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【摘 要】目的：寻求乳腺癌标志物最佳组合，以提高乳腺癌诊断的准确性和灵敏度。方法：采用ELISA法测定20例乳腺癌良性病变和85例乳腺癌患者治疗前血清肿瘤相关抗原（CA15-3）、癌胚抗原（CEA）、恶性肿瘤特异性生长因子（TSGF）和组织多肽特异性抗原（TPS），荧光定量PCR（FQ-PCR）检测C-erbB2拷贝数。结果：乳腺癌组CA15-3、CEA、TSGF和TPS、C-erbB2，5种标志物的水平及阳性率明显高于良性病变组（P<0.05或P<0.01），在几种组合中，CA15-3、TSGF、C-erbB2三者组合在Ⅰ、Ⅱ期乳腺癌中阳性率达90.9%。结论：CA15-3、TSGF和C-erbB2联合检测是乳腺癌筛查较好的组合。
【关键词】乳腺肿瘤；肿瘤标记；生物学
【中图分类号】R575 【文献标识码】A 【文章编号】1004-7484（2013）03-0485-02
肿瘤标志物tumor marker是指在肿瘤发生和增殖过程中，由肿瘤细胞所产生或分泌并释放到血液、细胞、体液中，反映肿瘤存在和生长的一类物质。能用化学、免疫和分子生物学方法进行定量地检测。包括蛋白质、激素、酶和多胺以及癌基因产物等。肿瘤标志物的血清水平一般与恶性肿瘤的发生、发展、消退、复发等具有良好的相关性。在正常组织或良性疾病中不产生或产生极微。因此，通常通过肿瘤标志物的血清水平测定，可以获得有关恶性肿瘤的辅助诊断、疗效观察、评判预后以及预报复发等方面的信息。临床上常用的乳腺癌肿瘤标志物有：CA153、CEA；补充标志物有：CA549、hCG、降钙素、铁蛋白等。我们以定量的方法检测敏感性和特异度相对较高的5个标志物：血清肿瘤相关抗原（CA15-3）、癌胚抗原（CEA）、恶性肿瘤特异性生长因子（TSGF）、组织多肽特异性抗原（TPS）、C-erbB2，研究它们在评估乳腺癌发生发展中的作用，特别是找到早期预测乳腺癌的可靠标志物。
1 对象与方法
1.1 检测对象所有纳入患者105例均为女性，良性组：20例，其中乳腺病6例，乳腺纤维瘤14例，平均年龄36岁。乳腺癌组：共85例，其中浸润性导管癌66例，浸润性小叶癌14例，髓样癌2例，乳腺浸润性筛状癌3例。采用1997年国际抗癌联盟公布的乳腺癌TNM分类法进行TNM分期，其中Ⅰ期27例，Ⅱ期25例，Ⅲ期19例，Ⅳ期14例，平均年龄44岁。两组病例均于治疗前清晨取静脉血3ml，所有乳腺癌均经病理确诊的初诊者，排除患有其它肿瘤。
1.2 检测方法静脉血离心取上清液，ELISA法测CA15-3、CEA、TSGF、TPS，试剂盒购自瑞典CanAg公司和IDL生物试剂公司。原理为生物素-亲和素双单抗夹心法，形成亲和素-生物素-抗体-抗原-酶标抗体复合物，以日本BIO-RAD公司生产的MODEL550用淋巴细胞分离液分离淋巴细胞，异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法细胞RNA。以逆转录FQ-PCR法检测。引物由上海生物工程公司合成，正反义引物分别为5’-AGCCGCGAGCACCCAAGT-3’，5’-TTGGTGGGCAGGTAGGTGAGTT-3’，探针：5’-CCTGCCAGATC CCGACCCACCT- 3’。FAM荧光作为报告基因标记探针5’端，TAMRA荧光为淬灭基因标记3’端。逆转录反应20μl，42℃反应55min。FQ-PCR反应，逆转录产物5μl，引物400nmol，探针150nmol，dATP、dGTPdCTP各200μmol，dUTP 400μmol，TaqDNA酶1.25u。在美国ABI公司生产的7700Sequence de tector分析仪上进行分析，每份标本均做C-erbB2和β2-微球蛋白测定。扩增参数为：50℃ 2min，95℃ 10min，94℃ 0.5min，66℃ 1min，35次循环。采用BIECHE的标准曲线制备方法，在每次均使用标准品制备标准曲线。根据曲线，仪器自动计算C-erbB2和β2-微球蛋白的拷贝数/ml，以C-erbB2和β2-微球蛋白比值作为C-erbB2的表达水平。
