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[摘要] 目的 研究长春地区598例乙型肝炎患者乙型肝炎病毒（hepatitis B virus）基因分型及耐药基因突变情况。方法 收集598例HBVDNA高于检测下限（>1000拷贝/mL）乙型肝炎患者血清，PCR反向点杂交法检测HBV基因型和耐药变异位点。 结果 598例样本中， B基因型35例（5.85%）， C基因型525例（87.79%），BC混合基因型32例（5.35%），D基因型2例（0.33%），未分型4例（0.67%）。79例发生HBV耐药变异，总体变异率为13.21% ，其中B基因型3例（3.80%），C基因型73例（92.41%），BC混合基因型2例（2.53%），未分型1例（1.27%）； rtM204检出率最高75.94%（60/79）， rtM204变异位点耐药突变模式有10种类型。 结论 长春地区HBV感染患者基因型以C基因型为主，HBV基因耐药以rtM204位点检出率最高，变异模式复杂。
[关键词]乙型肝炎；HBV基因分型；基因耐药；PCR反向点杂交法
[中图分类号] R446.61 [文献标识码] A [文章编号] 2095-0616（2015）15-12-03
[Abstract] Objective To investigate Hepatitis B virus genotype and drug-resistant mutation patterns in 598 patients with hepatitis B in Changchun region. Methods Serum of a total 598 patients with hepatitis B whose HBVDNA was higher than the lower limit of detection （more than 1000copies/mL） were collected. To detect HBV genotype and drug-resistance site mutation by PCR reverse dot blot hybridization method. Results Of the 598 serum samples， there were 35 samples（5.85%） of genotype B， 525 samples（87.79%） of genotype C， 32 samples（5.35%） of B and C mixed genotype， 2 samples（0.33%） of genotype D and 4 samples（0.67%） of undifferentiated type. Drug-resistant mutation were detected in 79 samples， accounting for 13.21%， which included 3 samples（3.80%） of genotype B， 73 samples（92.41%） of genotype C， 2 samples（2.53%） of B and C mixed genotype and 1 case（1.27%） of undifferentiated type. The most frequently detection rate of rtM204 mutation was 75.94%（60/79）. There were 10 types of patterns in rtM204 site mutation. Conclusion The main HBV genotype is genotype C in patients infected by HBV in Changchun region， and the detection rate of rtM204 site mutation is the highest among all the drug-resistance site mutations detected in patients with hepatitis B， what's more the mutation patterns are complicated.
[Key words] Hepatitis B； HBV genotype； Drug-resistance mutation； PCR combined reverse dot blot method
乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染是全球性的公共卫生问题，我国约有9300万HBV感染者，其中慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B，CHB）患者约2000万例，每年约有30万人死于HBV感染所指的肝衰竭、肝硬化和肝细胞癌[1-2]。根据HBV全基因核苷酸序列的异质性将HBV分为A-H共8种基因型，HBV基因型具有明显的地域差异，同时不同基因型与病情的严重程度、预后、抗病毒治疗效果等方面都可能有一定的相关性[3-5]。核苷（酸）类似物[nucleos（t）ide analogue，NAs]起效迅速、服用方便、副作用小，是目前临床治疗慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B，CHB）的重要药物，随着NAs的长期使用HBV发生耐药的危险性也随之增加，HBV耐药变异是引起NAs 抗病毒治疗失败的最重要的原因[6-10]。本研究采用PCR反向点杂交法检测长春地区598例HBV感染患者的HBV基因型及常见的8个耐药位点变异情况，了解本地区HBV基因型分布特征和HBV耐药变异位点突变模式，为乙型肝炎患者抗病毒治疗提供依据。
1 材料与方法
1.1 血清标本
采集2013年1月～ 2014年1月吉林省肝胆病医院门诊和住院乙型肝炎患者，筛选出HBVDNA高于检测下限（>1000拷贝/mL）患者598例，其中男448例，女150例，年龄15 ～ 76岁。病例诊断均符合2010版中国《慢性乙型肝炎防治指南》诊断标准[11]，排除合并甲、丙、戊和庚型肝炎病毒感染，血清标本-80℃保存备检。 1.2 HBV感染血清学标志物和HBVDNA测定
患者血清HBV感染标志物HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb 、HBcAb采用罗氏试剂在罗氏7100电化学发光仪测定（Roche Diagnose，中国上海）；HBVDNA采用中山达安基因有限公司试剂在美国ABI荧光定量PCR扩增仪测定。
1.3 HBV基因分型和耐药检测
采用深圳亚能生物技术有限公司生产HBV分型和耐药突变基因检测试剂盒，可检测HBV B＼C＼D基因型以及常见核苷（酸）类似物耐药相关的8个耐药位点，包括：rt180、rt184、rt204、rt202、rt207、rt181、rt236、rt250。
1.4 HBV基因型和耐药性检测方法
严格按试剂盒说明书进行操作，主要操作流程如下：（1）离心柱提取方法提取血清HBVDNA；（2）DNA为模板进行HBVDNA 的PCR扩增；（3）恒温杂交箱47℃杂交1.5h；（4）洗膜；（5）孵育；（6）显色：将膜条浸泡与显色液中避光显色15min，观察结果。
2 结果
2.1 患者基本临床资料
598例乙型肝炎患者中，急性肝炎25例，慢性乙型肝炎313例，肝癌58例，肝硬化202例， 均为HBsAg阳性，其中HBe Ag阳性358例，HBe Ag阴性240例，HBVDNA定量检测显示Log10 HBVDNA（5.36±2.24）copies/mL。
2.2 HBV基因分型检测结果
598例乙型肝炎患者HBV基因分型检测结果：B基因型5.85%（35/598），C基因型87.79%（525/598），BC混合基因型HBV感染者占5.35%（32/528），D基因型0.33%（2/598），未分型4例占0.67%（4/598）。313例慢性乙型肝炎患者B基因型6.07%（19/313）， C基因型89.45%（280/313），BC混合基因型3.51%（11/313），D基因型0.32%（1/313），未分型0.63%（2/313）。
2.3 HBV耐药变异检测结果
在598例患者中检出79例发生HBV耐药变异，总体变异率为13.21%（79/598），其中B基因型3例（3.80%，3/79），C基因型73例（92.41%，73/79），BC混合基因型2例（2.53%，2/79），未分型1例（1.27%，1/79）。检出相关耐药突变位点有rtL180M、rtT184A/L、rtM204I/V、rtS202G、rtM/V207I、rtA181V/T、rtN236T、rtM250V/L。8个HBV相关耐药突变位点检出率各不相同， rtM204检出率最高75.94%（60/79），其余位点检出率分别为rtL180（38/79），rtA181（18/79）， rtN236（9/79）， rtT184（3/79）， rtS202（1/79）， rtM250（1/79）， rtM/V207（1/79）。
进一步分析对60例rtM204位点变异情况，rtM204位点有10种突变模式，2种rtM204单一位点变异和8种与其他耐药位点联合突变模式，结果见表1。
3 讨论
在中国主要以B基因型和C基因型为主，其中北方以C基因型为主，南方以B基因型为主[12]。本研究采用PCR反向点杂交法检测长春地区598乙型肝炎患者HBV基因型，检测出B基因型5.85%（35/598）， C基因型87.79%（525/598），基因BC混合型5.35 %（32/528），0.33%（2/598），未分型4例占0.67%（4/598），其中313例慢性乙型肝炎患者B基因型6.07%（19/313）， C基因型89.45%（280/313），BC混合基因型3.51%（11/313），D基因型0.32%（1/313），未分型0.63%（2/313），研究结果表明长春地区HBV感染者以C基因型为主，B基因型和BC混合型较少，此研究结果符合我国北方HBV基因型地理分布特点。
