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摘 要： 基于拟南芥的时间序列的基因组芯片数据，分析了植物生长的昼夜调节模式相关的基因表达规律，发现有2.4%的基因的日振幅达到了显著差异水平.从整体基因转录组水平分析，白天诱导表达的基因主要参与调控植物与环境之间的相互作用，而夜晚表达上调的基因主要参与调节植物的生长发育.此外，植物叶绿素和血红素的生物合成也受到了生物钟的调控.对整个基因组水平上生物钟核心震荡调节子 CCA1/LHY 和TOC1的共表达基因做了基因组水平上的扫描鉴定，得到了一些新的潜在的生物节律调节因子.这些结果为今后更为系统地完善植物的生物节律的调控网络提供了参考.
关键词： 转录物组学； 植物； 生长发育； 生物钟
中图分类号： Q 756 文献标志码： A 文章编号： 1000-5137（2018）04-0444-07
Abstract： Based on the time series genomic microarray data of Arabidopsis thaliana，the gene expression pattern was analyzed，and it was found that 2.4% of the genes had a significant difference in daily amplitude.From the analysis of the overall gene transcriptome level，the genes induced during the day are mainly involved in the regulation of the interaction between plants and the environment，while the genes whose expression is up-regulated at night are mainly involved in regulating the growth and development of plants.In addition，the biosynthesis of plant chlorophyll and hemeare also regulated by the circadian clock.A group of new potential biorhythm regulators were identified by analyzing the genes that show co-expressing with CCA1/LHY or TOC1.These data will provide a reference for the more systematic improvement of the regulatory network of plant circadian clock.
Key words： transcriptomic； plant；growth and development； circadian clock
0 引 言
地球的自转带来环境中光和温度的昼夜周期性变化.有机体在漫长的演化过程中发展出用以预测这种环境波动的调节机制，并通过“生物钟”将其细胞活动与昼夜周期同步[1].生物钟可以将环境信号转化为时间信息，有节奏地协调新陈代谢和生理活性.大量的研究表明生物钟参与调节诸多植物生理过程，如：叶子、子叶和花瓣的运动，叶绿体的亚细胞定位，胚胎干（下胚轴）的生长，气孔的打开和关闭，以及开花时间等[1].Harmer等[2]发现哺乳动物、昆虫、真菌和植物的生物钟存在保守的调节机制.常见的调节机制涉及到了振荡器核心部位的转录反馈循环[2].拟南芥的生物钟组分包括单个MYB转录因子CIRCADIAN CLOCK ASSOCIATED 1（CCA1）[3]和LATE ELONGATED HYPOCOTYL（LHY）[4].在任一基因被組成型过表达的植物中，时钟均不能正常工作，导致节律失常，而丧失功能的CCA1或LHY突变仍能保持节奏性，但其周期缩短了[4].此外TIMING OF CAB EXPRESSION 1（TOC1）也是拟南芥生物钟的重要组成部分[5].与CCA1或LHY过表达类似，组成型的过表达TOC1引起多个生物钟输出节律的失常，进一步的研究揭示了CCA1、LHY和TOC1之间的功能联系和相互调控关系[5].根据这个模型，部分功能冗余的转录因子CCA1和LHY作为负向调节子通过直接结合TOC1启动子中的Evening Element （EE） motif来抑制TOC1的表达[6].此外McWatters等[7]鉴定到了新的生物钟核心组件，包括TOC1家族的其他成员，称为PSEUDO RESPONSE REGULATORS 3，5，7和9（PRR3，PRR5，PRR7和PRR9），EARLY FLOWERING 4（ELF4），GARP（GOLDEN2，ARR-B，Psr1）-MYB-结构域转录因子LUX ARRHYTHMO（LUX）或PHYTOCLOCK1（PCL1）和GIGANTEA（GI）.光合作用中一些重要的分子过程是在黎明前启动的，因此在日出之前植物已经准备好最大限度地利用可见光进行光合作用[8].此外，有机体在太阳升起之前可能会产生滤光色素，以避免可见光和紫外线的损害[8].本文作者系统分析了拟南芥的时间序列的基因芯片数据，发现植物的生长发育的节律性与相关的基因表达的节律性相耦合.通过分析基因的共表达模式，鉴定到了一些新的节律调节因子.这些发现为今后探索通过改变叶绿体的基因表达来协调植物生物节律，改善植物的生长和发育提供了新的视角.
