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摘 要从一次学生采用普通的玻片义务查血型社会实践活动,看存在的问题与改进,思考医学检验职业教育中应注意问题。
关键词玻片法; 血型鉴定;职业教育
事件:一次学生义务查血型活动
对象:湘潭职业技术学院临床检验07-301班;07-302班;05-501班
地点:湘潭职业技术学院校园樟树林
时间:2008.6
温度:30 oC左右
事件:由本院部分学生组织参加社会实践,义务为本校大学生查血型
海报: A型血,锐意进取;B型血,多愁善感;O型血,大公无私;AB型血,成熟稳重
方法:简易玻片法(正向定型法)。
操作:手指采血(末梢血),直接将手指血印在在玻片两端上(未经处理的普通玻片),加入抗A或抗B抗体一滴(抗体未采用任何保护措施), 然后用采血针搅拌混匀,肉眼观察。
判断:只有A凝集,A型;只有B凝集,B型;AB都凝集,AB型;A、B都不凝集,O型。
现场反应:火爆。
学生反馈:自信满满,非常有成就感。
老师反馈:严肃批评,操作不严谨。
问题所在:所有的检验操作过程不规范。
临床检验资深人员反馈:形成坏习惯,对工作不负责任。
1可能问题所在
如玻片、环境、温度、反应时间、抗体的效价、血量、抗体与血液的比例、操作规范、反应体系等。
1.1玻片本身的影响
在没有时间限制条件下,血液含有足够的凝血因子,足够时间血滴在玻片本身也会发生凝血。实验显示5～10min 即可显示,特别是温度高更明显。其原理如早期CT[1](普通试管凝血时间测定一样),由于玻片可能含有白陶土类似成分,启动内源性凝血途径;或水分挥发凝结。
1.2环境干扰
①粉尘、油脂等干扰,可能导致非特异性凝集或溶血,严格消毒处理及选择粉尘较少的环境。②血液内含有大量凝血因子,纤维蛋白原等,环境的各种因素都有可能启动凝血途径的活化,导致纤维蛋白原转换为纤维蛋白,出现凝血,假阳性。
1.3温度影响
①过低,低温可活化血小板及F vii与F xi, 启动血凝,凝血反应时间加快。(如实验室收取血清就是利用低温加速血液凝固,是血清更快析出)②温度过高,Fg变性析出,也促进血凝;另外;凝集反应所使用的抗体本身,抗体生物学活性保持又都不适宜高温。适宜的温度应是抗体最佳反应温度
1.4操作错误
①红细胞本身脆性大,采血后直接将血印在玻片上,印片时的挤压,容易导致破裂红细胞破坏而溶血。②受检者的皮肤及其它部位等接触血液,导致组织因子等污染而凝血。③先加红细胞,由于血液红细胞比重大,导致粘附并沉积于玻片,再加抗体时,也不容易混匀,出现假阳性。④少部分学生看到红细胞沉积黏附,直接用枪头或采血针去搅,容易导致红细胞破裂溶血,或凝集红细胞散在溶解,不能出现肉眼可见的典型凝集, 或细胞过度混悬,出现假阳性或假阴性,干扰结果判断。
1.5反应时间影响
①血型鉴定的RBC凝集试验实际上是一个特异性的免疫反应试验,在适宜条件下,反应敏感和迅速(15～30s),特异性强。②反应处理时间越长,影响因素越多,容易出现假阳性。如血液本身的沉积与凝结等。
1.6反应体系影响
①由于直接采指头血印片,出血量有的多,有的少,反应体系不同(假定抗体量一致)。②一般反应体系越大(抗原抗体比例适当),结果越明显;反过来,体系越小,凝集与非凝集都不典型,影响结果判断。
1.7抗体的因素