1.3 判定标准临界值：CA15-3为19.3u/ml；CEA为5.0ng/ml；TSGF为64u/ml；TPS为15.8u/L；C-erbB2为C-erbB2/β-actin 1.90，超过临界值为阳性。
1.4 统计学方法计量数据以（±s）表示，采用SPSS 10.0统计软件，进行t检验，计数资料采用χ2检验。
2 结果
2.1 良性乳腺疾病组和乳腺癌组CA15-3、CEA、TSGF、TPS、C-erbB2的测定结果：5种标志物的水平及阳性率明显高于良性病变组（P<0.05或P<0.01）。
2.2 单项指标对于乳腺癌诊断的评价根据良性对照结果，CA15-3、CEA、TSGF、TPS、C-erbB2对乳腺癌诊断的阳性率分别为51.77%、45.88%、54.12%、38.82%、65.88%，乳腺癌Ⅲ期的阳性率明显高于Ⅰ期（P<0.05），而不同指标在不同期阳性率不同，且存在假阳性。
2.3 联合检测对Ⅰ期和Ⅱ期乳腺癌诊断的评价以上单个肿瘤标志物对乳腺癌诊断阳性率不高，特别是对早期乳腺癌诊断阳性率较低，我们选择阳性率相对较高的标志物进行组合，可以提高Ⅰ期和Ⅱ期乳腺癌诊断的灵敏度。其中以CA15-3、TSGF和C-erbB2联合，其特异性和敏感性与其它三种标志物组合相比差异有显著性（P<0.05），而与CA15-3、CEA、TSGF、C-erbB2四者组合差异无显著性（P>0.05）。
3 讨论
乳腺癌患者做肿瘤标志物检查时，如果主要标志物不足以明确判断肿瘤活跃程度或情况，还需要做补充标志物的检查，如果主要标志物和补充标志物数值都升高，则更加强了肿瘤活跃的说服力。目前，关于乳腺癌标志物的研究有很多如：糖类抗原CA15-3、CA125、BCA225、CA27-29；蛋白及肽类抗原乳腺癌特异蛋白、胰岛素样生长因子、雌激素受体（ER）和孕酮受体（PR）；还有基因C-erbB2、EIA、Survivin、CYFRA21-1等[1]。临床上用于乳腺癌诊断的标志物主要有CA15-3、CEA、TPS、C-erbB2和TSGF等，单独使用灵敏度都比较低，特别是用于早期诊断漏诊率较高。如何提高早期诊断率是目前国内外学者共同关注的问题。CA15-3是从转移性乳腺癌中分离出来的肿瘤抗原，主要存在于乳腺上皮管腔面，当细胞恶变时，血清水平明显升高，也是目前应用最普遍对乳腺癌较为特异的肿瘤标志物。但在早期乳腺癌诊断中，单独使用因灵敏度较低，应用价值不大[2]。TSGF检测是由我国近几年研发，用于体外筛查恶性肿瘤的方法。TSGF的检测有助于发现人体早期或亚临床期恶性肿瘤，检测各种恶性肿瘤，其敏感度为50.0%～91.1%，特异性不低于90%[3]。C-erbB2基因在乳腺癌中扩增率为18%～47%，美国Strectfus报道乳腺癌患者唾液中C-erbB2蛋白含量较正常人高10倍以上，有望用于早期乳腺癌的筛查。邓君等[5]研究31例早期乳腺癌时，发现C-erbB2阳性诊断率为50.6%，明显高于其它常用诊断标志物。针对单项检测指标阳性诊断率较低的特点，许多研究者尝试用多项指标组合以提高阳性诊断率，有人主张高危人群乳腺癌筛查用乳腺癌特异蛋白、TPS和C-erbB2，而对于病情监测和术后早期复发用CEA、CA15-3联合[4]。我们根据目前乳腺癌研究成果，将阳性率较高的几个标志物进行组合，利用ELISA和FQ-PCR方法客观定量分析各指标，发现CA15-3、TSGF和C-erbB2联合诊断早期乳腺癌（Ⅰ期和Ⅱ期）阳性率达76.9%，明显高于单个标志物和其它三指标组合的阳性率（P<0.05），而与CA15-3、CEA、TSGF、C-erbB2四指标联检出率差异无显著性（P>0.05），并且特异性达到83.3%，基本满足临床需要。因此要保证较高阳性诊断率，又不增加患者经济负担，CA15-3、CEA、TSGF、C-erbB2三者联合检测值得临床应用。
综上所述，肿瘤标志物在乳腺癌的检测中发挥着不可忽略的作用，又因其价格低廉容易被病人所接受，在乳腺癌的初步筛查中至关重要。专家建议，即使病人自我感觉没有特别不适，还是建议每年做一个肿瘤标志物的检测，以求安心。
参考文献：
[1] 刘庆涛，于端珍.CA153在乳腺癌诊断及术后监测中的临床应用[J].肿瘤研究与临床，2000，12（5）：327-328.
