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摘要：建立LC-MS同时检测大鼠脑脊液中谷氨酸和y一氨基丁酸的方法。采用安捷伦ZORBAX SIL（ 4.6 mm×250mmx5μm）硅胶正相色谱柱，流动相为甲醇一水（O.l%甲酸）=50：50（v/v），梯度洗脱，流速为1mUmin。电喷雾离子源（eletmspray ionization，ESI）采用正离子化方式，以多重反应检测（multiple reaction monitoring，MRM）方式进行检测，用于定量分析的离子反应分别为，77/2 148.1--m/z 84.1（谷氨酸，[M+H]+），m /z 104.1一m/z 87.1（y一氨基丁酸，[M+H]+）。测定大鼠脑脊液中谷氨酸在500～2500IJg/L和y一氨基丁酸在50～250卜Lg/L质量浓度范围内，浓度与峰面积呈良好的线性关系。该方法简便、准确、灵敏度高，专属性强，重复性好，适用于脑脊液中谷氨酸和y一氨基丁酸的同时测定，可为氨基酸类神经递质提供有效的检测手段。
关键词：液质联用法；谷氨酸；y-氨基丁酸；脑脊液
文献标志码：A
文章编号：1674-5124（ 2015） 02-0050-04
引 言
氨基酸类神经递质是人类脑组织中最重要的神经递质，包括兴奋性及抑制性两类。其中，谷氨酸（Glu）是兴奋性神经递质，y一氨基丁酸（GABA）是抑制性神经递质。存在于脑组织和脑脊液中的这些氨基酸类神经递质，对于调节机体生理活动具有重要作用，其含量及比例的变化伴随着多种中枢神经系统疾病的发生。因此，氨基酸含量的检测对于某些疾病的筛查、诊断和治疗具有重要意义。
目前，测定氨基酸类神经递质的常用方法是高效液相色谱法（HPLC）和氨基酸自动分析仪法。但是由于氨基酸无紫外吸收，需要柱前衍生才能进行检测，操作步骤繁琐，耗时耗力；并且柱前衍生会使得氨基酸的测定结果存在不确定性。本文采用液相色谱一质谱联用（LC-MS）技术，建立了对大鼠脑脊液中两种氨基酸类神经递质快速同时分析的方法。该方法的重现性好，灵敏度和选择性高，测定较为准确，分析步骤简单，提高了分析效率。可应用于脑组织中氨基酸类神经递质的分析测定，为临床检测提供可靠的技术手段。
1.仪器与材料
1.1 仪器
高效液相色谱仪（Agilent 1260 series）；液质联用仪（6410B.安捷伦三重串联四级杆质谱）；电子天平（CP225D，德国赛多利斯公司）；氮吹仪（MTN-2800D，天津奥特塞恩斯仪器有限公司）；超纯水仪（RIOs5.密理博中国有限公司）；旋涡混合器（XW-80A，上海青浦泸西仪器厂）；离心机（TGL-16G，上海安亭科学仪器）。
1.2 材料
Glu（批号：100023-198601）、GABA（批号：100023-198601）均由中国药品生物制品检定所提供。色谱级甲醇、乙腈购白赛默飞世尔公司，其他试剂为市售分析纯。超纯水自制。
1.3 实验动物
SPF级雄性大鼠6只，由四川省中医药科学院实验动物中心提供，许可证号为SCXK（川）2008-19。
2.方法
2.1 色谱条件
安捷伦ZORBAX SIL（4.6 mmx250mmx5μm）硅胶正相色谱柱；流动相甲醇一水（0.1%甲酸）=50：50（v/v），梯度洗脱系统如表l所示，流速为1 mL/min，柱后分流，分流比为1：3，进样量为2μL，柱温40℃。
2.2 质谱条件
安捷伦三重串联四级杆质谱，干燥气为氮气，干燥气温度：350℃，干燥气流速：11L/min.电喷雾离子源（ESI），毛细管电压：4kV，雾化气压力：40 psi（lpsl=6.895 KPa），裂解电压：75V，离子化方式为正模式。碰撞能量：15 V（谷氨酸）、10V（y一氨基丁酸），碰撞池加速电压：3V，检测方式为多重反应监测（MRM）方法，用于定量分析的离子反应分别为， m/Z148.1一m/z 84.1（谷氨酸，[M+H]+），m/z 104.1—m/z 87.1（y一氨基丁酸，[M+H]+）。
2.3 样品溶液的制备
体外穿刺抽取大鼠脑脊液约100μL，按照1：4（v∶v）加甲醇沉淀蛋白，充分振荡混合，离心20 min（转速12 000 r/min）.取上层清液用氮吹仪吹干，加0.4mL流动相B互溶，离心lOmin（转速12000r/min）后取上清液待测。