①不能确定抗体的有效作用的效价,标志上的生产日期及有效作用只是一个参考值,随着使用或储存的时间的延长其效价是下降的,加上蛋白质本身的降解作用,与抗体的生物学活性中心破坏有关。②抗体效价太低,少量的凝集物被稀释,假阴性;抗体效价太高,容易导致非特异性结合,如与交叉抗原结合,出现非特异性凝集反应,假阳性。③非最适比例抗原抗体结合会导致抗原抗体复合物形成过少,抗原抗体复合物溶解,或可逆性结合而溶解,出现假阴性。④血型抗体本身的特性,玻片法所使用的抗体是天然抗体,属IgM型,是一个五聚体,优点是可以直接发生肉眼可见明显凝集反应,但是,IgM型抗体有一个弱点,不耐热,反应体系最好是室温18～24 oC左右。⑤盐水介质,无法完全消除红细胞之间静电排斥,出现假阴性。⑥抗体的最适反应温度为4～25oC左右,要求抗体处理在冰上进行,以保证抗体活性及防止其变性。⑦相对于特异的IgG抗体,IgM型抗体特异性与敏感性都要低,对温度要求更高。
1.8抗原因素
①血细胞过多,抗体量不够,凝集物太少,加上其他悬浮红细胞的干扰,出现假阴性。②血液量少,抗体量过多,红细胞被过度稀释,复合物形成量少及形成抗原与抗体的复合物溶解,或可逆性解离,也可能导致假阴性的出现。③血型抗原抗原性随年龄周期性变化,小孩与老人抗原性较弱,凝集不典型。④红细胞本身带负电,静电排斥,不易发生凝集。⑤只有最佳比例抗原抗体反应,凝集反应最显著,凝集物多。
2目前临床采用办法[1]
1.1试管法
早期,采用洗涤RBC,去除凝血因子、钙离子与Fg等的影响,然后制备5%RBC生理盐水稀释液1滴,在预先准备好的抗A与抗B的标准血清小试管加入一滴,抗体与抗原反应稀释度为1:1,实现最佳抗原抗体比例结合,以肉眼可见凝集反应为阳性判断标准。
1.2分子筛实验法
现今,特异性凝胶卡检测法,即事先抗体标记凝胶卡,加入待检RBC,抗体,实现抗体与RBC特异性在反应腔结合,离心去掉未结合红细胞及反应液,肉眼判断凝集反应,不用考虑凝血因子、钙离子与Fg等影响。其原理类似Coombs试验[2],也可以直接用抗A、抗B、或抗D抗体(IgG)标记凝胶,或直接采用IgM型抗体的非标记中性凝胶,用来检测A、B、O、RH-血型及各种血型亚型。
3玻片法鉴定血型规范操作
3.1改进
考虑到社会实践条件简陋,采用玻片鉴定法在特定场合的操作方便,其改进如下:①应尽量避免红细胞直接接触玻片,及减少人体组织接触玻片;②最好先采用加样枪吸取抗体滴加于载玻片,然后采用毛细管吸取一定量的血液混悬与抗体稀释液中,减少血细胞粘附与沉积,稀释凝血因子, 又能充分与抗体反应;③禁止用枪头或针尖搅拌红细胞;④所有以上影响抗原抗体的反应因素,都应该先做预实验排除,得出最佳反应条件,最起码确定抗A与抗B抗体最佳效价,及抗原与抗体反应的最佳比例。
3.2预实验
①最佳抗体效价测定:采用恒定血液量抗原,测定抗体最佳反应浓度。(可采用酶标板)②最佳抗原反应量测定:包被恒定浓度抗体,测定血液最佳反应血液量。(可采用酶标板)③测定最佳反应时间。④尽量控制温度在室温20度左右(抗体在冰盒上操作)。⑤将一定量最佳反应量的抗体滴定于玻片(洗涤消毒过的),避免血细胞直接接触玻片造成挤压、粘附或沉积,并可稀释血液中凝血因子、Fg等,尽量减少内外凝血途径活化的干扰。(抗体保持在冰盒上)⑥采用洗涤消毒后毛细滴管或Tip头取最适血量,加入最适反应血量,振摇混悬。⑦根据最适时间(15-30s)判定结果。⑧结果判断:肉眼可见凝集现象。
3.3具体操作
采用已知血型为A、B两组同学各10名,各采左手无名指末梢全血10 μl,采用96孔酶标板,按如下方案倍比稀释。
+10μl Blood1 1:2 1:4 1:8 1:161:32 1:64....
