mol/L NaOH 162.5 mL，再加入22.5 g丙三醇，摇匀后定容至500 mL，放入冰箱中待用]，混匀后沸水浴中5 min，540 nm比色测定还原糖量。
1.5 Real-Time PCR检测
烟草蔗糖代谢相关酶关键基因序列通过NCBI、EMBL、DDBJ查阅，利用软件Primer 5.0通过相关序列设计特定引物，并检测特异性。
根据北京天恩泽基因科技有限公司生产的Trizol伴侣试剂盒的说明书步骤提取RNA。
将提取到的烟草总RNA进行反转录。以纯化后的RNA为模板，根据Takara反转录试剂盒进行，反应体系总体积为20 μL。
以检测合格的cDNA产物为模板，以10倍比例稀释原液，制作目的标准曲线。采用双标准曲线法对样品中基因的表达量进行Real-Time PCR检测，每个待测样品设置3次重复，选用18S作为内参基因。
1.6 数据分析
酶活性数据、基因表达量数据使用Excel分析，相关酶活性多重比较使用SPSS软件进行，多重比较结果采用LSD法。
2 结果与分析
2.1 引物设计
引物设计结果见表1。
2.2 不同地区烤烟蔗糖和淀粉分解酶活性动态变化规律及其差异
2.2.1 淀粉酶
由图1及表2可知，云烟87及红花大金元淀粉酶活性变化趋势是一致的，都呈现出旺长期、成熟期活性较高，现蕾期活性降低的态势，但云烟87酶活性较红花大金元酶活性高。四川各烟区中，剑阁和古蔺酶活性各个时期都为最低。淀粉酶活性的大小能在一定程度上反映烤烟内碳代谢的强弱。
2.2.2 淀粉去分支酶
结合淀粉去分支酶活性数据进行分析，从旺长期到成熟期，四川烟区淀粉去分支酶活性动态变化整体像是一条开口向下的抛物线，即旺长期、成熟期各地酶活性较高，现蕾期酶活性下降。其中，会理、冕宁酶活性较高，西昌、米易酶活性较低（见表3）。
2.3 不同地区烤烟蔗糖和淀粉分解酶调控基因表达量动态变化规律及其差异
2.3.1 淀粉酶基因α-amylase表达变化
从表4可知，红花大金元α-淀粉酶基因表达量变化趋势同酶活性变化趋势相同，旺长期、成熟期基因表达量高，现蕾期表达量较低，2013年、2014年2年基因变化规律相同。云烟87 α-淀粉酶基因在各烟区变化趋势与红花大金元相似，但各地基因表现不一，是生态条件各异所造成的。
2.3.2 淀粉酶基因β-amylase表达变化
从表5可知，红花大金元β-淀粉酶基因在四川各地变化规律较为相似，旺长期、成熟期表达量高，现蕾期表达量较低，与淀粉酶活性变化趋势一致。通過对比可知，四川各地β-淀粉酶基因表达量虽不一，但均远高于各地α-淀粉酶基因表达量，因此我们推测红花大金元β-淀粉酶基因在淀粉酶中起主导作用。同理，我们也可以推测云烟87 β-淀粉酶基因在淀粉酶中起主导作用。2013年、2014年2年基因表達变化规律相同。
2.3.3 淀粉去分支酶基因DBE表达变化
从表6可知，各地无论是红花大金元还是云烟87，淀粉去分支酶调控基因变化趋势较为一致，旺长期、成熟期表达量较高，现蕾期表达量较低。
2.4 四川不同烟区相关分解酶活性变化规律及其差异
由表7可见，攀西烟区淀粉酶活性在各个时期均是最高，且与川南烟区、川北烟区的差异达到显著，川北烟区与川南烟区相比差异较小。
由表8可见，烤烟旺长期、现蕾期时，川南烟区、川北烟区淀粉去分支酶活性强，且与攀西烟区差异显著，进入成熟期后，川北烟区淀粉去分支酶活性仍保持在相对较高的酶活性水平上，而川南烟区、攀西烟区差异不显著。