1 材料与方法
基因组芯片数据（GSE3416）从National Center for Biotechnology Information （NCBI）网站下载.根据规范的生物信息学分析流程进行数据分析.下载的基因芯片数据用Affymetrix公司的Expression Console软件和Transcriptome Analysis Console软件进行解读分析.根据计算基因表达之间差异水平的对数值筛选差异表达基因.筛选到的差异表达基因分为上调和下调两类.对每个对比数据集中发生显著上调的差异基因在Metascape数据库中做gene ontology （GO）分析. 2 结 果
2.1 基因表达节律性的基因组水平展示
从NCBI上的GEO datasets数据库下载了拟南芥昼夜节律表达的基因组芯片数据（GSE3416）[9].实验设计为：植物生长在土壤中，昼夜光照12 h/无光照12 h，温度为20 ℃.在萌发5周后，收获尚未开花植物的莲座叶，每个样品15株植物.从黑夜结束时开始（取样时仍在黑暗中），每隔4 h取一次样，每次取3个样品.下载的基因芯片数据用Expression Console软件进行解读分析.结果表明，样品间基因表达丰度上存在不同程度的差异，如图1（a）所示，这是由于不同植物之间在生长状态和代谢水平上的差异影响到了整体的基因表达丰度.进一步，对6个不同的时间点采集到的18个样品之间的重复性进行了成对的相关性分析，如图1（b）所示，样品之间的相关性系数在0.952～1.000范围内，表明数据可靠.计算每个基因在每个时间点上的平均值，并计算该基因在一天内的表达水平的变化，得到该基因表达水平上的节律振幅.用每个基因表达水平的日变化值（x）的对数值log2x来表征振幅的变化.log2x大于0.25，0.50，0.80，1.00，及2.00的基因占检测到全部基因的41.0%，30.0%，16.0%，11.0%，及2.4%.根据差异基因表达分析（log2x≤-2或者log2x≥2），2.4%基因的日振幅达到了显著差异水平.对18个样品点进行了聚类分析，由图1（c）整体聚类图可知，基因表达分为上调和下调两大类，基因表达水平在3.55～14.05范围内.不论在上调还是下调的基因簇中，基因在不同时间点之间均表现出不同程度的差异.对不同的时间点进行的聚类分析表明：时间点3（下午2点，午后）和时间点4（下午6点，傍晚，准备进入黑夜）之间的基因表达聚为一类.时间点5（晚上10点）和时间点6（凌晨2点）之间的基因表达聚为一类.暗示下午2点到下午6点时，以及夜晚10点到凌晨2点之间基因的表达波动较小.时间点1（上午6点，早晨），2（上午10点）与其他的时间点之间的聚类较远，暗示这段时间是基因表达波动较大的时间点，这与早期的研究结果是一致的，由于从上午6点到上午10点是植物光合作用快速增加的过程，在这一过程中，大量的植物代谢活动也开展起来，产生的大量的代谢物会通过不同的信号途径影响基因的表达.另外在这个过程中，光信号从无到有，逐渐加强，对植物的基因表达也起到了助推作用.
2.2 生物钟调控植物生长节奏
植物在1 ∶ 00-2 ∶ 59和7 ∶ 00-8 ∶ 59生长速度较快，在3 ∶ 00-4 ∶ 59和5 ∶ 00-6 ∶ 59生长速度达到最快.时间点3和时间点4在一天中温度和光照较高，也是植物生长速度较慢的时段.分析了这段时间的基因表达，分析结果表明：在该时段WRKY54、WRKY70、CRK10、UVR8、CAT1、AOX1a、TOC1、NPQ1和PR5等参与植物感受胁迫应答、病原菌防御、紫外线胁迫、强光胁迫和活性氧胁迫的基因的表達水平发生了强烈的诱导，说明在该时段中，植物的代谢反应更多参与了与外界环境因素的互动，因此其生长速度受到了一定的抑制.相反，在时间点1和时间点2，PIN3、ARR9、CCA、LHY、REV2等基因的表达水平明显提高了.以上结果还表明，植物的昼夜生长节奏与调节生长基因的表达相匹配，即促进生长基因的快速表达能在特定的时段调控植物的快速生长.