AControl(NS)100 50 25 12.56.253.1251.0625100μl
BControl(NS)100 50 25 12.56.25 3.125 1.0625100μl
①第一孔生理盐水(NS)孔作阴性对照,直接加100μl NS,隔开第二孔,从第三孔开始每孔先预加100μl NS,直到最后一孔。②第二孔加入200μl 抗体,从第二孔取100μl 抗体,转入第三孔,然后从第三孔取100μl 移入第四孔,以此类推,最后一孔弃去100μl 稀释液,总的反应体系保持为100μl。③加入10μl全血。④A表示抗A抗体组,加10μl A型全血; B表示抗B抗体组,加B型全血,第二孔加100μl抗体,生理盐水对照孔不加抗体。⑤以肉眼可见最佳凝集效果为抗原抗体最适比。
环境:抗体冰上处理;时间:15～30s;温度:20度左右(冰上控制)。
4优势与问题
4.1优势
应用于血型鉴定初筛,不受场地与条件的限制,指头本身采血量少,减少了抗体的浪费与被检人痛苦
4.2问题
但无法完全排除部分由于红细胞本身抗原性较弱或静电排斥引起的假阴性,其适用范围是现场初筛,不适用于做法医学或医学诊断依据。
4.3问题处理
如因血型导致的家庭或婚姻问题的咨询,实验室应及时进行正反向定型试验,或采用敏感性与特异性更高的试管法及分子筛实验确诊。
参考文献
[1] 叶应妩、王毓三、申子瑜 主编.全国临床检验操作规程(第三版). 南京: 东南大学 出版社,2006,10: 210.
[2] 朱立清、陈学敏 主编.免疫学常用实验方法. 北京: 人民军医出版社, 2003.3: 111.
作者简介:
林雪迟男(1971-5), 医学博士, 湘潭职业技术学院医学技术系临床检验基础教师。
关键词玻片法; 血型鉴定;职业教育
事件:一次学生义务查血型活动
对象:湘潭职业技术学院临床检验07-301班;07-302班;05-501班
地点:湘潭职业技术学院校园樟树林
时间:2008.6
温度:30 oC左右
事件:由本院部分学生组织参加社会实践,义务为本校大学生查血型
海报: A型血,锐意进取;B型血,多愁善感;O型血,大公无私;AB型血,成熟稳重
方法:简易玻片法(正向定型法)。
操作:手指采血(末梢血),直接将手指血印在在玻片两端上(未经处理的普通玻片),加入抗A或抗B抗体一滴(抗体未采用任何保护措施), 然后用采血针搅拌混匀,肉眼观察。
判断:只有A凝集,A型;只有B凝集,B型;AB都凝集,AB型;A、B都不凝集,O型。
现场反应:火爆。
学生反馈:自信满满,非常有成就感。
老师反馈:严肃批评,操作不严谨。
问题所在:所有的检验操作过程不规范。
临床检验资深人员反馈:形成坏习惯,对工作不负责任。
1可能问题所在
如玻片、环境、温度、反应时间、抗体的效价、血量、抗体与血液的比例、操作规范、反应体系等。
1.1玻片本身的影响
在没有时间限制条件下,血液含有足够的凝血因子,足够时间血滴在玻片本身也会发生凝血。实验显示5～10min 即可显示,特别是温度高更明显。其原理如早期CT[1](普通试管凝血时间测定一样),由于玻片可能含有白陶土类似成分,启动内源性凝血途径;或水分挥发凝结。
1.2环境干扰