3 结论与讨论
3.1 四川不同烟区淀粉分解酶类动态变化特征及其差异
淀粉是烤烟大田期间积累的最为重要的碳水化合物之一，淀粉酶活性影响烟叶淀粉的积累量，从而影响到烟叶的品质。四川各地烤烟淀粉酶活性呈现出开口向下的抛物线趋势，在大田生长初期，烟叶中淀粉的积累量较小，积累后也被迅速地分解用于植株的形态建成，因此淀粉酶活性较低。旺长期后，烤烟代谢旺盛，淀粉的合成分解速率加快，淀粉酶活性上升，淀粉被迅速分解用于植株代谢；进入现蕾期，烤烟由营养生长变成生殖生长，淀粉酶活性有所降低；打顶后，一方面烤烟继续营养生长，此前烟叶体内贮藏的大量淀粉进一步诱导了淀粉酶活性，另一方面，淀粉酶活性的上升能够协调烤烟中化学成分的平衡，为各种香气的合成提供前体，因此淀粉酶活性在成熟期时达到峰值。DBE催化支链淀粉中糖苷键的水解，因此DBE的活性高低可改变直链淀粉、支链淀粉的比例，而且还可改变支链淀粉的结构，形成分支程度不一的支链淀粉，有研究表明，烤烟中支链淀粉、直链淀粉比率的不同能影响烤烟烘烤的结果，我国烤烟烘烤后淀粉含量较高已经成为制约卷烟品质的重要因素，因此DBE活性的高低对于烤烟优良品质的形成有重要的影响。四川各地DBE基本呈现出先降后升的趋势，DBE酶活性的动态变化与其功能相关，同淀粉酶活性的变化趋势一致。 各烟区相比较，攀西烟区淀粉酶活性在不同时期活性最高，与川北、川南差异显著，而其淀粉去分支酶活性则在三大烟区中最低。淀粉去分支酶活性较弱，各烟区差异相对较小，淀粉酶活性高，各烟区差异较大，可能是导致各烟区烟叶香型不同的因素。
3.2 四川不同生态区淀粉分解酶类基因时空表达规律及其差异
淀粉酶包括α-淀粉酶、β-淀粉酶。α-淀粉酶属于内切酶，内切酶能够在淀粉分子内部以任意方式执行催化水解，α-淀粉酶能够降解α-1，4-链，作用于直链淀粉时，将相应淀粉降解成葡萄糖；当作用于支链淀粉时，除降解生成葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖，还生成少量的极限糊精。β-淀粉酶属于外切酶，外切酶在非还原型末端起作用，催化水解，在没有支链的直链淀粉中，β-淀粉酶能够将淀粉分支完全水解为葡萄糖和麦芽糖；当水解支链淀粉时，只能切断α-1，6-糖苷键之前的反应，因此会产生大量的极限糊精。在烟叶生长过程中，α-淀粉酶基因和β-淀粉酶基因表达趋势基本一致，都呈现出先降后升的趋势，与淀粉酶的趋势基本一致，但后者的表达量较前者高出很多，因此可以推测β-淀粉酶基因起主要作用。DBE主要催化多糖链中a-1，6-糖苷键的水解，和淀粉酶协同一起分解烟叶中的淀粉[11]，在大田生长期间，DBE在烟草成熟期的基因表达量较高，旺长期、现蕾期较低。烟叶中淀粉的分解是几种不同的酶相互协同作用的结果，共同调节烤烟中淀粉的分解代谢。
β-amylase基因表达量相对较高且烟区之间表达差异较为明显，推测可能是导致各烟区香型不同的因素之一。
参考文献：
[1] 左天觉编，朱尊权译.烟草的生产、生理和生物化学[M].上海：远东出版社，1993.
[2] 耿素祥.云南玉溪和普洱烤烟物质代谢与积累差异分析[D].河南农业大学，2011.
[3] 高远.四川省烤烟质量研究及综合评价[D].郑州：河南农业大学，2010.