目前治疗CHB的核苷（酸）类药物主要有拉米夫定（LAM），阿德福韦酯（ADV），恩替卡韦（ETV）和替比夫定（LdT），在应用NAs长期抗病毒治疗过程中，耐药是非常重要的问题，一旦发生耐药，不仅影响抗病毒治疗效果，增加后续治疗的难度，甚至可导致疾病进展，增加发生肝功能失代偿的风险。在抗病毒治疗过程中检测HBV耐药位点检测，确定HBD耐药基因突变模式，合理选择抗病毒药物及确定治疗方案。本研究主要对临床常用的四种核苷（酸）类药物相关的8种耐药基因进行检测。在598例乙型肝炎患者中检出79例有HBV耐药变异，总体变异率为13.21%（79/598），79例耐药变异中8个位点上的耐药变异检出率各不相同， rtM204检出率最高75.94%（60/79），rtM204I/V位点变异主要与LAM和LDT耐药相关，rtM204检出率高可能有二方面的原因，一是LAM和LDT 为低耐药基因屏障药物，另一方面可能与LAM在我国上市最早、使用时间最长，应用患者较多有关[13-14]。
本研究对60例发生rtM204位点变异进行了分析，结果显示rtM204位点有10种突变模式，2种rtM204单一位点变异和8种与其它耐药位点联合突变模式。rtM204I/V耐药通路与LAM和LdT耐药及ETV耐药进化相关[15]，仅需出现rtM204原发耐药位点突变位点即可导致LAM和LDT耐药，同时rtM204I/V位点变异可以促进发生ETN耐药，在现有的可供选择的抗病毒药物中，一旦发生rtM204I/V变异，后续抗病毒治疗的难度明显增加。Tenney等[16]的研究表明rtM204V与rtL180M联合变异病毒株更易发生与ETV耐药相关rt184、rt202和rt250位点突变， 在临床治疗中对已发生rtM204V与rtL180M联合突变的疗效不佳CHB患者加用或换用ETV抗病毒治疗时，必须密切注意患者的病情变化。 综上所述，本研究通过检测了598例HBV感染患者的HBV基因型及常见的8个耐药位点变异情况，长春地区HBV感染患者以C基因型为主，B型和BC混合型较少，同时观察到乙型肝炎患者HBV基因耐药的变异类型和变异模式日趋复杂，在长期抗病毒治疗过程中，进行HBV基因耐药检测，对于正确选择抗病毒药物及合理选择治疗方案具有重要的参考价值。
[参考文献]
[1] 刘爱平，徐洪涛，邢同京，等.乙肝病毒基因分型与慢性乙型肝炎患者临床和病理的相关性研究[J].中西医结合肝病杂志，2010，20（3）：175-177.
[2] 江浪进，李金玲.沈阳地区90例乙型肝炎病毒基因分型及耐药变异分析[J].国际检验医学杂志，2014，35（8）：2008-2010.
[3] 廖朗，肖志权，赵炜.HBV基因分型的临床意义[J].中国医学检验杂志，2009，10（3）：174 -176.
[4] 刘林，王雅军.乙型肝炎病毒基因型的研究进展[J].中国煤炭工业医学杂志，2011，14（8）：1256-1257.
[5] Shi YH.Conelation between hepatitis B virus genotypes and clinical outcome[J].Jpn J Infec Dis，2012，65（6）：476-482.
[6] Liaw YF，Gane E，Leung N，et al.2-Year globe t rial results：telbivudine is superior to lamivudine in patients with chronic hepatitis B [J].Gastroenterology，2009，136（2）：486-495.
[7] 周祖模，陈林，金志刚，等.拉米夫定应答不佳慢性乙型肝炎患者加用阿德福韦酯与换用恩替卡韦疗效比较[J].中华临床感染病杂志，2012，5：328-331.
[8] Guirgis BS，Abhas RO，Azzazy HM.Hepatitis B virus genotyping：current methods and clinical implications [J].Int J Infect Dis，2010，14（11）：e941-e953.
[9] 刘伟，李代红.慢性乙型肝炎拉米夫定治疗后基因变异的分析[J].中国现代医学杂志，2010，20（21）：3350-3353.
[10] Tong MJ，Blatt LM，Kao JH，et al.Basal core promoter T1762/A1764 and precore A1896 gene mutations in hepatitis B surface antigen-positive hepatocellular carcinoma：a eomparsion with chronic carriers[J].Liver Int，2007，27（10）：1356-1363.