①粉尘、油脂等干扰,可能导致非特异性凝集或溶血,严格消毒处理及选择粉尘较少的环境。②血液内含有大量凝血因子,纤维蛋白原等,环境的各种因素都有可能启动凝血途径的活化,导致纤维蛋白原转换为纤维蛋白,出现凝血,假阳性。
1.3温度影响
①过低,低温可活化血小板及F vii与F xi, 启动血凝,凝血反应时间加快。(如实验室收取血清就是利用低温加速血液凝固,是血清更快析出)②温度过高,Fg变性析出,也促进血凝;另外;凝集反应所使用的抗体本身,抗体生物学活性保持又都不适宜高温。适宜的温度应是抗体最佳反应温度
1.4操作错误
①红细胞本身脆性大,采血后直接将血印在玻片上,印片时的挤压,容易导致破裂红细胞破坏而溶血。②受检者的皮肤及其它部位等接触血液,导致组织因子等污染而凝血。③先加红细胞,由于血液红细胞比重大,导致粘附并沉积于玻片,再加抗体时,也不容易混匀,出现假阳性。④少部分学生看到红细胞沉积黏附,直接用枪头或采血针去搅,容易导致红细胞破裂溶血,或凝集红细胞散在溶解,不能出现肉眼可见的典型凝集, 或细胞过度混悬,出现假阳性或假阴性,干扰结果判断。
1.5反应时间影响
①血型鉴定的RBC凝集试验实际上是一个特异性的免疫反应试验,在适宜条件下,反应敏感和迅速(15～30s),特异性强。②反应处理时间越长,影响因素越多,容易出现假阳性。如血液本身的沉积与凝结等。
1.6反应体系影响
①由于直接采指头血印片,出血量有的多,有的少,反应体系不同(假定抗体量一致)。②一般反应体系越大(抗原抗体比例适当),结果越明显;反过来,体系越小,凝集与非凝集都不典型,影响结果判断。
1.7抗体的因素
①不能确定抗体的有效作用的效价,标志上的生产日期及有效作用只是一个参考值,随着使用或储存的时间的延长其效价是下降的,加上蛋白质本身的降解作用,与抗体的生物学活性中心破坏有关。②抗体效价太低,少量的凝集物被稀释,假阴性;抗体效价太高,容易导致非特异性结合,如与交叉抗原结合,出现非特异性凝集反应,假阳性。③非最适比例抗原抗体结合会导致抗原抗体复合物形成过少,抗原抗体复合物溶解,或可逆性结合而溶解,出现假阴性。④血型抗体本身的特性,玻片法所使用的抗体是天然抗体,属IgM型,是一个五聚体,优点是可以直接发生肉眼可见明显凝集反应,但是,IgM型抗体有一个弱点,不耐热,反应体系最好是室温18～24 oC左右。⑤盐水介质,无法完全消除红细胞之间静电排斥,出现假阴性。⑥抗体的最适反应温度为4～25oC左右,要求抗体处理在冰上进行,以保证抗体活性及防止其变性。⑦相对于特异的IgG抗体,IgM型抗体特异性与敏感性都要低,对温度要求更高。
1.8抗原因素
①血细胞过多,抗体量不够,凝集物太少,加上其他悬浮红细胞的干扰,出现假阴性。②血液量少,抗体量过多,红细胞被过度稀释,复合物形成量少及形成抗原与抗体的复合物溶解,或可逆性解离,也可能导致假阴性的出现。③血型抗原抗原性随年龄周期性变化,小孩与老人抗原性较弱,凝集不典型。④红细胞本身带负电,静电排斥,不易发生凝集。⑤只有最佳比例抗原抗体反应,凝集反应最显著,凝集物多。
2目前临床采用办法[1]
1.1试管法