[4] 王俊.四川烟区烤烟挥发性香气成分区域特征研究[D].雅安：四川农业大学，2013.
[5] 魏庆化.生态条件对河南不同地区烤烟代谢及品质的影响[D].郑州：河南农业大学，2011.
[6] 张槐苓，葛翠英，穆怀静.烟草分析与检验[M].郑州：河南科学技术出版社，1994.
[7] 王文超.光质及调制方式对烤烟碳水化合物积累与降解的影响[D].郑州：河南农业大學，2013.
[8] Fujita N， Kubo A， Francisco P B， et al. Purification， characterization， and cDNA structure of isoamylase from developing endosperm of rice. Plant， 1999， 208：28-293.
[9] Wu C Y， Colleoni C， Myers A M ，et al. Enzymatic properties and regulation of ZPU1， the maize pullulanase-type starch debranching enzyme[J]. Archives of Biochemistry and Biophysics， 2002， 406（1）： 21-32.
[10] 文迪.玉米淀粉分解酶活性動态及其基因时空表达分析[D].雅安：四川农业大学，2010.
[11] Bustos R， Fahy B， Hylton CM， et al. Starch granule initiation is controlled by a heteromultimeric isoamylase in potato tubers[J]. Proc Natl Acad Sci USA， 2004， 101： 2215-2220. （责任编辑：丁志祥）
关键词 烤烟；淀粉分解酶类活性；基因表达量；四川三大烟区
中图分类号：S572；Q946.5 文献标志码：A DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2017.25.008
知网出版网址：http：//kns.cnki.net/kcms/detail/50.1186.S.20170908.1504.011.html 网络出版时间：2017/9/8 15：04：15
烟草（Nicotiana tabacum L.）为双子叶植物管花目茄科烟草属植物，是以收获叶片为目标的一种应用价值极高的重要经济作物，烟叶品质的好坏直接决定烤烟最终的经济价值。国内外研究表明，生态环境的不同通过影响烟株内部的生理生化反应成为影响烟叶质量的关键因素，是优良烟叶品质形成的基础与前提[1-2]。
四川作为我国最为重要的烟叶主产区之一，各烟区区域气候特征差异明显，土壤类型分布多样，海拔跨度较大，生态环境不一，因而烤烟抽吸风格特色各有特色，综合来看可将四川分为攀西烟区、川南烟区和川北烟区三大烟区。其中，攀西地区烟叶香气量较足，香气质佳，加工性好，香气特性兼有清香型和中间型；川南地区烟叶外观质量和物理特性均不如攀西地区，化学成分协调性好，该地区的部分烟叶产区烟碱含量偏高，劲头偏大，香气特性为中间型；川北地区烟叶外观质量和物理特性较好，化学成分较为协调，该地区烟叶还原糖含量较高，烟叶香气特性为中间型[3-4]。