2.4 对照品溶液的制备
由于脑积液中存在内源性的Glu和GABA.无空白样本，故精密称取Glu对照品与GABA对照品各5 mg，流动相B定容到10mL，再分别取200μL流动相B定容到10mL，配成质量浓度为10mg/L的对照品储备液。分别取250，500，750，1000，1250μL Glu（10mg/L）与25，50，75，100，125μL GABA（lOmg/L）至5 mL容量瓶中，流动相B定容，得到质量浓度分别为500，1000，1500，2 000，2 5001Lg/L和50， 100， 150，200，250μg/L的系列混合对照品溶液，冷藏备用。
3.结果
3.1 方法专属性考察
取对照品溶液和脑脊液样品溶液按照2.1和2.2的条件，分别进样2μL，结果Glu的保留时间约为7.9min.GABA的保留时间约为11.5min，脑脊液中的内源性成分不干扰样品的测定（如图1～图4所示）。
3.2 定量限
分别取Glu和GABA对照品溶液，逐步稀释，分别进样2μL，当信噪比SNR=10时，得到Glu和GABA定量限质量浓度分别为8.12μg/L。 3.3 标准曲线及线性范围
取2.4Glμ和GABA系列混合对照品溶液，分别进样2μL，记录Glμ及GABA峰面积，以峰面积为纵坐标，质量浓度C（μg/L）为横坐标，进行线性回归，得到Glu和GABA标准曲线方程分别为y=6.864x+1361.ll，r2=0.9989和y=4.333x+81.41，r2=0.9994。结果表明：Glu和GABA在500～2 500μg/L和50～250μg/L的质量浓度范围内线性关系良好。
3.4 精密度实验
精密量取Glu和GABA对照品贮备液适量，用流动相B稀释成质量浓度分别为500，1 000.2000μg/L和50，100，200μg/L的标准溶液，分别进样2μL，结果表明Glu和GABA标准样品精密度良好（见表2和表3）。
3.5 重复性实验
取同一大鼠脑脊液100μL，平行操作5份，按照2.3的操作进行处理，在2.1和2.2的条件下进行测定，计算GJlu和GJABA的峰面积的RSD，结果见表4。
3.6 加样回收率实验
取同一大鼠脑脊液5份，每份50μL。分别加入50μL Glu（5000μg/L）和GABA（600μg/L）的对照品溶液，然后再加入400μL的甲醇，充分振荡混合，离心20min（转速12000r/min）.取上层清液用氮吹仪挥干，加0.4mL流动相B互溶，离心10min（转速12000r/min）后取上清2μL进样测定，回收率结果见表5。
3.7 稳定性实验
按2.3的方法分别制备低、中、高3个质量浓度（Glu 600，1200，2400μg/L和GABA 65，110，220μg/L）的样品溶液，分别在室温（放置6，12，24h）、长时间冻存（-25℃冻存l，2，3周）和冻融（冻融1，2，3次）条件下进行色谱测定，结果低、中、高3种质量浓度的RSD分别为（Glu 5.65%、4.24%、3.87%和GABA 4.39%、3.18%、3.08%）.
3.8 质量浓度测定结果
按2.3的方法制备大鼠脑脊液样品5份，分别进样2μL，质量浓度水平见表6。
4.结束语
文献采用LC-MS方法测定GIμ和GABA的含量，由于GIμ和GABA为强极性化合物，反向色谱柱对此类化合物几乎没有保留，使得样品出峰时间较早、基质影响较大和样品峰未完全分离。故采用硅胶正相色谱柱，使样品出峰时间推后到7.9～12min，避免了杂质的干扰；同时，由于使用5μm的普通液相色谱柱进行分离，为保证最佳的分离效果和质谱检测效果，使用1mL/min流速，1：3柱后分流。在反向色谱系统中使用正相色谱柱，实现了样品与样品、样品与基质间的完全分离，但较长时间使用后存在一定的柱流失，这样会影响离子化效率，需要及时清洗。
分别考察了甲醇和乙腈组成的流动相体系，以及甲酸和乙酸的加入对样品的离子化作用和酸加入量对样品测定的影响。甲醇和乙腈组成的流动相体系等体积时样品分离效果均不理想，采用梯度洗脱后均能实现样品较好分离，从经济性考虑，选择甲醇作为流动相。甲酸和乙酸均能增强样品的离子化效率，但甲酸的效果好于乙酸，同时酸的加入量比较了0.05%.0.1%，0.2%.0.3%条件下的离子化效果，最终选择加入0.1%甲酸。
