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摘要[目的]探讨青海半细毛羊的血红蛋白多态性及其与7项血清生化指标间的相关性。[方法] 采用聚丙烯酰胺凝胶垂直平板电泳法对29只青海半细毛羊的血红蛋白多态性及其与7项血清生化指标间的相关性进行分析。[结果] 青海半细毛羊血红蛋白多态性存在HBA和HBB2种变异体，以HBB为优势基因。构成HBAA、HBAB和HBBB3种基因型，其基因型率分别为0.137 9、0.586 2和0.275 9。HBA和HBB基因频率为0.431 0和0.569 0，基因杂合度为0.490 4。青海半细毛羊血液蛋白多态性与7项血清生化指标间均无显著相关性（P>0.05）。[结论] 该研究可为青海半细毛羊种质资源、亲缘关系以及品种选育和改良等方面的研究提供基础试验资料。
关键词青海半细毛羊；血红蛋白；多态性；生化指标
中图分类号S826文献标识码A文章编号0517-6611（2014）14-04354-02
Polymorphism of Haemoglobin in Qinghai Semifine Wool Sheep and Its Correlation with Seven Serum Biochemical Indices
WANG Yongke et al（ Qinghai Vocational College of Animal Husbandry and Veterinary Medicine， Huangyuan， Qinghai 812100）
Abstract [Objective] The research aimed to discuss the polymorphism of haemoglobin in Qinghai semifine wool sheep and its correlation with seven serum biochemical indices. [Method] The polymorphism of haemoglobin in 29 Qinghai semifine wool sheep and its correlation with seven serum biochemical indices were analyzed by using SDSPAGE. [Result] There were two variants （HBA and HBB） of polymorphism of haemoglobin in Qinghai semifine wool sheep， with HBB as the dominant gene. Three genotypes of HBAA， HBAB and HBBB were formed and their genotype frequency were 0.137 9， 0.586 2 and 0.275 9 respectively. The gene frequency of HBA and HBB were 0.431 0 and 0.569 0 respectively， and the gene heterozygosity was 0.490 4. The polymorphism of haemoglobin in Qinghai semifine wool sheep had no significant correlation with 7 serum biochemical indices（P>0.05）. [Conclusion] The research could provide basic test materials for studying the germplasm resources， genetic relation and selecting and improving varieties of Qinghai semifine wool sheep.
Key wordsQinghai semifine wool sheep； Haemoglobin； Polymorphism； Biochemical indices