[11] 中华医学会肝病学分会，中华医学会感染病学分会.慢性乙型肝炎防治指南（2010年版）[J].中国病毒学杂志，2011，1（1）：9-23.
[12] 张岩，白雪帆，李新红，等.陕西地区乙型肝炎患者血清中病毒的基因分型[J].第四军医大学学报，2009，23（8）：746-748.
[13] Lok AS. Evolution of nucleoside/tide analogues for hepatitis B：Is the ideal drug here yet[J].J Hepatol，2009，51（2）：416-418.
[14] Lok AS，Zoulim F，Locarnini S，et al.Antiviral drug-resistant HBV： standardization of nomenclature and assays and recommendations for management[J].Hepatol，2007，46（1）：254-265.
[15] Zoulim F.Detection of hepatitis B virus resistance to antivirals[J].J Clin Virol，2001，1（4）：243-253.
[16] Tenney DJ，Rose RE，Baldick CJ，et al.Two-year assessment of entecavir resistance in lamivudine-refractory hepatitis B virus patients reveals different clinical outcomes depending on the resistance substitutions present[J].Antimicrob Agents Chemother，2007，51（3）：902-911.
（收稿日期：2015-03-12）
[关键词]乙型肝炎；HBV基因分型；基因耐药；PCR反向点杂交法
[中图分类号] R446.61 [文献标识码] A [文章编号] 2095-0616（2015）15-12-03
[Abstract] Objective To investigate Hepatitis B virus genotype and drug-resistant mutation patterns in 598 patients with hepatitis B in Changchun region. Methods Serum of a total 598 patients with hepatitis B whose HBVDNA was higher than the lower limit of detection （more than 1000copies/mL） were collected. To detect HBV genotype and drug-resistance site mutation by PCR reverse dot blot hybridization method. Results Of the 598 serum samples， there were 35 samples（5.85%） of genotype B， 525 samples（87.79%） of genotype C， 32 samples（5.35%） of B and C mixed genotype， 2 samples（0.33%） of genotype D and 4 samples（0.67%） of undifferentiated type. Drug-resistant mutation were detected in 79 samples， accounting for 13.21%， which included 3 samples（3.80%） of genotype B， 73 samples（92.41%） of genotype C， 2 samples（2.53%） of B and C mixed genotype and 1 case（1.27%） of undifferentiated type. The most frequently detection rate of rtM204 mutation was 75.94%（60/79）. There were 10 types of patterns in rtM204 site mutation. Conclusion The main HBV genotype is genotype C in patients infected by HBV in Changchun region， and the detection rate of rtM204 site mutation is the highest among all the drug-resistance site mutations detected in patients with hepatitis B， what's more the mutation patterns are complicated.
