【摘 要】
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目的:构建hsa-miR-223真核表达载体,并在人食管癌细胞KYSE-150中验证hsa-miR-223对靶基因artemin(ARTN)的调控作用.方法:以基因组DNA为模板,RT-PCR扩增包括hsa-miR-223前体序
【机 构】
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河北医科大学第二医院病理科,石家庄市,050051;河北省涉县医院;河北省涉县医院胸外科;
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目的:构建hsa-miR-223真核表达载体,并在人食管癌细胞KYSE-150中验证hsa-miR-223对靶基因artemin(ARTN)的调控作用.方法:以基因组DNA为模板,RT-PCR扩增包括hsa-miR-223前体序列在内的基因序列,并将其克隆到载体pCD?NA3.1(+)上,通过实时定量PCR方法检测hsa-miR-223在人胚肾HEK293细胞中的表达.根据生物信息学预测软件TargetScan、mirBase和PicTar对hsa-miR-223靶基因进行预测,将靶基因ARTN的3UTR区融合到pMIR荧光素酶基因下游,通过双荧光素酶报告基因检测hsa-miR-223 对靶基因ARTN 的3UTR 区的调控作用.将pCDNA3.1-miR-223 表达质粒转染人食管癌细胞KYSE150,通过West blot检测对ARTN蛋白表达的影响.结果:成功构建hsa-miR-223表达载体pCDNA3.1-miR-223.实时定量PCR 验证表明pCDNA3.1-miR-223 在人胚肾HEK293 中能够明显地过表达成熟miR-223.生物信息学预测ARTN 是hsa-miR-223的靶基因,并构建融合ARTN的3UTR区表达质粒pMIR-ARTN,在此基础上对ARTN的3UTR种子区进行定点突变.双荧光素酶报告基因分析表明hsa-miR-223能够作用于ARTN的3UTR.West blot法进一步证实ARTN是miR-223的靶基因.结论:hsa-miR-223作用于ARTN的3UTR可在转录后水平上调控ARTN蛋白的表达.
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