2.3 不同时间点差异基因的GO分析
对不同时间点的差异基因进行GO分析，结果如图2（a）～2（c）所示.在时间点2～4中，随着温度的增加，响应温度的基因表达迅速增加，居GO热图最高位，-lgP>20，表明该时段快速表达的基因主要参与了对温度的响应.参与淀粉和糖代谢的基因表达也受到了快速的诱导，-lgP>10，反映了这一时段光合作用反应到达了较高的水平.随着光照和温度的增强，参与糖苷（S-glycoside，也称为配糖体，是单糖或寡糖的半缩醛羟基与另一分子中的羟基、氨基或硫羟基等因失水而产生的水合物，广泛分布于植物的根、茎、叶、花和果实中）生物合成的基因表达活性得到了提高，但总的-lgP值逐渐降低，从时间点2到时间点4，-lgP 值由22.0减少到13.5，表明糖苷的生物合成的活性逐渐收窄.相比时间点1，参与糖苷的生物合成的基因主要在时间点2～4之间显著增加，表明它们在夜间的表达活性类似，而在白天受到快速诱导.图2（d），2（e）表明，在夜晚时段为了维持植物基因表达和代谢的节律性，与生物钟相关的基因表达受到了快速的诱导.响应于真菌侵染、水杨酸信号途径、冷适应、免疫反应、盐胁迫，以及细胞死亡相关的基因的表达在时间点5发生了高水平的诱导.这与许多病菌在夜间入侵植物的现象相匹配.在时间点6，与生长素信号、植物发育、器官生长、光合作用叶绿素合成、光形态建成等生长发育调控相关的基因的表达受到了快速的诱导，表明在这一时段，植物处在快速生长阶段.
2.4 生物钟调控参与叶绿体色素合成的基因表达
高等植物的叶绿体是光合作用的场所，也是重要的感光细胞器.叶绿体通过叶绿素吸收光能来进行光合作用.叶绿素合成后会被捕光色素结合蛋白LIGHT HARVESTING CHLOROPHYLL A/B BINDING PROTEIN（LHCB）所结合，参与对光能的吸收.LHCB的基因表达受生物节律的调控.参与叶绿素生物合成的关键基因的表达也表现出了高度的生物节律性（图3），表明叶绿素的生物合成也受生物钟调控.叶绿素的合成和血红素的合成属于四吡咯生物合成途径下游的两个不同的分支，它们从原卟啉IX处分开.GUN4、GUN5、HEMA1参与叶绿素的生物合成途径，FC1、FC2、HEMB1参与血红素的代谢途径.分析结果表明，虽然这些基因的表达具有明显的生物节律性，但是它们的节律模式是相反的.GUN4、GUN5、HEMA1的表达与CCA1/LHY的表达模式类似，在白天被逐渐抑制，而在夜晚被逐渐诱导，表明白天叶绿素的合成受到了抑制.相反，FC1、FC2、HEMB1的表达模式类似于TOC1，它们的mRNA水平在白天被诱导，在夜晚被抑制，表明光照有助于血红素的合成.当植物叶片从较低的光照条件转移到较高的光照条件下后，参与血红素合成的FC1、FC2、HEMB1的表达受到了强烈的抑制，说明强光会抑制血红素的合成.相比而言，当植物转到较高光照条件下后，GUN4的表达却受到了诱导，而GUN5和HEMA1的表达仅发生了轻微的下调，这可能是由于GUN4、GUN5、HEMA1的诱导表达主要是在夜晚，所以对光照强度的响应不太敏感.这些结果表明，光对叶绿素和血红素的生物合成起到了强烈的调节作用，这些色素的合成随着昼夜的变化发生着强烈的节律波动，以满足叶绿体光合作用的需求，并保持一定的水平，避免过度的色素积累导致对光强的过度吸收和对叶绿体造成的光氧化破坏. 2.5 新的生物鐘调节因子的鉴定
分析了CCA1和TOC1的共表达基因（图4），首先从全转录组水平扫描筛选与CCA1/LHY和TOC1共表达的基因.之后，将共表达的基因在eFP Browser中分析它们的生物节律表达模式.预测分析结果表明，BMY3、AT2G41250和COL2的表达模式与CCA1和LHY的表达模式类似，说明这些基因的表达或直接受CCA1/LHY复合物的调控，或参与了CCA1/LHY的信号通路，作为生物钟的核心震荡器调节基因的表达，例如BMY3（BETA-AMYLASE 3）编码β-淀粉酶.由于淀粉的代谢存在较强的节律性，BMY3的表达的节律性可能受淀粉代谢的节律性诱导，也有可能是由于BMY3基因表达的节律性决定了淀粉代谢的节律性.