青海半細毛羊是青海省培育的品种绵羊，具有对高原低氧环境适应性好、繁殖性能高、产毛量高、生长发育快、肉用性能好等优点，深受牧民们喜爱。有关青海半细毛羊的血液蛋白多态性或血清生化指标测定的研究报道较多。贺晓龙[1]采用聚丙烯酰胺凝胶垂直平板电泳法对48只青海半细毛羊血清芳基酯酶多态性及其与血清蛋白质指标间的相关性进行了研究。郭朝辉等[2]对海北州海晏县91只青海半细毛羊的血红蛋白多态性进行了研究。张寿等[3]对青海河卡种羊场的青海半细毛羊妊娠期外周血液中孕酮和雌二醇含量。马森[4]对青海半细毛羊血清NOS、NO、LDH、SOD、GSHPx和MDA进行了测定。但青海半细毛羊血液蛋白多态性与血清生化指标间相关性的报道甚少。基于此，笔者对青海半细毛羊的血红蛋白多态性及其与血清生化指标间相关性进行分析，以期为青海半细毛羊种质资源、亲缘关系以及品种选育和改良等方面的研究提供基础试验资料。
1材料与方法
1.1试验动物青海省海晏县哈勒景乡牧民自繁的成年青海半细毛羊，共29只，要求临床健康，试验羊终年放牧饲养，冬季给予适量的草料补饲，试验动物生活区的海拔高度为2 900～3 400 m。
1.2血样采集出牧前从试验羊颈静脉采集非抗凝血和肝素钠抗凝血各5 ml，对抗凝血样进行血红蛋白电泳，非抗凝血样进行7项血清生化指标测定。
1.3测定项目与方法
1.3.1血液蛋白多态性的测定和判型。采用聚丙烯酰胺凝胶垂直平板电泳法进行HB变异体的分离，参考胡张才骏等[5]的方法进行，判型标准参考佐佐木清纲[6]的方法。 1.3.2血液生化指标的测定。采用磷酸苯二钠比色法测定血清碱性磷酸酶（AKP）活性；采用酶法血清总胆固醇（CHO）和血清甘油三酯（TG）的含量；采用选择性沉淀法测定血清高密度脂蛋白胆固醇（HDLC）和血清低密度脂蛋白胆固醇（LDLC）的含量；采用赖氏法测定血清谷丙转氨酶（ALT）和血清谷草转氨酶（AST）的活性。
以上所用的测定试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。所有比色项目均使用722紫外分光光度计（上海美谱达仪器有限公司生产）进行测定。
图1青海半细毛羊HB电泳模式图谱1.4数据处理试验数据均使用SPSS 13.0统计软件进行统计与分析，以平均值（）±标准差（SD）表示。不同血红蛋白基因型间的7项血液生化指标的差异显著性用t检验统计分析。可根据HB变异体受共显性等位基因控制的假设推断基因型，计算基因频率。
按照以下公式计算基因杂合度：H=1-P2i。式中，Pi为某一位点第i个等位基因频率。
2结果与分析
2.1青海半细毛羊血红蛋白多态性从图1可以看出，被检青海半细毛羊血红蛋白存在HBAA、HBAB和HBBB3种基因型而呈多态性，其中HBAB型为优势基因型；HBA和HBB的基因频率分别为0.431 0和0.569 0，以HBB为优势基因，基因杂合度为0.490 4。
2.2青海半细毛羊不同血红蛋白基因型7项血清生化指标含量青海半细毛羊不同血红蛋白基因型7项血清生化指标的含量见表1。
3讨论
血红蛋白在动物体内担负着运送氧气和二氧化碳的重要生理功能，是机体的重要生化遗传标记，也是目前研究最多的血液蛋白质之一。自Harris等[7] 用纸电泳法鉴定出绵羊HBA和HBB2个类型以来，又相继发现了HBC[8]、HBD[9]和 HBE[10]。该试验结果表明青海半细毛血红蛋白多态性只存在HBA和HBB2种变异体，构成HBAA、HBAB和HBBB 3种基因型，且HBA和HBB基因频率分别为0.408 3和0.591 7。 张才骏等[5]对生活在不同海拔的藏绵羊的HB多态性进行了研究， 发现HBA的基因频率随着海拔高度的升高而增加（由0.290 3增至0.932 4）。该试验中青海半细毛羊生活在海拔高度为2 900～3 400 m的地区，其HB位点的HBA基因频率为0.431 0，低于生活在海拔3 500 m左右的欧拉型藏羊HB位点的HBA基因频率0.799 0，这与以上研究结果相一致。
血液生理生化特性是动物长期进化的结果，是对栖息环境长期适应的反应，也是反映机体健康状况的重要指标。血清中TG 、TCHO、HDL和LDL含量可反映机体对脂类的吸收及代谢程度[11]。AKP、ALT和AST是动物代谢过程中重要的调控酶，其活性不仅反映动物体内成骨细胞活性及骨生成状况的生成指标，同时也是反映钙、磷代谢以及诊断心、肝功能的重要指标[12]。血液蛋白（酶）多态性作为一种重要的生化遗传标记，已被广泛用于探讨畜禽品种的起源、进化及品种间的亲缘关系，并利用这些标记作为遗传检测来进行早期选育的辅助标记。该试验结果表明青海半细毛羊7项血清生化指标在不同血液蛋白多态性型间均无显著差异（P>0.05），这与贺晓龙[1]、张才骏等[13]、王勇等[14]的研究结果相一致。
参考文献
[1] 贺晓龙.青海半细毛羊血清芳基酯酶多态性及其与血清蛋白质指标间的联系[J].青海畜牧兽医学院学报，1997，14（2）：17-19.
