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【摘要】目的：探讨芍药苷对动脉粥样硬化小鼠模型主动脉斑块、血脂、血清甲基化及DNA甲基转移酶水平的影响。方法：30 只 8 周龄雄性 ApoE-/-小鼠高脂喂养9周后，随机分为模型组、立普妥组（阳性对照组）和芍药苷组。继续喂养并药物干预9周后，分别检测三组小鼠血脂、血清 DNA 甲基化水平及 DNMT1水平;行HE染色，采用 IPP 图像分析软件测量小鼠主动脉斑块面积。结果：芍药苷可減小动脉粥样硬化小鼠主动脉斑块性对面积，降低血清TG、LDL-C水平，并降低血清DNA甲基化及DNMTI水平。结论：芍药苷可通过降低血脂、血清甲基化及DNMT1 水平从而抑制动脉粥样硬化斑块形成，干预动脉粥样硬化进展。
【关键词】芍药苷;动脉粥样硬化;血脂;甲基化;DNA甲基化转移酶
中图分类号：R285.5
前言
心血管疾病是引起人类死亡的首要原因;据统计，在我国因病死亡人数中约2/5死于心血管疾病。动脉粥样硬化是包括冠状动脉粥样性心脏病在内的诸多心血管疾病的病理基础，因此有效缓解动脉粥样硬化是预防及治疗心血管疾病的基础。在动脉粥样硬化的发生过程中，脂代谢紊乱发挥着重要的作用;而DNA甲基化与脂代谢紊乱具有密切关系。芍药苷是中药赤芍的主要苷类化合物之一;研究表明，芍药苷具有显著的抗氧化能力及降脂和抑制主动脉斑块形成的作用。本实验以高脂饮食喂养的ApoE -/- 小鼠为观察对象，探讨芍药苷对动脉粥样硬化模型小鼠的主动脉斑块、血脂及DNA甲基化的影响。
1.材料与方法
1.1 动物与饲料
30只6-8周龄ApoE-/-小鼠（雄性，品系C57BL/6J），体重约18-20g，购自北京维通利华实验技术有限公司，许可证号：SCXK（京）2012-0001。高脂饲料：21%脂肪（wt/wt）、0.15%胆固醇（wt/wt），购于北京科奥协力饲料有限公司，许可证号：SCXK（京）2009-0012。
1.2 药物
芍药苷购自泽朗医药公司生产（批号：20140315）;阿托伐他汀钙（商品名立普妥）购自辉瑞制药有限公司（批号：H20051408）。
1.3 分组及模型的制备
所有小鼠饲养于SPF级动物室，正常饲料适应性喂养3日后，ApoE-/-小鼠更换为高脂饲料，自由采食摄水。9周后，随机分为模型组、立普妥组，芍药苷组（n=10）。据成人临床推荐日用量，按体重系数比折算小鼠给药量：立普妥3mg/kg ，芍药苷0.12g/kg（折算系数为9.01，公式：成人日用量/60kg×9.01=小鼠日用量/kg）。药物溶解于蒸馏水中，每日灌胃给药1次，模型组给予等量蒸馏水灌胃，继续高脂喂养9周。
1.4 血脂的检测
严格按照试剂盒说明书，检测血清总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）和高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）水平。
1.5 血清DNA甲基化及DNA甲基转移酶水平的检测
严格按照试剂盒说明书，采用 ELISA 法检测DNA 甲基化转移酶（DNMT）水平。采用高效液相色谱法（HPLC）检测血清 DNA 甲基化水平。
1.6 主动脉斑块面积的测定
无菌条件下取各组小鼠心脏，经脱水、包埋、切片，按照Suzuki等建立的方法，取小鼠主动脉瓣起始横断面，每隔100μm取4张切片，切片厚5μm。行HE 染色，后使用IPP软件测量各只小鼠斑块面积，后计算斑块占占管腔百分比。
1.7 统计学方法
实验数据以均数±标准差（ ±s）表示。使用GraphPad Prism6.01软件对数据进行统计分析。两组间采用t检验;多组间比较采用单因素方差分析，p﹤0.05表示差异有统计学意义。
2.结果
2.1 动脉粥样硬化小鼠模型的建立及芍药苷对主动脉斑块的影响
药物干预9周后，模型组小鼠主动脉根部可见明显动脉粥样硬化斑块，伴大量胆固醇结晶伴泡沫细胞聚集（图1A）。立普妥组（图1B）及芍药苷组（图1C）斑块相对面积较模型组显著减小，立普妥组斑块相对面积较芍药苷组显著降低，差异有统计学意义（表1）。
2.2 芍药苷对动脉粥样硬化模型小鼠血脂的影响
药物干预9周后，与模型组相比，立普妥及芍药苷可显著降低血清TG与LDL-C水平;但立普妥降低甘油三酯水平较芍药苷更为显著;芍药苷可显著升高血清HDL-C水平。（表2）
2.3 芍药苷降低动脉粥样硬化模型小鼠血清DNA甲基化水平及DNMT1水平
药物干预 9周后，立普妥组及芍药苷组小鼠血清DNA甲基化水平较模型组明显降低;立普妥组与芍药苷组之间无明显差异。立普妥组与芍药苷组小鼠血清DNMT水平较模型组亦明显降低（P<0.01），两组间无明显差异。（表3）