因此，BMY3的表达的节律性是植物基因表达节律性与代谢活性节律性相耦合的良好实例.AT2G42500编码Haloacid dehalogenase-like hydrolase （HAD） superfamily protein（卤代酸脱卤素酶水解酶（HAD）超家族蛋白）.植物的HAD超家族蛋白由一大群磷酸酶组成.然而至今仅有很少数的受低磷诱导的来自于HAD超家族的磷酸酶在植物中被鉴定和研究[10].Pandey 等[11]研究发现，水稻的OsHAD1编码一个有功能的酸性磷酸酶，该酶在调节水稻的无机磷酸元素的动态平衡中扮演了重要的角色.COL2（B-BOX DOMAIN PROTEIN 3），与编码锌指蛋白的开花时间基因CONSTANS（CO）同源.CO参与调节光照时长调控的植物开花，协调光信号和生物钟信号之间的相互作用.这些结果表明，COL2可能会像CO一样参与调控植物的生物钟和开花时间.与TOC1表达模式类似的基因是AT2G22450和ATOEP16-1.AT2G22450（RIBA2）编码一个核黄素生物合成蛋白，预测RIBA2可以与金属离子和GTP结合，具有3，4-二羟基-2-丁酮-4-磷酸合酶活性和GTP环化水解酶II活性.ATOEP16-1（OUTER ENVELOPE PROTEIN 16，OUTER PLASTID ENVELOPE PROTEIN 16-1）编码一种16-KDa质体外膜蛋白，参与原叶绿素酸酯氧化还原酶A向质体的输入.ATOEP16-1主要在叶片中表达，其表达对冷、葡萄糖、茉莉酸、蔗糖和伤害的处理非常敏感.将来对这些新鉴定的生物钟的调节因子的生物学功能的研究对进一步完善生物钟调控网络将是非常有意义的.
3 讨 论
在充足供应营养物和水的条件下，在昼夜交替（12 h光照/12 h黑暗）周期中生长的拟南芥野生型植物中有30%～50%的基因的转录水平表现出可重复的节律性昼夜波动.使用微阵列分析，Schaffer等[12]研究发现11%的基因的表达表现出昼夜节律性.本文作者根据差异基因表达分析发现，有2.4%的基因（1 389个）的日振幅达到了显著差异水平.从整体基因转录组水平分析，白天诱导表达的基因主要参与调控植物与环境之间的相互作用，而夜晚表达上调的基因主要参与调节植物的生长发育.此外，植物叶绿素和血红素的生物合成也受到了生物钟的调控.参于叶绿素生物合成的基因在夜晚被快速地诱导表达，而在白天被逐渐抑制，表明叶绿素的生物合成主要发生在早晨到中午之间.相反，与血红素生物合成相关的基因在白天被诱导，而在夜间被抑制，并且它们的表达在强光照条件下均被抑制.虽然叶绿素和血红素属于四吡咯生物合成途径下游的两个不同的分支，但是它们的合成反应则表现出相反的昼夜波动节律，表明植物的生化代谢途径可能通过昼夜的生物节律被分配和调控.
借助转录组的数据，对整个基因组水平上于生物钟核心震荡调节子 CCA1/LHY 和TOC1的共表达基因做了基因组水平上的扫描，鉴定到了与CCA/LHY的表达模式类似的基因BMY3、AT2G41250 和 COL2，以及与TOC1的表达模式类似的基因AT2G22450 和 ATOEP16-1.潜在的分子功能预测分析表明，这些基因可能独立，或者与CCA1/LHY和TOC1一起参与调节植物的生物钟.今后将通过突变体筛选、分子生物学检测和生理生化分析解析这些新鉴定到的生物钟调节因子的分子功能.
参考文献：
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[2] Harmer S L，Panda S，Kay S A.Molecular bases of circadian rhythms [J].Annual Review of Cell and Developmental Biology，2001，17：215-253.
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[4] Schaffer R，Ramsay N，Samach A，et al.The late elongated hypocotyl mutation of Arabidopsis disrupts circadian rhythms and the photoperiodic control of flowering [J].Cell，1998，93（7）：1219-1229.