对干燥气温度、裂解电压和碰撞能量等质谱条件进行了筛选，最后确定Glu和GABA的检测干燥气温度为350℃，裂解电压为75V，碰撞能量Glu为15V，GABA为10V，采用正离子模式多重反应监测（MRM）方法。
本实验建立了高效液相色谱一电喷雾串联质谱（LC-ESI-MS/MS）法对大鼠脑脊液中Glu和GABA的快速同时检测方法。样品前处理简单，无需衍生化可以直接测定。检测时间短，可为临床诊断提供可靠的检测手段，对于神经系统疾病的诊断和治疗提供参考。
关键词：液质联用法；谷氨酸；y-氨基丁酸；脑脊液
文献标志码：A
文章编号：1674-5124（ 2015） 02-0050-04
引 言
氨基酸类神经递质是人类脑组织中最重要的神经递质，包括兴奋性及抑制性两类。其中，谷氨酸（Glu）是兴奋性神经递质，y一氨基丁酸（GABA）是抑制性神经递质。存在于脑组织和脑脊液中的这些氨基酸类神经递质，对于调节机体生理活动具有重要作用，其含量及比例的变化伴随着多种中枢神经系统疾病的发生。因此，氨基酸含量的检测对于某些疾病的筛查、诊断和治疗具有重要意义。
目前，测定氨基酸类神经递质的常用方法是高效液相色谱法（HPLC）和氨基酸自动分析仪法。但是由于氨基酸无紫外吸收，需要柱前衍生才能进行检测，操作步骤繁琐，耗时耗力；并且柱前衍生会使得氨基酸的测定结果存在不确定性。本文采用液相色谱一质谱联用（LC-MS）技术，建立了对大鼠脑脊液中两种氨基酸类神经递质快速同时分析的方法。该方法的重现性好，灵敏度和选择性高，测定较为准确，分析步骤简单，提高了分析效率。可应用于脑组织中氨基酸类神经递质的分析测定，为临床检测提供可靠的技术手段。
1.仪器与材料
1.1 仪器
高效液相色谱仪（Agilent 1260 series）；液质联用仪（6410B.安捷伦三重串联四级杆质谱）；电子天平（CP225D，德国赛多利斯公司）；氮吹仪（MTN-2800D，天津奥特塞恩斯仪器有限公司）；超纯水仪（RIOs5.密理博中国有限公司）；旋涡混合器（XW-80A，上海青浦泸西仪器厂）；离心机（TGL-16G，上海安亭科学仪器）。
1.2 材料
Glu（批号：100023-198601）、GABA（批号：100023-198601）均由中国药品生物制品检定所提供。色谱级甲醇、乙腈购白赛默飞世尔公司，其他试剂为市售分析纯。超纯水自制。
1.3 实验动物
SPF级雄性大鼠6只，由四川省中医药科学院实验动物中心提供，许可证号为SCXK（川）2008-19。
2.方法
2.1 色谱条件
安捷伦ZORBAX SIL（4.6 mmx250mmx5μm）硅胶正相色谱柱；流动相甲醇一水（0.1%甲酸）=50：50（v/v），梯度洗脱系统如表l所示，流速为1 mL/min，柱后分流，分流比为1：3，进样量为2μL，柱温40℃。
2.2 质谱条件
安捷伦三重串联四级杆质谱，干燥气为氮气，干燥气温度：350℃，干燥气流速：11L/min.电喷雾离子源（ESI），毛细管电压：4kV，雾化气压力：40 psi（lpsl=6.895 KPa），裂解电压：75V，离子化方式为正模式。碰撞能量：15 V（谷氨酸）、10V（y一氨基丁酸），碰撞池加速电压：3V，检测方式为多重反应监测（MRM）方法，用于定量分析的离子反应分别为， m/Z148.1一m/z 84.1（谷氨酸，[M+H]+），m/z 104.1—m/z 87.1（y一氨基丁酸，[M+H]+）。
2.3 样品溶液的制备
体外穿刺抽取大鼠脑脊液约100μL，按照1：4（v∶v）加甲醇沉淀蛋白，充分振荡混合，离心20 min（转速12 000 r/min）.取上层清液用氮吹仪吹干，加0.4mL流动相B互溶，离心lOmin（转速12000r/min）后取上清液待测。
2.4 对照品溶液的制备
由于脑积液中存在内源性的Glu和GABA.无空白样本，故精密称取Glu对照品与GABA对照品各5 mg，流动相B定容到10mL，再分别取200μL流动相B定容到10mL，配成质量浓度为10mg/L的对照品储备液。分别取250，500，750，1000，1250μL Glu（10mg/L）与25，50，75，100，125μL GABA（lOmg/L）至5 mL容量瓶中，流动相B定容，得到质量浓度分别为500，1000，1500，2 000，2 5001Lg/L和50， 100， 150，200，250μg/L的系列混合对照品溶液，冷藏备用。