[2] 郭朝辉，才尕，贾玉刚.青海半细毛羊蛋白多态性的研究[J].草与畜杂志，1998（4）： 18-19.
[3] 张寿，王应安，张勤文，等.青海毛肉兼用半细毛羊妊娠期外周血液中孕酮和雌二醇含量的测定[J].中国兽医科技，1999，1（3）：8-9.
[4] 马森.青海半细毛羊血清NOS、NO、LDH、SOD、GSH、Px、MDA測定结果[C]//动物生理生化学分会第八次学术会议暨全国反刍动物营养生理生化第三次学术研讨会论文摘要汇编.北京：中国畜牧兽医学会，2004： 147-147.
[5] 张才骏，张武学，张更利，等.青海省绵羊血红蛋白多态性的研究[J].青海畜牧兽医学院学报，1993，10（2）：8-13.
[6] 佐佐木清纲.家畜的血液型及其应用[M].李世安，译.上海：上海科学技术出版社，1982：207-209.
[7] HARIS H，WARREN F L.Occurence of electrophoretically distinct haemoglobins in ruminant[J].Biochem J，1995，60： 29.
[8] VLIET G V.Changes in the hemoglobin type of sheep as a response to anaemia type in sheep[J].Nature（Lond），1964，216：593-594.
[9] VASKOV B.Fourth hemoglobin type in sheep[J].Nature（Lond），1967，216：593-594.
[10] JOHN M E，JOHN M.A new hemoglobin chain variant in sheep[J].Animal Breeding Abstractsm，1979，47（3）：13.
[11] 董志岩，方桂友，张玉宏.饲粮中添加不同维生素浓度对断奶仔猪生长性能、免疫及血液生化指标的影响[J].饲料博览，2003（12）：1-3.
[12] 王桂秋，刁其玉，罗桂河，等.羔羊断奶日龄对生长和血清指标的影响[J].单胃动物营养学报，2007，19（1）：23-27.
[13] 张才骏，王勇，卢福山.欧拉羊血清酯酶多态性与血液指标的联系[J].青海畜牧兽医杂志，2009，39（1）：1-3.
[14] 王勇，张才骏，卢福山.欧拉羊的血红蛋白多态性及其与血液指标的联系[J].青海大学学报，2007，25（4）：59-62.
关键词青海半细毛羊；血红蛋白；多态性；生化指标
中图分类号S826文献标识码A文章编号0517-6611（2014）14-04354-02
Polymorphism of Haemoglobin in Qinghai Semifine Wool Sheep and Its Correlation with Seven Serum Biochemical Indices
WANG Yongke et al（ Qinghai Vocational College of Animal Husbandry and Veterinary Medicine， Huangyuan， Qinghai 812100）
Abstract [Objective] The research aimed to discuss the polymorphism of haemoglobin in Qinghai semifine wool sheep and its correlation with seven serum biochemical indices. [Method] The polymorphism of haemoglobin in 29 Qinghai semifine wool sheep and its correlation with seven serum biochemical indices were analyzed by using SDSPAGE. [Result] There were two variants （HBA and HBB） of polymorphism of haemoglobin in Qinghai semifine wool sheep， with HBB as the dominant gene. Three genotypes of HBAA， HBAB and HBBB were formed and their genotype frequency were 0.137 9， 0.586 2 and 0.275 9 respectively. The gene frequency of HBA and HBB were 0.431 0 and 0.569 0 respectively， and the gene heterozygosity was 0.490 4. The polymorphism of haemoglobin in Qinghai semifine wool sheep had no significant correlation with 7 serum biochemical indices（P>0.05）. [Conclusion] The research could provide basic test materials for studying the germplasm resources， genetic relation and selecting and improving varieties of Qinghai semifine wool sheep.