[2] 孙建国，陈正堂，曹正怀.TSGF检测在恶性肿瘤诊断及疗效观察中的价值[J].第三军医大学学报，2001，23（6）：731-733.
[3] 邓君，饶绍琴，传良敏.C-ERBB2基因表达和其它肿瘤标志物在乳腺癌诊断中的应用[J].实用医院临床杂志，2006，3（1）：94-95.
[4] 张品良，邵松.乳腺癌肿瘤标志物[J].山东医药，2006，46（11）：65-67.
【关键词】乳腺肿瘤；肿瘤标记；生物学
【中图分类号】R575 【文献标识码】A 【文章编号】1004-7484（2013）03-0485-02
肿瘤标志物tumor marker是指在肿瘤发生和增殖过程中，由肿瘤细胞所产生或分泌并释放到血液、细胞、体液中，反映肿瘤存在和生长的一类物质。能用化学、免疫和分子生物学方法进行定量地检测。包括蛋白质、激素、酶和多胺以及癌基因产物等。肿瘤标志物的血清水平一般与恶性肿瘤的发生、发展、消退、复发等具有良好的相关性。在正常组织或良性疾病中不产生或产生极微。因此，通常通过肿瘤标志物的血清水平测定，可以获得有关恶性肿瘤的辅助诊断、疗效观察、评判预后以及预报复发等方面的信息。临床上常用的乳腺癌肿瘤标志物有：CA153、CEA；补充标志物有：CA549、hCG、降钙素、铁蛋白等。我们以定量的方法检测敏感性和特异度相对较高的5个标志物：血清肿瘤相关抗原（CA15-3）、癌胚抗原（CEA）、恶性肿瘤特异性生长因子（TSGF）、组织多肽特异性抗原（TPS）、C-erbB2，研究它们在评估乳腺癌发生发展中的作用，特别是找到早期预测乳腺癌的可靠标志物。
1 对象与方法
1.1 检测对象所有纳入患者105例均为女性，良性组：20例，其中乳腺病6例，乳腺纤维瘤14例，平均年龄36岁。乳腺癌组：共85例，其中浸润性导管癌66例，浸润性小叶癌14例，髓样癌2例，乳腺浸润性筛状癌3例。采用1997年国际抗癌联盟公布的乳腺癌TNM分类法进行TNM分期，其中Ⅰ期27例，Ⅱ期25例，Ⅲ期19例，Ⅳ期14例，平均年龄44岁。两组病例均于治疗前清晨取静脉血3ml，所有乳腺癌均经病理确诊的初诊者，排除患有其它肿瘤。
1.2 检测方法静脉血离心取上清液，ELISA法测CA15-3、CEA、TSGF、TPS，试剂盒购自瑞典CanAg公司和IDL生物试剂公司。原理为生物素-亲和素双单抗夹心法，形成亲和素-生物素-抗体-抗原-酶标抗体复合物，以日本BIO-RAD公司生产的MODEL550用淋巴细胞分离液分离淋巴细胞，异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法细胞RNA。以逆转录FQ-PCR法检测。引物由上海生物工程公司合成，正反义引物分别为5’-AGCCGCGAGCACCCAAGT-3’，5’-TTGGTGGGCAGGTAGGTGAGTT-3’，探针：5’-CCTGCCAGATC CCGACCCACCT- 3’。FAM荧光作为报告基因标记探针5’端，TAMRA荧光为淬灭基因标记3’端。逆转录反应20μl，42℃反应55min。FQ-PCR反应，逆转录产物5μl，引物400nmol，探针150nmol，dATP、dGTPdCTP各200μmol，dUTP 400μmol，TaqDNA酶1.25u。在美国ABI公司生产的7700Sequence de tector分析仪上进行分析，每份标本均做C-erbB2和β2-微球蛋白测定。扩增参数为：50℃ 2min，95℃ 10min，94℃ 0.5min，66℃ 1min，35次循环。采用BIECHE的标准曲线制备方法，在每次均使用标准品制备标准曲线。根据曲线，仪器自动计算C-erbB2和β2-微球蛋白的拷贝数/ml，以C-erbB2和β2-微球蛋白比值作为C-erbB2的表达水平。
1.3 判定标准临界值：CA15-3为19.3u/ml；CEA为5.0ng/ml；TSGF为64u/ml；TPS为15.8u/L；C-erbB2为C-erbB2/β-actin 1.90，超过临界值为阳性。
1.4 统计学方法计量数据以（±s）表示，采用SPSS 10.0统计软件，进行t检验，计数资料采用χ2检验。
2 结果