3.讨论
芍药苷为常用传统中药芍药的主要有效成分，是一种单萜类糖苷化合物，具有广泛的药理作用。研究表明，芍药苷具有抗氧化，抗炎，抗凝、抗高血糖、降血脂及抗动脉硬化等多种生物学效应，且毒副作用较小。动脉粥样硬化是以脂代谢紊乱为主要病因的一类病理性血管疾病;自1999年以来，动脉粥样硬化被认为是一种慢性炎症病变，而脂代谢紊乱则被认为是血管内膜炎症反应的发生关键因素，在As过程中发挥着重要作用。
DNA甲基化是表观遗传学的一种重要方式，在维持生物体多种正常功能及疾病的发生、发展中发挥着重要作用。研究证实，在脂代谢紊乱过程中与脂代谢密切相关的多种基因存在着DNA甲基化现象。另外，DNA 甲基化可通过调控与AS有关的炎症免疫细胞和炎症因子来影响 AS 的发生与发展。基因组甲基化水平与冠心病及冠心病风险呈正相关。 本研究以高脂饮食喂养ApoE-/-小鼠制备动脉粥样硬化模型，经药物干预治疗后检测其血脂、主动脉斑块相对面积及血清DNA甲基化及DNMT1水平以探讨芍药苷对动脉粥样硬化的作用。结果可见：芍药苷可有效降低动脉粥样硬化小鼠血清TG及LDL-C水平，并可增加HDL-C水平，此种作用可能是芍药苷发挥抗动脉粥样硬化作用的基础。而芍药苷降低基因組DNA甲基化水平及DNMT1水平可能是其发挥降低血脂的途径之一;但其具体机制仍待进一步研究。
参考文献
[1] Eastwood JA， Doering LV， Dracup K， et al. Health-related quality of life： The impact of diagnostic angiograph[J]. Heart Lung， 2011， 40（2）： 147-155
[2] 陈伟伟， 高润霖， 刘力生， 等. 中国心血管病报告2014概要[J]. 中国循环杂志， 2015， 30（07）： 617- 622.
[3]康群甫，周明学，孙丽，贾丽超，刘卫红.动脉粥样硬化脂代谢紊乱与DNA甲基化的关系[J].现代生物医学进展，2016，16（23）：4586-4589.
[4]吴东方，靳善睿，刘娟，吴建华，肖艳红，胡桑，喻红.芍药苷抗ApoE基因缺失小鼠动脉粥样硬化作用的初步研究[J].中国医院药学杂志，2015，35（05）：385-388.
[5]许文平，王艳艳，孟笑玮，王怡.芍药苷对ApoE～（-/-）小鼠血脂及主动脉斑块的影响[J].天津中医药大学学报，2014，33（04）：210-212.
[6] Zhou MX， Xu H， Pan L， et al. Rosiglitazone promotes atherosclerotic plaque stability in fat-fed ApoE-knockout mice[J]. European Journal of Pharmacology， 2008， 590（1-3）： 297-302.
[7] Suzuki H， Kurihara Y， Takeya M， et al. A role for macrophage scavenger receptors in atherosclerosis and susceptibility to infection[J]. Nature， 1997， 386（6622）： 292-296.
[8] Zhang LL， Wei W， Wang NP， Wang QT， Chen JY， Chen Y， et al. Paeoniflorin suppresses inflammatory mediator production and regulates G protein-coupled signaling in fibroblast-like synoviocytes of collagen induced arthritic rats. Inflamm Res 2008;57：388–95.
[9]Hsu FL， Lai CW， Cheng JT. Antihyperglycemic effects of paeoniflorin and 8-debenzoylpaeoniflorin， glucosides from the root of Paeonia lactiflora. Planta Med 1997;63：323–5.
[10] Ross R. Atherosclerosis-an inflammatory disease[J]. N Engl J Med. 1999. 340（2）： 115-126.