[Key words] Hepatitis B； HBV genotype； Drug-resistance mutation； PCR combined reverse dot blot method
乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染是全球性的公共卫生问题，我国约有9300万HBV感染者，其中慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B，CHB）患者约2000万例，每年约有30万人死于HBV感染所指的肝衰竭、肝硬化和肝细胞癌[1-2]。根据HBV全基因核苷酸序列的异质性将HBV分为A-H共8种基因型，HBV基因型具有明显的地域差异，同时不同基因型与病情的严重程度、预后、抗病毒治疗效果等方面都可能有一定的相关性[3-5]。核苷（酸）类似物[nucleos（t）ide analogue，NAs]起效迅速、服用方便、副作用小，是目前临床治疗慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B，CHB）的重要药物，随着NAs的长期使用HBV发生耐药的危险性也随之增加，HBV耐药变异是引起NAs 抗病毒治疗失败的最重要的原因[6-10]。本研究采用PCR反向点杂交法检测长春地区598例HBV感染患者的HBV基因型及常见的8个耐药位点变异情况，了解本地区HBV基因型分布特征和HBV耐药变异位点突变模式，为乙型肝炎患者抗病毒治疗提供依据。
1 材料与方法
1.1 血清标本
采集2013年1月～ 2014年1月吉林省肝胆病医院门诊和住院乙型肝炎患者，筛选出HBVDNA高于检测下限（>1000拷贝/mL）患者598例，其中男448例，女150例，年龄15 ～ 76岁。病例诊断均符合2010版中国《慢性乙型肝炎防治指南》诊断标准[11]，排除合并甲、丙、戊和庚型肝炎病毒感染，血清标本-80℃保存备检。 1.2 HBV感染血清学标志物和HBVDNA测定
患者血清HBV感染标志物HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb 、HBcAb采用罗氏试剂在罗氏7100电化学发光仪测定（Roche Diagnose，中国上海）；HBVDNA采用中山达安基因有限公司试剂在美国ABI荧光定量PCR扩增仪测定。
1.3 HBV基因分型和耐药检测
采用深圳亚能生物技术有限公司生产HBV分型和耐药突变基因检测试剂盒，可检测HBV B＼C＼D基因型以及常见核苷（酸）类似物耐药相关的8个耐药位点，包括：rt180、rt184、rt204、rt202、rt207、rt181、rt236、rt250。
1.4 HBV基因型和耐药性检测方法
严格按试剂盒说明书进行操作，主要操作流程如下：（1）离心柱提取方法提取血清HBVDNA；（2）DNA为模板进行HBVDNA 的PCR扩增；（3）恒温杂交箱47℃杂交1.5h；（4）洗膜；（5）孵育；（6）显色：将膜条浸泡与显色液中避光显色15min，观察结果。
2 结果
2.1 患者基本临床资料
598例乙型肝炎患者中，急性肝炎25例，慢性乙型肝炎313例，肝癌58例，肝硬化202例， 均为HBsAg阳性，其中HBe Ag阳性358例，HBe Ag阴性240例，HBVDNA定量检测显示Log10 HBVDNA（5.36±2.24）copies/mL。
2.2 HBV基因分型检测结果
598例乙型肝炎患者HBV基因分型检测结果：B基因型5.85%（35/598），C基因型87.79%（525/598），BC混合基因型HBV感染者占5.35%（32/528），D基因型0.33%（2/598），未分型4例占0.67%（4/598）。313例慢性乙型肝炎患者B基因型6.07%（19/313）， C基因型89.45%（280/313），BC混合基因型3.51%（11/313），D基因型0.32%（1/313），未分型0.63%（2/313）。
2.3 HBV耐药变异检测结果
在598例患者中检出79例发生HBV耐药变异，总体变异率为13.21%（79/598），其中B基因型3例（3.80%，3/79），C基因型73例（92.41%，73/79），BC混合基因型2例（2.53%，2/79），未分型1例（1.27%，1/79）。检出相关耐药突变位点有rtL180M、rtT184A/L、rtM204I/V、rtS202G、rtM/V207I、rtA181V/T、rtN236T、rtM250V/L。8个HBV相关耐药突变位点检出率各不相同， rtM204检出率最高75.94%（60/79），其余位点检出率分别为rtL180（38/79），rtA181（18/79）， rtN236（9/79）， rtT184（3/79）， rtS202（1/79）， rtM250（1/79）， rtM/V207（1/79）。
进一步分析对60例rtM204位点变异情况，rtM204位点有10种突变模式，2种rtM204单一位点变异和8种与其他耐药位点联合突变模式，结果见表1。
3 讨论
