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摘要：本研究克隆了小鼠MCK基因5′侧翼区以及核心启动子区，并分析和研究了其调控活性。首先以小鼠尾部肌肉基因组DNA为模版克隆了小鼠MCK基因5′侧翼区序列，回收纯化，连接pEASY-T3 Cloning载体，测序，分析了其增强子与核心启动子序列。然后将核心启动子序列亚克隆到无启动子的荧光蛋白报告载体pGL3-Venus中，转染小鼠成肌细胞C2C12，观察其在荧光显微镜下的表达情况。结果表明，小鼠MCK基因-1354 ～ +1 bp核心启动子序列能调控Venus荧光蛋白在C2C12细胞内表达，证实MCK启动子核心序列具有组织特异性调控能力。
关键词：小鼠；MCK基因；启动子；序列分析
中图分类号：Q785文献标识号：A文章编号：1001-4942（2013）02-0005-06
在转基因动物研究中，外源基因都需要在某种组织中特异性表达，因此，组织特异性启动子对于外源基因组织特异性表达具有重要作用。另外，组织特异性启动子是研究细胞分化、基因工程以及再生医学应用中的重要工具。据报道，由肌肉特异性调控元件构成的启动子能够指导载体进行肌肉特异性表达，在非肌肉细胞中表达很低[1]，这些调控元件包括肌酸激酶（Creatine Kinase， CK）调控元件[2]、骨骼肌肌动蛋白调控元件[3]、肌球蛋白重链调控元件[4]和其他肌肉基因的调控元件。高等脊椎动物肌酸激酶存在胞质型和线粒体型两大类，其中胞质型包括肌肉型肌酸激酶（Muscle Creatine Kinase， MCK）和脑型肌酸激酶（Brain Creatine Kinase， BCK）两种形式，而在线粒体中存在CKmt1和CKmt2两种类型的肌酸激酶[5]。肌肉肌酸激酶基因主要存在于各种肌肉细胞中，骨骼肌和心肌中都含有肌酸激酶，尤其骨骼肌含量最为丰富，占全身总量的96%，在收缩肌肉中被转录激活，在成年心肌和骨骼肌中高度表达[6]。
目前，外源基因在肌肉中表达主要应用巨细胞病毒（Cytomegaoviyns， CMV）启动子，CMV启动子虽然高效，但外源基因表达没有细胞特异性[7]，因此，在转基因动物的应用中受到极大地限制。考虑到转基因动物后期应用的生物安全评价，所以选取更适合自然界存在的肌肉特异性启动子显得极为重要。在研究相关基因在肌肉发育过程中的作用及对肌肉形成的影响，特别是在肉用方面的转基因动物的研究与应用中及肌肉性疾病治疗性研究中，肌肉特异性启动子的研究就成了热点。
本研究首先克隆了小鼠MCK 5′侧翼区序列，并分析了其核心启动子/增强子区，然后克隆了小鼠的MCK核心启动子，将其连接到带有荧光蛋白的报告载体中，转染肌肉细胞验证其具有转录活性，为进一步研究MCK启动子在转基因动物和再生医学中的应用奠定了基础。
关键词：小鼠；MCK基因；启动子；序列分析
中图分类号：Q785文献标识号：A文章编号：1001-4942（2013）02-0005-06
在转基因动物研究中，外源基因都需要在某种组织中特异性表达，因此，组织特异性启动子对于外源基因组织特异性表达具有重要作用。另外，组织特异性启动子是研究细胞分化、基因工程以及再生医学应用中的重要工具。据报道，由肌肉特异性调控元件构成的启动子能够指导载体进行肌肉特异性表达，在非肌肉细胞中表达很低[1]，这些调控元件包括肌酸激酶（Creatine Kinase， CK）调控元件[2]、骨骼肌肌动蛋白调控元件[3]、肌球蛋白重链调控元件[4]和其他肌肉基因的调控元件。高等脊椎动物肌酸激酶存在胞质型和线粒体型两大类，其中胞质型包括肌肉型肌酸激酶（Muscle Creatine Kinase， MCK）和脑型肌酸激酶（Brain Creatine Kinase， BCK）两种形式，而在线粒体中存在CKmt1和CKmt2两种类型的肌酸激酶[5]。肌肉肌酸激酶基因主要存在于各种肌肉细胞中，骨骼肌和心肌中都含有肌酸激酶，尤其骨骼肌含量最为丰富，占全身总量的96%，在收缩肌肉中被转录激活，在成年心肌和骨骼肌中高度表达[6]。
目前，外源基因在肌肉中表达主要应用巨细胞病毒（Cytomegaoviyns， CMV）启动子，CMV启动子虽然高效，但外源基因表达没有细胞特异性[7]，因此，在转基因动物的应用中受到极大地限制。考虑到转基因动物后期应用的生物安全评价，所以选取更适合自然界存在的肌肉特异性启动子显得极为重要。在研究相关基因在肌肉发育过程中的作用及对肌肉形成的影响，特别是在肉用方面的转基因动物的研究与应用中及肌肉性疾病治疗性研究中，肌肉特异性启动子的研究就成了热点。
本研究首先克隆了小鼠MCK 5′侧翼区序列，并分析了其核心启动子/增强子区，然后克隆了小鼠的MCK核心启动子，将其连接到带有荧光蛋白的报告载体中，转染肌肉细胞验证其具有转录活性，为进一步研究MCK启动子在转基因动物和再生医学中的应用奠定了基础。