[11] 田海涛，曹芳英，朱智明等.心血管疾病不容忽视的问题：血管内皮细胞损伤[J].转化医学杂志，2013，2（3）：173-177.
[12] 杨海燕，王萍.温胆汤对脂质代谢紊乱相关基因Adiponectin 和 LDLR 甲基化的影响[J].江西中医药，2014，（11）：23-25.
[13]Revankar C M，Cimino D F，Sklar L A，et al. A transmembrane intracellular estrogen receptor mediates rapid cell signaling[J]. Science，2005，307（5715）：1625-1630.
[14]Yu J，Qiu Y，Yang J，et al.DNMT1-PPARγ pathway in macrophages regulates chronic inflammation and atherosclerosis development in mice[J].Sci Rep，2016，（17）：30053.
【关键词】芍药苷;动脉粥样硬化;血脂;甲基化;DNA甲基化转移酶
中图分类号：R285.5
前言
心血管疾病是引起人类死亡的首要原因;据统计，在我国因病死亡人数中约2/5死于心血管疾病。动脉粥样硬化是包括冠状动脉粥样性心脏病在内的诸多心血管疾病的病理基础，因此有效缓解动脉粥样硬化是预防及治疗心血管疾病的基础。在动脉粥样硬化的发生过程中，脂代谢紊乱发挥着重要的作用;而DNA甲基化与脂代谢紊乱具有密切关系。芍药苷是中药赤芍的主要苷类化合物之一;研究表明，芍药苷具有显著的抗氧化能力及降脂和抑制主动脉斑块形成的作用。本实验以高脂饮食喂养的ApoE -/- 小鼠为观察对象，探讨芍药苷对动脉粥样硬化模型小鼠的主动脉斑块、血脂及DNA甲基化的影响。
1.材料与方法
1.1 动物与饲料
30只6-8周龄ApoE-/-小鼠（雄性，品系C57BL/6J），体重约18-20g，购自北京维通利华实验技术有限公司，许可证号：SCXK（京）2012-0001。高脂饲料：21%脂肪（wt/wt）、0.15%胆固醇（wt/wt），购于北京科奥协力饲料有限公司，许可证号：SCXK（京）2009-0012。
1.2 药物
芍药苷购自泽朗医药公司生产（批号：20140315）;阿托伐他汀钙（商品名立普妥）购自辉瑞制药有限公司（批号：H20051408）。
1.3 分组及模型的制备
所有小鼠饲养于SPF级动物室，正常饲料适应性喂养3日后，ApoE-/-小鼠更换为高脂饲料，自由采食摄水。9周后，随机分为模型组、立普妥组，芍药苷组（n=10）。据成人临床推荐日用量，按体重系数比折算小鼠给药量：立普妥3mg/kg ，芍药苷0.12g/kg（折算系数为9.01，公式：成人日用量/60kg×9.01=小鼠日用量/kg）。药物溶解于蒸馏水中，每日灌胃给药1次，模型组给予等量蒸馏水灌胃，继续高脂喂养9周。
1.4 血脂的检测
严格按照试剂盒说明书，检测血清总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）和高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）水平。
1.5 血清DNA甲基化及DNA甲基转移酶水平的检测
严格按照试剂盒说明书，采用 ELISA 法检测DNA 甲基化转移酶（DNMT）水平。采用高效液相色谱法（HPLC）检测血清 DNA 甲基化水平。
1.6 主动脉斑块面积的测定
无菌条件下取各组小鼠心脏，经脱水、包埋、切片，按照Suzuki等建立的方法，取小鼠主动脉瓣起始横断面，每隔100μm取4张切片，切片厚5μm。行HE 染色，后使用IPP软件测量各只小鼠斑块面积，后计算斑块占占管腔百分比。
1.7 统计学方法
实验数据以均数±标准差（ ±s）表示。使用GraphPad Prism6.01软件对数据进行统计分析。两组间采用t检验;多组间比较采用单因素方差分析，p﹤0.05表示差异有统计学意义。
2.结果
2.1 动脉粥样硬化小鼠模型的建立及芍药苷对主动脉斑块的影响
药物干预9周后，模型组小鼠主动脉根部可见明显动脉粥样硬化斑块，伴大量胆固醇结晶伴泡沫细胞聚集（图1A）。立普妥组（图1B）及芍药苷组（图1C）斑块相对面积较模型组显著减小，立普妥组斑块相对面积较芍药苷组显著降低，差异有统计学意义（表1）。
2.2 芍药苷对动脉粥样硬化模型小鼠血脂的影响
药物干预9周后，与模型组相比，立普妥及芍药苷可显著降低血清TG与LDL-C水平;但立普妥降低甘油三酯水平较芍药苷更为显著;芍药苷可显著升高血清HDL-C水平。（表2）
2.3 芍药苷降低动脉粥样硬化模型小鼠血清DNA甲基化水平及DNMT1水平
药物干预 9周后，立普妥组及芍药苷组小鼠血清DNA甲基化水平较模型组明显降低;立普妥组与芍药苷组之间无明显差异。立普妥组与芍药苷组小鼠血清DNMT水平较模型组亦明显降低（P<0.01），两组间无明显差异。（表3）
3.讨论