在中国主要以B基因型和C基因型为主，其中北方以C基因型为主，南方以B基因型为主[12]。本研究采用PCR反向点杂交法检测长春地区598乙型肝炎患者HBV基因型，检测出B基因型5.85%（35/598）， C基因型87.79%（525/598），基因BC混合型5.35 %（32/528），0.33%（2/598），未分型4例占0.67%（4/598），其中313例慢性乙型肝炎患者B基因型6.07%（19/313）， C基因型89.45%（280/313），BC混合基因型3.51%（11/313），D基因型0.32%（1/313），未分型0.63%（2/313），研究结果表明长春地区HBV感染者以C基因型为主，B基因型和BC混合型较少，此研究结果符合我国北方HBV基因型地理分布特点。
目前治疗CHB的核苷（酸）类药物主要有拉米夫定（LAM），阿德福韦酯（ADV），恩替卡韦（ETV）和替比夫定（LdT），在应用NAs长期抗病毒治疗过程中，耐药是非常重要的问题，一旦发生耐药，不仅影响抗病毒治疗效果，增加后续治疗的难度，甚至可导致疾病进展，增加发生肝功能失代偿的风险。在抗病毒治疗过程中检测HBV耐药位点检测，确定HBD耐药基因突变模式，合理选择抗病毒药物及确定治疗方案。本研究主要对临床常用的四种核苷（酸）类药物相关的8种耐药基因进行检测。在598例乙型肝炎患者中检出79例有HBV耐药变异，总体变异率为13.21%（79/598），79例耐药变异中8个位点上的耐药变异检出率各不相同， rtM204检出率最高75.94%（60/79），rtM204I/V位点变异主要与LAM和LDT耐药相关，rtM204检出率高可能有二方面的原因，一是LAM和LDT 为低耐药基因屏障药物，另一方面可能与LAM在我国上市最早、使用时间最长，应用患者较多有关[13-14]。
本研究对60例发生rtM204位点变异进行了分析，结果显示rtM204位点有10种突变模式，2种rtM204单一位点变异和8种与其它耐药位点联合突变模式。rtM204I/V耐药通路与LAM和LdT耐药及ETV耐药进化相关[15]，仅需出现rtM204原发耐药位点突变位点即可导致LAM和LDT耐药，同时rtM204I/V位点变异可以促进发生ETN耐药，在现有的可供选择的抗病毒药物中，一旦发生rtM204I/V变异，后续抗病毒治疗的难度明显增加。Tenney等[16]的研究表明rtM204V与rtL180M联合变异病毒株更易发生与ETV耐药相关rt184、rt202和rt250位点突变， 在临床治疗中对已发生rtM204V与rtL180M联合突变的疗效不佳CHB患者加用或换用ETV抗病毒治疗时，必须密切注意患者的病情变化。 综上所述，本研究通过检测了598例HBV感染患者的HBV基因型及常见的8个耐药位点变异情况，长春地区HBV感染患者以C基因型为主，B型和BC混合型较少，同时观察到乙型肝炎患者HBV基因耐药的变异类型和变异模式日趋复杂，在长期抗病毒治疗过程中，进行HBV基因耐药检测，对于正确选择抗病毒药物及合理选择治疗方案具有重要的参考价值。
[参考文献]
[1] 刘爱平，徐洪涛，邢同京，等.乙肝病毒基因分型与慢性乙型肝炎患者临床和病理的相关性研究[J].中西医结合肝病杂志，2010，20（3）：175-177.
[2] 江浪进，李金玲.沈阳地区90例乙型肝炎病毒基因分型及耐药变异分析[J].国际检验医学杂志，2014，35（8）：2008-2010.
[3] 廖朗，肖志权，赵炜.HBV基因分型的临床意义[J].中国医学检验杂志，2009，10（3）：174 -176.
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[6] Liaw YF，Gane E，Leung N，et al.2-Year globe t rial results：telbivudine is superior to lamivudine in patients with chronic hepatitis B [J].Gastroenterology，2009，136（2）：486-495.
[7] 周祖模，陈林，金志刚，等.拉米夫定应答不佳慢性乙型肝炎患者加用阿德福韦酯与换用恩替卡韦疗效比较[J].中华临床感染病杂志，2012，5：328-331.
[8] Guirgis BS，Abhas RO，Azzazy HM.Hepatitis B virus genotyping：current methods and clinical implications [J].Int J Infect Dis，2010，14（11）：e941-e953.
[9] 刘伟，李代红.慢性乙型肝炎拉米夫定治疗后基因变异的分析[J].中国现代医学杂志，2010，20（21）：3350-3353.
[10] Tong MJ，Blatt LM，Kao JH，et al.Basal core promoter T1762/A1764 and precore A1896 gene mutations in hepatitis B surface antigen-positive hepatocellular carcinoma：a eomparsion with chronic carriers[J].Liver Int，2007，27（10）：1356-1363.
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（收稿日期：2015-03-12）