[5] Strayer C，Oyama T，Schultz T F，et al.Cloning of the Arabidopsis clock gene TOC1，an autoregulatory response regulator homolog [J].Science，2000，289（5480）：768-771. [6] Alabadí D，Oyama T，Yanovsky M J，et al.Reciprocal regulation between TOC1 and LHY/CCA1 within the Arabidopsis circadian clock [J].Science，2001，293（5531）：880-883.
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[8] Kreps J A，Kay S A.Coordination of plant metabolism and development by the circadian clock [J].Plant Cell，1997，9：1235-1244.
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[10] Zhang D，Song H N，Cheng H，et al.The acid phosphatase-encoding gene GmACP1 contributes to soybean tolerance to low-phosphorus stress [J].PLoS Genetics，2014，10：1004061.
[11] Pandey B K，Mehra P，Verma L，et al.OsHAD1，a haloacid dehalogenase-like APase enhances phosphate accumulation [J].Plant physiology，2017，174（4）：2316-2332.
[12] Schaffer R，Landgraf J，Accerbi M，et al.Microarray analysis of diurnal and circadian-regulated genes in Arabidopsis [J].The Plant Cell，2001，13（1）：113-123.
（責任编辑：顾浩然）
关键词： 转录物组学； 植物； 生长发育； 生物钟
中图分类号： Q 756 文献标志码： A 文章编号： 1000-5137（2018）04-0444-07
Abstract： Based on the time series genomic microarray data of Arabidopsis thaliana，the gene expression pattern was analyzed，and it was found that 2.4% of the genes had a significant difference in daily amplitude.From the analysis of the overall gene transcriptome level，the genes induced during the day are mainly involved in the regulation of the interaction between plants and the environment，while the genes whose expression is up-regulated at night are mainly involved in regulating the growth and development of plants.In addition，the biosynthesis of plant chlorophyll and hemeare also regulated by the circadian clock.A group of new potential biorhythm regulators were identified by analyzing the genes that show co-expressing with CCA1/LHY or TOC1.These data will provide a reference for the more systematic improvement of the regulatory network of plant circadian clock.
Key words： transcriptomic； plant；growth and development； circadian clock
0 引 言
地球的自转带来环境中光和温度的昼夜周期性变化.有机体在漫长的演化过程中发展出用以预测这种环境波动的调节机制，并通过“生物钟”将其细胞活动与昼夜周期同步[1].生物钟可以将环境信号转化为时间信息，有节奏地协调新陈代谢和生理活性.大量的研究表明生物钟参与调节诸多植物生理过程，如：叶子、子叶和花瓣的运动，叶绿体的亚细胞定位，胚胎干（下胚轴）的生长，气孔的打开和关闭，以及开花时间等[1].Harmer等[2]发现哺乳动物、昆虫、真菌和植物的生物钟存在保守的调节机制.常见的调节机制涉及到了振荡器核心部位的转录反馈循环[2].拟南芥的生物钟组分包括单个MYB转录因子CIRCADIAN CLOCK ASSOCIATED 1（CCA1）[3]和LATE ELONGATED HYPOCOTYL（LHY）[4].在任一基因被組成型过表达的植物中，时钟均不能正常工作，导致节律失常，而丧失功能的CCA1或LHY突变仍能保持节奏性，但其周期缩短了[4].此外TIMING OF CAB EXPRESSION 1（TOC1）也是拟南芥生物钟的重要组成部分[5].与CCA1或LHY过表达类似，组成型的过表达TOC1引起多个生物钟输出节律的失常，进一步的研究揭示了CCA1、LHY和TOC1之间的功能联系和相互调控关系[5].根据这个模型，部分功能冗余的转录因子CCA1和LHY作为负向调节子通过直接结合TOC1启动子中的Evening Element （EE） motif来抑制TOC1的表达[6].此外McWatters等[7]鉴定到了新的生物钟核心组件，包括TOC1家族的其他成员，称为PSEUDO RESPONSE REGULATORS 3，5，7和9（PRR3，PRR5，PRR7和PRR9），EARLY FLOWERING 4（ELF4），GARP（GOLDEN2，ARR-B，Psr1）-MYB-结构域转录因子LUX ARRHYTHMO（LUX）或PHYTOCLOCK1（PCL1）和GIGANTEA（GI）.光合作用中一些重要的分子过程是在黎明前启动的，因此在日出之前植物已经准备好最大限度地利用可见光进行光合作用[8].此外，有机体在太阳升起之前可能会产生滤光色素，以避免可见光和紫外线的损害[8].本文作者系统分析了拟南芥的时间序列的基因芯片数据，发现植物的生长发育的节律性与相关的基因表达的节律性相耦合.通过分析基因的共表达模式，鉴定到了一些新的节律调节因子.这些发现为今后探索通过改变叶绿体的基因表达来协调植物生物节律，改善植物的生长和发育提供了新的视角.