芍药苷为常用传统中药芍药的主要有效成分，是一种单萜类糖苷化合物，具有广泛的药理作用。研究表明，芍药苷具有抗氧化，抗炎，抗凝、抗高血糖、降血脂及抗动脉硬化等多种生物学效应，且毒副作用较小。动脉粥样硬化是以脂代谢紊乱为主要病因的一类病理性血管疾病;自1999年以来，动脉粥样硬化被认为是一种慢性炎症病变，而脂代谢紊乱则被认为是血管内膜炎症反应的发生关键因素，在As过程中发挥着重要作用。
DNA甲基化是表观遗传学的一种重要方式，在维持生物体多种正常功能及疾病的发生、发展中发挥着重要作用。研究证实，在脂代谢紊乱过程中与脂代谢密切相关的多种基因存在着DNA甲基化现象。另外，DNA 甲基化可通过调控与AS有关的炎症免疫细胞和炎症因子来影响 AS 的发生与发展。基因组甲基化水平与冠心病及冠心病风险呈正相关。 本研究以高脂饮食喂养ApoE-/-小鼠制备动脉粥样硬化模型，经药物干预治疗后检测其血脂、主动脉斑块相对面积及血清DNA甲基化及DNMT1水平以探讨芍药苷对动脉粥样硬化的作用。结果可见：芍药苷可有效降低动脉粥样硬化小鼠血清TG及LDL-C水平，并可增加HDL-C水平，此种作用可能是芍药苷发挥抗动脉粥样硬化作用的基础。而芍药苷降低基因組DNA甲基化水平及DNMT1水平可能是其发挥降低血脂的途径之一;但其具体机制仍待进一步研究。
参考文献
[1] Eastwood JA， Doering LV， Dracup K， et al. Health-related quality of life： The impact of diagnostic angiograph[J]. Heart Lung， 2011， 40（2）： 147-155
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[4]吴东方，靳善睿，刘娟，吴建华，肖艳红，胡桑，喻红.芍药苷抗ApoE基因缺失小鼠动脉粥样硬化作用的初步研究[J].中国医院药学杂志，2015，35（05）：385-388.
[5]许文平，王艳艳，孟笑玮，王怡.芍药苷对ApoE～（-/-）小鼠血脂及主动脉斑块的影响[J].天津中医药大学学报，2014，33（04）：210-212.
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[7] Suzuki H， Kurihara Y， Takeya M， et al. A role for macrophage scavenger receptors in atherosclerosis and susceptibility to infection[J]. Nature， 1997， 386（6622）： 292-296.
[8] Zhang LL， Wei W， Wang NP， Wang QT， Chen JY， Chen Y， et al. Paeoniflorin suppresses inflammatory mediator production and regulates G protein-coupled signaling in fibroblast-like synoviocytes of collagen induced arthritic rats. Inflamm Res 2008;57：388–95.
[9]Hsu FL， Lai CW， Cheng JT. Antihyperglycemic effects of paeoniflorin and 8-debenzoylpaeoniflorin， glucosides from the root of Paeonia lactiflora. Planta Med 1997;63：323–5.
[10] Ross R. Atherosclerosis-an inflammatory disease[J]. N Engl J Med. 1999. 340（2）： 115-126.
[11] 田海涛，曹芳英，朱智明等.心血管疾病不容忽视的问题：血管内皮细胞损伤[J].转化医学杂志，2013，2（3）：173-177.
[12] 杨海燕，王萍.温胆汤对脂质代谢紊乱相关基因Adiponectin 和 LDLR 甲基化的影响[J].江西中医药，2014，（11）：23-25.
[13]Revankar C M，Cimino D F，Sklar L A，et al. A transmembrane intracellular estrogen receptor mediates rapid cell signaling[J]. Science，2005，307（5715）：1625-1630.
[14]Yu J，Qiu Y，Yang J，et al.DNMT1-PPARγ pathway in macrophages regulates chronic inflammation and atherosclerosis development in mice[J].Sci Rep，2016，（17）：30053.