Key wordsQinghai semifine wool sheep； Haemoglobin； Polymorphism； Biochemical indices
青海半細毛羊是青海省培育的品种绵羊，具有对高原低氧环境适应性好、繁殖性能高、产毛量高、生长发育快、肉用性能好等优点，深受牧民们喜爱。有关青海半细毛羊的血液蛋白多态性或血清生化指标测定的研究报道较多。贺晓龙[1]采用聚丙烯酰胺凝胶垂直平板电泳法对48只青海半细毛羊血清芳基酯酶多态性及其与血清蛋白质指标间的相关性进行了研究。郭朝辉等[2]对海北州海晏县91只青海半细毛羊的血红蛋白多态性进行了研究。张寿等[3]对青海河卡种羊场的青海半细毛羊妊娠期外周血液中孕酮和雌二醇含量。马森[4]对青海半细毛羊血清NOS、NO、LDH、SOD、GSHPx和MDA进行了测定。但青海半细毛羊血液蛋白多态性与血清生化指标间相关性的报道甚少。基于此，笔者对青海半细毛羊的血红蛋白多态性及其与血清生化指标间相关性进行分析，以期为青海半细毛羊种质资源、亲缘关系以及品种选育和改良等方面的研究提供基础试验资料。
1材料与方法
1.1试验动物青海省海晏县哈勒景乡牧民自繁的成年青海半细毛羊，共29只，要求临床健康，试验羊终年放牧饲养，冬季给予适量的草料补饲，试验动物生活区的海拔高度为2 900～3 400 m。
1.2血样采集出牧前从试验羊颈静脉采集非抗凝血和肝素钠抗凝血各5 ml，对抗凝血样进行血红蛋白电泳，非抗凝血样进行7项血清生化指标测定。
1.3测定项目与方法
1.3.1血液蛋白多态性的测定和判型。采用聚丙烯酰胺凝胶垂直平板电泳法进行HB变异体的分离，参考胡张才骏等[5]的方法进行，判型标准参考佐佐木清纲[6]的方法。 1.3.2血液生化指标的测定。采用磷酸苯二钠比色法测定血清碱性磷酸酶（AKP）活性；采用酶法血清总胆固醇（CHO）和血清甘油三酯（TG）的含量；采用选择性沉淀法测定血清高密度脂蛋白胆固醇（HDLC）和血清低密度脂蛋白胆固醇（LDLC）的含量；采用赖氏法测定血清谷丙转氨酶（ALT）和血清谷草转氨酶（AST）的活性。
以上所用的测定试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。所有比色项目均使用722紫外分光光度计（上海美谱达仪器有限公司生产）进行测定。
图1青海半细毛羊HB电泳模式图谱1.4数据处理试验数据均使用SPSS 13.0统计软件进行统计与分析，以平均值（）±标准差（SD）表示。不同血红蛋白基因型间的7项血液生化指标的差异显著性用t检验统计分析。可根据HB变异体受共显性等位基因控制的假设推断基因型，计算基因频率。
按照以下公式计算基因杂合度：H=1-P2i。式中，Pi为某一位点第i个等位基因频率。
2结果与分析
2.1青海半细毛羊血红蛋白多态性从图1可以看出，被检青海半细毛羊血红蛋白存在HBAA、HBAB和HBBB3种基因型而呈多态性，其中HBAB型为优势基因型；HBA和HBB的基因频率分别为0.431 0和0.569 0，以HBB为优势基因，基因杂合度为0.490 4。
2.2青海半细毛羊不同血红蛋白基因型7项血清生化指标含量青海半细毛羊不同血红蛋白基因型7项血清生化指标的含量见表1。
3讨论
血红蛋白在动物体内担负着运送氧气和二氧化碳的重要生理功能，是机体的重要生化遗传标记，也是目前研究最多的血液蛋白质之一。自Harris等[7] 用纸电泳法鉴定出绵羊HBA和HBB2个类型以来，又相继发现了HBC[8]、HBD[9]和 HBE[10]。该试验结果表明青海半细毛血红蛋白多态性只存在HBA和HBB2种变异体，构成HBAA、HBAB和HBBB 3种基因型，且HBA和HBB基因频率分别为0.408 3和0.591 7。 张才骏等[5]对生活在不同海拔的藏绵羊的HB多态性进行了研究， 发现HBA的基因频率随着海拔高度的升高而增加（由0.290 3增至0.932 4）。该试验中青海半细毛羊生活在海拔高度为2 900～3 400 m的地区，其HB位点的HBA基因频率为0.431 0，低于生活在海拔3 500 m左右的欧拉型藏羊HB位点的HBA基因频率0.799 0，这与以上研究结果相一致。