1 材料与方法
基因组芯片数据（GSE3416）从National Center for Biotechnology Information （NCBI）网站下载.根据规范的生物信息学分析流程进行数据分析.下载的基因芯片数据用Affymetrix公司的Expression Console软件和Transcriptome Analysis Console软件进行解读分析.根据计算基因表达之间差异水平的对数值筛选差异表达基因.筛选到的差异表达基因分为上调和下调两类.对每个对比数据集中发生显著上调的差异基因在Metascape数据库中做gene ontology （GO）分析. 2 结 果
2.1 基因表达节律性的基因组水平展示
从NCBI上的GEO datasets数据库下载了拟南芥昼夜节律表达的基因组芯片数据（GSE3416）[9].实验设计为：植物生长在土壤中，昼夜光照12 h/无光照12 h，温度为20 ℃.在萌发5周后，收获尚未开花植物的莲座叶，每个样品15株植物.从黑夜结束时开始（取样时仍在黑暗中），每隔4 h取一次样，每次取3个样品.下载的基因芯片数据用Expression Console软件进行解读分析.结果表明，样品间基因表达丰度上存在不同程度的差异，如图1（a）所示，这是由于不同植物之间在生长状态和代谢水平上的差异影响到了整体的基因表达丰度.进一步，对6个不同的时间点采集到的18个样品之间的重复性进行了成对的相关性分析，如图1（b）所示，样品之间的相关性系数在0.952～1.000范围内，表明数据可靠.计算每个基因在每个时间点上的平均值，并计算该基因在一天内的表达水平的变化，得到该基因表达水平上的节律振幅.用每个基因表达水平的日变化值（x）的对数值log2x来表征振幅的变化.log2x大于0.25，0.50，0.80，1.00，及2.00的基因占检测到全部基因的41.0%，30.0%，16.0%，11.0%，及2.4%.根据差异基因表达分析（log2x≤-2或者log2x≥2），2.4%基因的日振幅达到了显著差异水平.对18个样品点进行了聚类分析，由图1（c）整体聚类图可知，基因表达分为上调和下调两大类，基因表达水平在3.55～14.05范围内.不论在上调还是下调的基因簇中，基因在不同时间点之间均表现出不同程度的差异.对不同的时间点进行的聚类分析表明：时间点3（下午2点，午后）和时间点4（下午6点，傍晚，准备进入黑夜）之间的基因表达聚为一类.时间点5（晚上10点）和时间点6（凌晨2点）之间的基因表达聚为一类.暗示下午2点到下午6点时，以及夜晚10点到凌晨2点之间基因的表达波动较小.时间点1（上午6点，早晨），2（上午10点）与其他的时间点之间的聚类较远，暗示这段时间是基因表达波动较大的时间点，这与早期的研究结果是一致的，由于从上午6点到上午10点是植物光合作用快速增加的过程，在这一过程中，大量的植物代谢活动也开展起来，产生的大量的代谢物会通过不同的信号途径影响基因的表达.另外在这个过程中，光信号从无到有，逐渐加强，对植物的基因表达也起到了助推作用.
2.2 生物钟调控植物生长节奏
植物在1 ∶ 00-2 ∶ 59和7 ∶ 00-8 ∶ 59生长速度较快，在3 ∶ 00-4 ∶ 59和5 ∶ 00-6 ∶ 59生长速度达到最快.时间点3和时间点4在一天中温度和光照较高，也是植物生长速度较慢的时段.分析了这段时间的基因表达，分析结果表明：在该时段WRKY54、WRKY70、CRK10、UVR8、CAT1、AOX1a、TOC1、NPQ1和PR5等参与植物感受胁迫应答、病原菌防御、紫外线胁迫、强光胁迫和活性氧胁迫的基因的表達水平发生了强烈的诱导，说明在该时段中，植物的代谢反应更多参与了与外界环境因素的互动，因此其生长速度受到了一定的抑制.相反，在时间点1和时间点2，PIN3、ARR9、CCA、LHY、REV2等基因的表达水平明显提高了.以上结果还表明，植物的昼夜生长节奏与调节生长基因的表达相匹配，即促进生长基因的快速表达能在特定的时段调控植物的快速生长.