3.结果
3.1 方法专属性考察
取对照品溶液和脑脊液样品溶液按照2.1和2.2的条件，分别进样2μL，结果Glu的保留时间约为7.9min.GABA的保留时间约为11.5min，脑脊液中的内源性成分不干扰样品的测定（如图1～图4所示）。
3.2 定量限
分别取Glu和GABA对照品溶液，逐步稀释，分别进样2μL，当信噪比SNR=10时，得到Glu和GABA定量限质量浓度分别为8.12μg/L。 3.3 标准曲线及线性范围
取2.4Glμ和GABA系列混合对照品溶液，分别进样2μL，记录Glμ及GABA峰面积，以峰面积为纵坐标，质量浓度C（μg/L）为横坐标，进行线性回归，得到Glu和GABA标准曲线方程分别为y=6.864x+1361.ll，r2=0.9989和y=4.333x+81.41，r2=0.9994。结果表明：Glu和GABA在500～2 500μg/L和50～250μg/L的质量浓度范围内线性关系良好。
3.4 精密度实验
精密量取Glu和GABA对照品贮备液适量，用流动相B稀释成质量浓度分别为500，1 000.2000μg/L和50，100，200μg/L的标准溶液，分别进样2μL，结果表明Glu和GABA标准样品精密度良好（见表2和表3）。
3.5 重复性实验
取同一大鼠脑脊液100μL，平行操作5份，按照2.3的操作进行处理，在2.1和2.2的条件下进行测定，计算GJlu和GJABA的峰面积的RSD，结果见表4。
3.6 加样回收率实验
取同一大鼠脑脊液5份，每份50μL。分别加入50μL Glu（5000μg/L）和GABA（600μg/L）的对照品溶液，然后再加入400μL的甲醇，充分振荡混合，离心20min（转速12000r/min）.取上层清液用氮吹仪挥干，加0.4mL流动相B互溶，离心10min（转速12000r/min）后取上清2μL进样测定，回收率结果见表5。
3.7 稳定性实验
按2.3的方法分别制备低、中、高3个质量浓度（Glu 600，1200，2400μg/L和GABA 65，110，220μg/L）的样品溶液，分别在室温（放置6，12，24h）、长时间冻存（-25℃冻存l，2，3周）和冻融（冻融1，2，3次）条件下进行色谱测定，结果低、中、高3种质量浓度的RSD分别为（Glu 5.65%、4.24%、3.87%和GABA 4.39%、3.18%、3.08%）.
3.8 质量浓度测定结果
按2.3的方法制备大鼠脑脊液样品5份，分别进样2μL，质量浓度水平见表6。
4.结束语
文献采用LC-MS方法测定GIμ和GABA的含量，由于GIμ和GABA为强极性化合物，反向色谱柱对此类化合物几乎没有保留，使得样品出峰时间较早、基质影响较大和样品峰未完全分离。故采用硅胶正相色谱柱，使样品出峰时间推后到7.9～12min，避免了杂质的干扰；同时，由于使用5μm的普通液相色谱柱进行分离，为保证最佳的分离效果和质谱检测效果，使用1mL/min流速，1：3柱后分流。在反向色谱系统中使用正相色谱柱，实现了样品与样品、样品与基质间的完全分离，但较长时间使用后存在一定的柱流失，这样会影响离子化效率，需要及时清洗。
分别考察了甲醇和乙腈组成的流动相体系，以及甲酸和乙酸的加入对样品的离子化作用和酸加入量对样品测定的影响。甲醇和乙腈组成的流动相体系等体积时样品分离效果均不理想，采用梯度洗脱后均能实现样品较好分离，从经济性考虑，选择甲醇作为流动相。甲酸和乙酸均能增强样品的离子化效率，但甲酸的效果好于乙酸，同时酸的加入量比较了0.05%.0.1%，0.2%.0.3%条件下的离子化效果，最终选择加入0.1%甲酸。
对干燥气温度、裂解电压和碰撞能量等质谱条件进行了筛选，最后确定Glu和GABA的检测干燥气温度为350℃，裂解电压为75V，碰撞能量Glu为15V，GABA为10V，采用正离子模式多重反应监测（MRM）方法。
本实验建立了高效液相色谱一电喷雾串联质谱（LC-ESI-MS/MS）法对大鼠脑脊液中Glu和GABA的快速同时检测方法。样品前处理简单，无需衍生化可以直接测定。检测时间短，可为临床诊断提供可靠的检测手段，对于神经系统疾病的诊断和治疗提供参考。