花鳗鲡脑cDNA文库的构建及GnRH基因克隆与表达分析

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以花鳗鲡脑组织为材料,提取总RNA,应用CloneminerTM文库构建试剂盒构建cDNA文库。经检测,文库的滴度为4.3×106cfu/mL,总容量为5.16×107cfu/mL,阳性克隆率为99.6%,插入片段0.43—3.2kb之间,平均插入片段大小为1532bp。以文库为模板,克隆获得花鳗鲡两种类型的促性腺激素释放激素(mGnRH和cGnRH-II)cDNA序列。序列分析表明,花鳗鲡mGnRHcDNA开放阅读框(ORF)包含276个碱基,编码91个氨基酸,其中包括22个氨基酸的蛋白质前体信号肽(1—22位氨基酸)、mGnRH十肽(23—32位氨基酸)、一个三肽裂解位点(33—35位氨基酸)和56个氨基酸的GnRH相关肽(36—91位氨基酸);花鳗鲡cGnRH-IIcDNA开放阅读框包含264个碱基,编码87个氨基酸,其中包括24个氨基酸的蛋白质前体信号肽(1—24位氨基酸)、cGnRH-II十肽(25—34位氨基酸)、一个三肽裂解位点(34—36位氨基酸)和50个氨基酸的GnRH相关肽(37—87位氨基酸)。序列同源性分析表明,花鳗鲡mGnRH、cGnRH-IIcDNA与日本鳗鲡之间的相似性率高达98%;与鲑形目、鲈形目、鲽形目鱼类的相似率为73%—78%;而与鲤形目鱼类的相似性相对较低(63%—67%)。采用RT-PCR方法分析了两种GnRH基因在花鳗鲡雌雄个体中的表达,结果表明两基因在雌雄个体的组织表达模式无明显差异;但mGnRH基因在雌雄个体内表达部位多于cGnRH-II的。
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