2.3 不同时间点差异基因的GO分析
对不同时间点的差异基因进行GO分析，结果如图2（a）～2（c）所示.在时间点2～4中，随着温度的增加，响应温度的基因表达迅速增加，居GO热图最高位，-lgP>20，表明该时段快速表达的基因主要参与了对温度的响应.参与淀粉和糖代谢的基因表达也受到了快速的诱导，-lgP>10，反映了这一时段光合作用反应到达了较高的水平.随着光照和温度的增强，参与糖苷（S-glycoside，也称为配糖体，是单糖或寡糖的半缩醛羟基与另一分子中的羟基、氨基或硫羟基等因失水而产生的水合物，广泛分布于植物的根、茎、叶、花和果实中）生物合成的基因表达活性得到了提高，但总的-lgP值逐渐降低，从时间点2到时间点4，-lgP 值由22.0减少到13.5，表明糖苷的生物合成的活性逐渐收窄.相比时间点1，参与糖苷的生物合成的基因主要在时间点2～4之间显著增加，表明它们在夜间的表达活性类似，而在白天受到快速诱导.图2（d），2（e）表明，在夜晚时段为了维持植物基因表达和代谢的节律性，与生物钟相关的基因表达受到了快速的诱导.响应于真菌侵染、水杨酸信号途径、冷适应、免疫反应、盐胁迫，以及细胞死亡相关的基因的表达在时间点5发生了高水平的诱导.这与许多病菌在夜间入侵植物的现象相匹配.在时间点6，与生长素信号、植物发育、器官生长、光合作用叶绿素合成、光形态建成等生长发育调控相关的基因的表达受到了快速的诱导，表明在这一时段，植物处在快速生长阶段.
2.4 生物钟调控参与叶绿体色素合成的基因表达
高等植物的叶绿体是光合作用的场所，也是重要的感光细胞器.叶绿体通过叶绿素吸收光能来进行光合作用.叶绿素合成后会被捕光色素结合蛋白LIGHT HARVESTING CHLOROPHYLL A/B BINDING PROTEIN（LHCB）所结合，参与对光能的吸收.LHCB的基因表达受生物节律的调控.参与叶绿素生物合成的关键基因的表达也表现出了高度的生物节律性（图3），表明叶绿素的生物合成也受生物钟调控.叶绿素的合成和血红素的合成属于四吡咯生物合成途径下游的两个不同的分支，它们从原卟啉IX处分开.GUN4、GUN5、HEMA1参与叶绿素的生物合成途径，FC1、FC2、HEMB1参与血红素的代谢途径.分析结果表明，虽然这些基因的表达具有明显的生物节律性，但是它们的节律模式是相反的.GUN4、GUN5、HEMA1的表达与CCA1/LHY的表达模式类似，在白天被逐渐抑制，而在夜晚被逐渐诱导，表明白天叶绿素的合成受到了抑制.相反，FC1、FC2、HEMB1的表达模式类似于TOC1，它们的mRNA水平在白天被诱导，在夜晚被抑制，表明光照有助于血红素的合成.当植物叶片从较低的光照条件转移到较高的光照条件下后，参与血红素合成的FC1、FC2、HEMB1的表达受到了强烈的抑制，说明强光会抑制血红素的合成.相比而言，当植物转到较高光照条件下后，GUN4的表达却受到了诱导，而GUN5和HEMA1的表达仅发生了轻微的下调，这可能是由于GUN4、GUN5、HEMA1的诱导表达主要是在夜晚，所以对光照强度的响应不太敏感.这些结果表明，光对叶绿素和血红素的生物合成起到了强烈的调节作用，这些色素的合成随着昼夜的变化发生着强烈的节律波动，以满足叶绿体光合作用的需求，并保持一定的水平，避免过度的色素积累导致对光强的过度吸收和对叶绿体造成的光氧化破坏. 2.5 新的生物鐘调节因子的鉴定