2.1 良性乳腺疾病组和乳腺癌组CA15-3、CEA、TSGF、TPS、C-erbB2的测定结果：5种标志物的水平及阳性率明显高于良性病变组（P<0.05或P<0.01）。
2.2 单项指标对于乳腺癌诊断的评价根据良性对照结果，CA15-3、CEA、TSGF、TPS、C-erbB2对乳腺癌诊断的阳性率分别为51.77%、45.88%、54.12%、38.82%、65.88%，乳腺癌Ⅲ期的阳性率明显高于Ⅰ期（P<0.05），而不同指标在不同期阳性率不同，且存在假阳性。
2.3 联合检测对Ⅰ期和Ⅱ期乳腺癌诊断的评价以上单个肿瘤标志物对乳腺癌诊断阳性率不高，特别是对早期乳腺癌诊断阳性率较低，我们选择阳性率相对较高的标志物进行组合，可以提高Ⅰ期和Ⅱ期乳腺癌诊断的灵敏度。其中以CA15-3、TSGF和C-erbB2联合，其特异性和敏感性与其它三种标志物组合相比差异有显著性（P<0.05），而与CA15-3、CEA、TSGF、C-erbB2四者组合差异无显著性（P>0.05）。
3 讨论
乳腺癌患者做肿瘤标志物检查时，如果主要标志物不足以明确判断肿瘤活跃程度或情况，还需要做补充标志物的检查，如果主要标志物和补充标志物数值都升高，则更加强了肿瘤活跃的说服力。目前，关于乳腺癌标志物的研究有很多如：糖类抗原CA15-3、CA125、BCA225、CA27-29；蛋白及肽类抗原乳腺癌特异蛋白、胰岛素样生长因子、雌激素受体（ER）和孕酮受体（PR）；还有基因C-erbB2、EIA、Survivin、CYFRA21-1等[1]。临床上用于乳腺癌诊断的标志物主要有CA15-3、CEA、TPS、C-erbB2和TSGF等，单独使用灵敏度都比较低，特别是用于早期诊断漏诊率较高。如何提高早期诊断率是目前国内外学者共同关注的问题。CA15-3是从转移性乳腺癌中分离出来的肿瘤抗原，主要存在于乳腺上皮管腔面，当细胞恶变时，血清水平明显升高，也是目前应用最普遍对乳腺癌较为特异的肿瘤标志物。但在早期乳腺癌诊断中，单独使用因灵敏度较低，应用价值不大[2]。TSGF检测是由我国近几年研发，用于体外筛查恶性肿瘤的方法。TSGF的检测有助于发现人体早期或亚临床期恶性肿瘤，检测各种恶性肿瘤，其敏感度为50.0%～91.1%，特异性不低于90%[3]。C-erbB2基因在乳腺癌中扩增率为18%～47%，美国Strectfus报道乳腺癌患者唾液中C-erbB2蛋白含量较正常人高10倍以上，有望用于早期乳腺癌的筛查。邓君等[5]研究31例早期乳腺癌时，发现C-erbB2阳性诊断率为50.6%，明显高于其它常用诊断标志物。针对单项检测指标阳性诊断率较低的特点，许多研究者尝试用多项指标组合以提高阳性诊断率，有人主张高危人群乳腺癌筛查用乳腺癌特异蛋白、TPS和C-erbB2，而对于病情监测和术后早期复发用CEA、CA15-3联合[4]。我们根据目前乳腺癌研究成果，将阳性率较高的几个标志物进行组合，利用ELISA和FQ-PCR方法客观定量分析各指标，发现CA15-3、TSGF和C-erbB2联合诊断早期乳腺癌（Ⅰ期和Ⅱ期）阳性率达76.9%，明显高于单个标志物和其它三指标组合的阳性率（P<0.05），而与CA15-3、CEA、TSGF、C-erbB2四指标联检出率差异无显著性（P>0.05），并且特异性达到83.3%，基本满足临床需要。因此要保证较高阳性诊断率，又不增加患者经济负担，CA15-3、CEA、TSGF、C-erbB2三者联合检测值得临床应用。
综上所述，肿瘤标志物在乳腺癌的检测中发挥着不可忽略的作用，又因其价格低廉容易被病人所接受，在乳腺癌的初步筛查中至关重要。专家建议，即使病人自我感觉没有特别不适，还是建议每年做一个肿瘤标志物的检测，以求安心。
参考文献：
[1] 刘庆涛，于端珍.CA153在乳腺癌诊断及术后监测中的临床应用[J].肿瘤研究与临床，2000，12（5）：327-328.
[2] 孙建国，陈正堂，曹正怀.TSGF检测在恶性肿瘤诊断及疗效观察中的价值[J].第三军医大学学报，2001，23（6）：731-733.
[3] 邓君，饶绍琴，传良敏.C-ERBB2基因表达和其它肿瘤标志物在乳腺癌诊断中的应用[J].实用医院临床杂志，2006，3（1）：94-95.
[4] 张品良，邵松.乳腺癌肿瘤标志物[J].山东医药，2006，46（11）：65-67.