淀粉是烟草碳代谢的主要产物之一，是烟草光合作用的主要产物。烟草作为以积累淀粉为主的粉叶类植物，新鲜烟叶中淀粉含量很高，含量常达到干重的40%，其中直链淀粉与支链淀粉的比例约为23∶77[5]。淀粉在烟叶中既可作为主要的营养物质积累，也可在需要能量时部分水解为葡萄糖供机体利用。烟叶品质与其淀粉含量密切有关。一方面，卷烟制品中，以淀粉形态存在的糖类在烟支燃吸时，对烟气质量会产生不良影响：1）影响燃烧速度以及燃烧完全性；2）淀粉在烟支燃烧时产生的糊焦气味，会使烟草香味变差，口感欠佳，使人通过吸食卷烟得到的愉悦程度下降。所以从卷烟制品的角度来讲，淀粉含量越低越好。另一方面，立足于烟叶生长，要达到充分的成熟，则淀粉的积累必须达到最高峰。在烤烟的烘烤的过程中，约有80%的淀粉经过酶的作用转化为糖，只有少量淀粉被分解为中间产物如糊精等，因此通常情况下，鲜烟叶中淀粉积累越多，烟叶成熟越充分，烘烤调制过程淀粉水解越完全，淀粉转化为有利物质就越多，烟叶的品质越佳[6-7]。所以，淀粉是影响烤烟品质的重要因素之一。
淀粉酶作为一类促进淀粉水解的酶，左右着烟叶中淀粉含量的多少。淀粉酶主要包括α-淀粉酶、β-淀粉酶、异淀粉酶等[8-9]，在烟叶生长、调制的过程中起着将淀粉水解成糖类供细胞代谢、化学成分的平衡调节等作用。在烤烟中，淀粉酶主要以α-淀粉酶、β-淀粉酶以及淀粉去分支酶的形式存在。本研究以四川主要栽培种红花大金元和云烟87为材料，在攀枝花、凉山、泸州、广元驻点采样，通过研究烤烟旺长期、现蕾期和成熟期淀粉分解的相关酶活性及其基因表达情况，系统分析四川不同产区烟叶淀粉分解相关酶活性及其基因表达规律，以探索烤烟淀粉酶及其基因分解代谢对于四川省不同烟区特色烟叶风格的影响，为优质烟叶的生产提供理论基础，为进一步优化四川省烤烟风格特色提供依据。
1 材料与方法
1.1 试验点及试验品种选取
四川烤烟全年出产约为19万t，其中攀西地区生产烟叶12.5万t。因此在试验点的选取上，偏重于攀枝花和西昌地区。攀枝花地区选取米易、仁和两个地区，凉山选取的3个点分别为冕宁、会理、西昌。川南和川北采集点选取泸州古蔺县、广元剑阁县。本试验所选品种为当前四川烤烟的主推品种红花大金元和云烟87，以H代表红花大金元品种，Y代表云烟87品種；烟区地名中，JG为剑阁，GL为古蔺，HL为会理，MY为米易，XC为西昌，MN为冕宁，RH为攀枝花仁和。
1.2 试验材料采集
2013年、2014年2年在烤烟旺长期、现蕾期、成熟期的晴朗天气上午采集各地区试验田中长势基本一致且无病虫害的烟株，按“S”型取样方法，选取30株采集中部烟叶（从下往上数第10片烟叶），每个地区每个品种采集3管烟叶，液氮速冻。2年共计在攀西烟区的西昌（XC）、会理（HL）、冕宁（MN）、仁和（RH）、米易（MY），川南烟区的古蔺（GL），川北烟区的剑阁（JG）7个不同取样点采集样品252份，带回实验室分装后冻存于-80℃冰箱，用于酶活性及基因表达水平测定。
1.3 淀粉酶的提取和测定
称取2 g烟叶，置研钵中加少许石英砂，磨成匀浆倒入25 mL刻度试管中，用蒸馏水定容，混匀室温下放置，每隔5 min震荡1次，放置20 min后离心，取上清液备用。
酶活性的测定：
1）取制备的酶液5 mL，放入100 mL容量瓶中，蒸馏水定容至刻度，混匀。取4支试管，2支做对照，2支做测定，各加入稀释酶液1 mL以及1 mL pH为5.6的柠檬酸缓冲液；对照管中加入4 mL 0.4 mol/L NaOH，以鈍化酶活性。将4支试管置于40℃恒温水浴中保温15 min，再分别向各管加入预热（40℃）的淀粉溶液2 mL，摇匀，再保温5 min取出，向另外2支测定管中分别加入4 mL 0.4 mol/L NaOH，终止酶活性。备用。 2）标准曲线的制作。