分析了CCA1和TOC1的共表达基因（图4），首先从全转录组水平扫描筛选与CCA1/LHY和TOC1共表达的基因.之后，将共表达的基因在eFP Browser中分析它们的生物节律表达模式.预测分析结果表明，BMY3、AT2G41250和COL2的表达模式与CCA1和LHY的表达模式类似，说明这些基因的表达或直接受CCA1/LHY复合物的调控，或参与了CCA1/LHY的信号通路，作为生物钟的核心震荡器调节基因的表达，例如BMY3（BETA-AMYLASE 3）编码β-淀粉酶.由于淀粉的代谢存在较强的节律性，BMY3的表达的节律性可能受淀粉代谢的节律性诱导，也有可能是由于BMY3基因表达的节律性决定了淀粉代谢的节律性.因此，BMY3的表达的节律性是植物基因表达节律性与代谢活性节律性相耦合的良好实例.AT2G42500编码Haloacid dehalogenase-like hydrolase （HAD） superfamily protein（卤代酸脱卤素酶水解酶（HAD）超家族蛋白）.植物的HAD超家族蛋白由一大群磷酸酶组成.然而至今仅有很少数的受低磷诱导的来自于HAD超家族的磷酸酶在植物中被鉴定和研究[10].Pandey 等[11]研究发现，水稻的OsHAD1编码一个有功能的酸性磷酸酶，该酶在调节水稻的无机磷酸元素的动态平衡中扮演了重要的角色.COL2（B-BOX DOMAIN PROTEIN 3），与编码锌指蛋白的开花时间基因CONSTANS（CO）同源.CO参与调节光照时长调控的植物开花，协调光信号和生物钟信号之间的相互作用.这些结果表明，COL2可能会像CO一样参与调控植物的生物钟和开花时间.与TOC1表达模式类似的基因是AT2G22450和ATOEP16-1.AT2G22450（RIBA2）编码一个核黄素生物合成蛋白，预测RIBA2可以与金属离子和GTP结合，具有3，4-二羟基-2-丁酮-4-磷酸合酶活性和GTP环化水解酶II活性.ATOEP16-1（OUTER ENVELOPE PROTEIN 16，OUTER PLASTID ENVELOPE PROTEIN 16-1）编码一种16-KDa质体外膜蛋白，参与原叶绿素酸酯氧化还原酶A向质体的输入.ATOEP16-1主要在叶片中表达，其表达对冷、葡萄糖、茉莉酸、蔗糖和伤害的处理非常敏感.将来对这些新鉴定的生物钟的调节因子的生物学功能的研究对进一步完善生物钟调控网络将是非常有意义的.
3 讨 论
在充足供应营养物和水的条件下，在昼夜交替（12 h光照/12 h黑暗）周期中生长的拟南芥野生型植物中有30%～50%的基因的转录水平表现出可重复的节律性昼夜波动.使用微阵列分析，Schaffer等[12]研究发现11%的基因的表达表现出昼夜节律性.本文作者根据差异基因表达分析发现，有2.4%的基因（1 389个）的日振幅达到了显著差异水平.从整体基因转录组水平分析，白天诱导表达的基因主要参与调控植物与环境之间的相互作用，而夜晚表达上调的基因主要参与调节植物的生长发育.此外，植物叶绿素和血红素的生物合成也受到了生物钟的调控.参于叶绿素生物合成的基因在夜晚被快速地诱导表达，而在白天被逐渐抑制，表明叶绿素的生物合成主要发生在早晨到中午之间.相反，与血红素生物合成相关的基因在白天被诱导，而在夜间被抑制，并且它们的表达在强光照条件下均被抑制.虽然叶绿素和血红素属于四吡咯生物合成途径下游的两个不同的分支，但是它们的合成反应则表现出相反的昼夜波动节律，表明植物的生化代谢途径可能通过昼夜的生物节律被分配和调控.
借助转录组的数据，对整个基因组水平上于生物钟核心震荡调节子 CCA1/LHY 和TOC1的共表达基因做了基因组水平上的扫描，鉴定到了与CCA/LHY的表达模式类似的基因BMY3、AT2G41250 和 COL2，以及与TOC1的表达模式类似的基因AT2G22450 和 ATOEP16-1.潜在的分子功能预测分析表明，这些基因可能独立，或者与CCA1/LHY和TOC1一起参与调节植物的生物钟.今后将通过突变体筛选、分子生物学检测和生理生化分析解析这些新鉴定到的生物钟调节因子的分子功能.
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（責任编辑：顾浩然）