血液生理生化特性是动物长期进化的结果，是对栖息环境长期适应的反应，也是反映机体健康状况的重要指标。血清中TG 、TCHO、HDL和LDL含量可反映机体对脂类的吸收及代谢程度[11]。AKP、ALT和AST是动物代谢过程中重要的调控酶，其活性不仅反映动物体内成骨细胞活性及骨生成状况的生成指标，同时也是反映钙、磷代谢以及诊断心、肝功能的重要指标[12]。血液蛋白（酶）多态性作为一种重要的生化遗传标记，已被广泛用于探讨畜禽品种的起源、进化及品种间的亲缘关系，并利用这些标记作为遗传检测来进行早期选育的辅助标记。该试验结果表明青海半细毛羊7项血清生化指标在不同血液蛋白多态性型间均无显著差异（P>0.05），这与贺晓龙[1]、张才骏等[13]、王勇等[14]的研究结果相一致。
参考文献
[1] 贺晓龙.青海半细毛羊血清芳基酯酶多态性及其与血清蛋白质指标间的联系[J].青海畜牧兽医学院学报，1997，14（2）：17-19.
[2] 郭朝辉，才尕，贾玉刚.青海半细毛羊蛋白多态性的研究[J].草与畜杂志，1998（4）： 18-19.
[3] 张寿，王应安，张勤文，等.青海毛肉兼用半细毛羊妊娠期外周血液中孕酮和雌二醇含量的测定[J].中国兽医科技，1999，1（3）：8-9.
[4] 马森.青海半细毛羊血清NOS、NO、LDH、SOD、GSH、Px、MDA測定结果[C]//动物生理生化学分会第八次学术会议暨全国反刍动物营养生理生化第三次学术研讨会论文摘要汇编.北京：中国畜牧兽医学会，2004： 147-147.
[5] 张才骏，张武学，张更利，等.青海省绵羊血红蛋白多态性的研究[J].青海畜牧兽医学院学报，1993，10（2）：8-13.
[6] 佐佐木清纲.家畜的血液型及其应用[M].李世安，译.上海：上海科学技术出版社，1982：207-209.
[7] HARIS H，WARREN F L.Occurence of electrophoretically distinct haemoglobins in ruminant[J].Biochem J，1995，60： 29.
[8] VLIET G V.Changes in the hemoglobin type of sheep as a response to anaemia type in sheep[J].Nature（Lond），1964，216：593-594.
[9] VASKOV B.Fourth hemoglobin type in sheep[J].Nature（Lond），1967，216：593-594.
[10] JOHN M E，JOHN M.A new hemoglobin chain variant in sheep[J].Animal Breeding Abstractsm，1979，47（3）：13.
[11] 董志岩，方桂友，张玉宏.饲粮中添加不同维生素浓度对断奶仔猪生长性能、免疫及血液生化指标的影响[J].饲料博览，2003（12）：1-3.
[12] 王桂秋，刁其玉，罗桂河，等.羔羊断奶日龄对生长和血清指标的影响[J].单胃动物营养学报，2007，19（1）：23-27.
[13] 张才骏，王勇，卢福山.欧拉羊血清酯酶多态性与血液指标的联系[J].青海畜牧兽医杂志，2009，39（1）：1-3.
[14] 王勇，张才骏，卢福山.欧拉羊的血红蛋白多态性及其与血液指标的联系[J].青海大学学报，2007，25（4）：59-62.