3）取2号、3号管中酶作用后的溶液以及对照管的溶液各2 mL，分别加入25 mL刻度试管中，再加入2 mL 3，5—二硝基水杨酸，置沸水浴煮沸5 min，冷却，用蒸馏水定容至25 mL，混匀，在波长520 nm处测光密度值，从曲线中测出糖含量，用以表示酶活性。实验重复3次。
1.4 DBE活性的测定
参照文迪等的方法进行[10]，重复3次。酶活性以每分钟生成1 mg还原性糖为活性单位（U）。提取酶粗液，并制作标准曲线。取100 μL酶粗提取液加入100 μL反应液[MES-NaOH（pH=6.5） 50 mmol/L，5mg Amylopetin]，30℃保温2 h，加入100 μL 1 mol/L Na2CO3终止反应，取出迅速冷却，定容至500 μL，加1.5 mL 3，5-二硝基水杨酸[3.25 g 3，5-二硝基水杨酸（DNS）溶于水中，再加入2 mol/L NaOH 162.5 mL，再加入22.5 g丙三醇，摇匀后定容至500 mL，放入冰箱中待用]，混匀后沸水浴中5 min，540 nm比色测定还原糖量。
1.5 Real-Time PCR检测
烟草蔗糖代谢相关酶关键基因序列通过NCBI、EMBL、DDBJ查阅，利用软件Primer 5.0通过相关序列设计特定引物，并检测特异性。
根据北京天恩泽基因科技有限公司生产的Trizol伴侣试剂盒的说明书步骤提取RNA。
将提取到的烟草总RNA进行反转录。以纯化后的RNA为模板，根据Takara反转录试剂盒进行，反应体系总体积为20 μL。
以检测合格的cDNA产物为模板，以10倍比例稀释原液，制作目的标准曲线。采用双标准曲线法对样品中基因的表达量进行Real-Time PCR检测，每个待测样品设置3次重复，选用18S作为内参基因。
1.6 数据分析
酶活性数据、基因表达量数据使用Excel分析，相关酶活性多重比较使用SPSS软件进行，多重比较结果采用LSD法。
2 结果与分析
2.1 引物设计
引物设计结果见表1。
2.2 不同地区烤烟蔗糖和淀粉分解酶活性动态变化规律及其差异
2.2.1 淀粉酶
由图1及表2可知，云烟87及红花大金元淀粉酶活性变化趋势是一致的，都呈现出旺长期、成熟期活性较高，现蕾期活性降低的态势，但云烟87酶活性较红花大金元酶活性高。四川各烟区中，剑阁和古蔺酶活性各个时期都为最低。淀粉酶活性的大小能在一定程度上反映烤烟内碳代谢的强弱。
2.2.2 淀粉去分支酶
结合淀粉去分支酶活性数据进行分析，从旺长期到成熟期，四川烟区淀粉去分支酶活性动态变化整体像是一条开口向下的抛物线，即旺长期、成熟期各地酶活性较高，现蕾期酶活性下降。其中，会理、冕宁酶活性较高，西昌、米易酶活性较低（见表3）。
2.3 不同地区烤烟蔗糖和淀粉分解酶调控基因表达量动态变化规律及其差异
2.3.1 淀粉酶基因α-amylase表达变化
从表4可知，红花大金元α-淀粉酶基因表达量变化趋势同酶活性变化趋势相同，旺长期、成熟期基因表达量高，现蕾期表达量较低，2013年、2014年2年基因变化规律相同。云烟87 α-淀粉酶基因在各烟区变化趋势与红花大金元相似，但各地基因表现不一，是生态条件各异所造成的。
2.3.2 淀粉酶基因β-amylase表达变化
从表5可知，红花大金元β-淀粉酶基因在四川各地变化规律较为相似，旺长期、成熟期表达量高，现蕾期表达量较低，与淀粉酶活性变化趋势一致。通過对比可知，四川各地β-淀粉酶基因表达量虽不一，但均远高于各地α-淀粉酶基因表达量，因此我们推测红花大金元β-淀粉酶基因在淀粉酶中起主导作用。同理，我们也可以推测云烟87 β-淀粉酶基因在淀粉酶中起主导作用。2013年、2014年2年基因表達变化规律相同。
2.3.3 淀粉去分支酶基因DBE表达变化
从表6可知，各地无论是红花大金元还是云烟87，淀粉去分支酶调控基因变化趋势较为一致，旺长期、成熟期表达量较高，现蕾期表达量较低。
2.4 四川不同烟区相关分解酶活性变化规律及其差异
由表7可见，攀西烟区淀粉酶活性在各个时期均是最高，且与川南烟区、川北烟区的差异达到显著，川北烟区与川南烟区相比差异较小。
由表8可见，烤烟旺长期、现蕾期时，川南烟区、川北烟区淀粉去分支酶活性强，且与攀西烟区差异显著，进入成熟期后，川北烟区淀粉去分支酶活性仍保持在相对较高的酶活性水平上，而川南烟区、攀西烟区差异不显著。
3 结论与讨论
3.1 四川不同烟区淀粉分解酶类动态变化特征及其差异
淀粉是烤烟大田期间积累的最为重要的碳水化合物之一，淀粉酶活性影响烟叶淀粉的积累量，从而影响到烟叶的品质。四川各地烤烟淀粉酶活性呈现出开口向下的抛物线趋势，在大田生长初期，烟叶中淀粉的积累量较小，积累后也被迅速地分解用于植株的形态建成，因此淀粉酶活性较低。旺长期后，烤烟代谢旺盛，淀粉的合成分解速率加快，淀粉酶活性上升，淀粉被迅速分解用于植株代谢；进入现蕾期，烤烟由营养生长变成生殖生长，淀粉酶活性有所降低；打顶后，一方面烤烟继续营养生长，此前烟叶体内贮藏的大量淀粉进一步诱导了淀粉酶活性，另一方面，淀粉酶活性的上升能够协调烤烟中化学成分的平衡，为各种香气的合成提供前体，因此淀粉酶活性在成熟期时达到峰值。DBE催化支链淀粉中糖苷键的水解，因此DBE的活性高低可改变直链淀粉、支链淀粉的比例，而且还可改变支链淀粉的结构，形成分支程度不一的支链淀粉，有研究表明，烤烟中支链淀粉、直链淀粉比率的不同能影响烤烟烘烤的结果，我国烤烟烘烤后淀粉含量较高已经成为制约卷烟品质的重要因素，因此DBE活性的高低对于烤烟优良品质的形成有重要的影响。四川各地DBE基本呈现出先降后升的趋势，DBE酶活性的动态变化与其功能相关，同淀粉酶活性的变化趋势一致。 各烟区相比较，攀西烟区淀粉酶活性在不同时期活性最高，与川北、川南差异显著，而其淀粉去分支酶活性则在三大烟区中最低。淀粉去分支酶活性较弱，各烟区差异相对较小，淀粉酶活性高，各烟区差异较大，可能是导致各烟区烟叶香型不同的因素。
3.2 四川不同生态区淀粉分解酶类基因时空表达规律及其差异
淀粉酶包括α-淀粉酶、β-淀粉酶。α-淀粉酶属于内切酶，内切酶能够在淀粉分子内部以任意方式执行催化水解，α-淀粉酶能够降解α-1，4-链，作用于直链淀粉时，将相应淀粉降解成葡萄糖；当作用于支链淀粉时，除降解生成葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖，还生成少量的极限糊精。β-淀粉酶属于外切酶，外切酶在非还原型末端起作用，催化水解，在没有支链的直链淀粉中，β-淀粉酶能够将淀粉分支完全水解为葡萄糖和麦芽糖；当水解支链淀粉时，只能切断α-1，6-糖苷键之前的反应，因此会产生大量的极限糊精。在烟叶生长过程中，α-淀粉酶基因和β-淀粉酶基因表达趋势基本一致，都呈现出先降后升的趋势，与淀粉酶的趋势基本一致，但后者的表达量较前者高出很多，因此可以推测β-淀粉酶基因起主要作用。DBE主要催化多糖链中a-1，6-糖苷键的水解，和淀粉酶协同一起分解烟叶中的淀粉[11]，在大田生长期间，DBE在烟草成熟期的基因表达量较高，旺长期、现蕾期较低。烟叶中淀粉的分解是几种不同的酶相互协同作用的结果，共同调节烤烟中淀粉的分解代谢。
β-amylase基因表达量相对较高且烟区之间表达差异较为明显，推测可能是导致各烟区香型不同的因素之一。
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