早期,采用洗涤RBC,去除凝血因子、钙离子与Fg等的影响,然后制备5%RBC生理盐水稀释液1滴,在预先准备好的抗A与抗B的标准血清小试管加入一滴,抗体与抗原反应稀释度为1:1,实现最佳抗原抗体比例结合,以肉眼可见凝集反应为阳性判断标准。
1.2分子筛实验法
现今,特异性凝胶卡检测法,即事先抗体标记凝胶卡,加入待检RBC,抗体,实现抗体与RBC特异性在反应腔结合,离心去掉未结合红细胞及反应液,肉眼判断凝集反应,不用考虑凝血因子、钙离子与Fg等影响。其原理类似Coombs试验[2],也可以直接用抗A、抗B、或抗D抗体(IgG)标记凝胶,或直接采用IgM型抗体的非标记中性凝胶,用来检测A、B、O、RH-血型及各种血型亚型。
3玻片法鉴定血型规范操作
3.1改进
考虑到社会实践条件简陋,采用玻片鉴定法在特定场合的操作方便,其改进如下:①应尽量避免红细胞直接接触玻片,及减少人体组织接触玻片;②最好先采用加样枪吸取抗体滴加于载玻片,然后采用毛细管吸取一定量的血液混悬与抗体稀释液中,减少血细胞粘附与沉积,稀释凝血因子, 又能充分与抗体反应;③禁止用枪头或针尖搅拌红细胞;④所有以上影响抗原抗体的反应因素,都应该先做预实验排除,得出最佳反应条件,最起码确定抗A与抗B抗体最佳效价,及抗原与抗体反应的最佳比例。
3.2预实验
①最佳抗体效价测定:采用恒定血液量抗原,测定抗体最佳反应浓度。(可采用酶标板)②最佳抗原反应量测定:包被恒定浓度抗体,测定血液最佳反应血液量。(可采用酶标板)③测定最佳反应时间。④尽量控制温度在室温20度左右(抗体在冰盒上操作)。⑤将一定量最佳反应量的抗体滴定于玻片(洗涤消毒过的),避免血细胞直接接触玻片造成挤压、粘附或沉积,并可稀释血液中凝血因子、Fg等,尽量减少内外凝血途径活化的干扰。(抗体保持在冰盒上)⑥采用洗涤消毒后毛细滴管或Tip头取最适血量,加入最适反应血量,振摇混悬。⑦根据最适时间(15-30s)判定结果。⑧结果判断:肉眼可见凝集现象。
3.3具体操作
采用已知血型为A、B两组同学各10名,各采左手无名指末梢全血10 μl,采用96孔酶标板,按如下方案倍比稀释。
+10μl Blood1 1:2 1:4 1:8 1:161:32 1:64....
AControl(NS)100 50 25 12.56.253.1251.0625100μl
BControl(NS)100 50 25 12.56.25 3.125 1.0625100μl
①第一孔生理盐水(NS)孔作阴性对照,直接加100μl NS,隔开第二孔,从第三孔开始每孔先预加100μl NS,直到最后一孔。②第二孔加入200μl 抗体,从第二孔取100μl 抗体,转入第三孔,然后从第三孔取100μl 移入第四孔,以此类推,最后一孔弃去100μl 稀释液,总的反应体系保持为100μl。③加入10μl全血。④A表示抗A抗体组,加10μl A型全血; B表示抗B抗体组,加B型全血,第二孔加100μl抗体,生理盐水对照孔不加抗体。⑤以肉眼可见最佳凝集效果为抗原抗体最适比。
环境:抗体冰上处理;时间:15～30s;温度:20度左右(冰上控制)。
4优势与问题
4.1优势
应用于血型鉴定初筛,不受场地与条件的限制,指头本身采血量少,减少了抗体的浪费与被检人痛苦
4.2问题
但无法完全排除部分由于红细胞本身抗原性较弱或静电排斥引起的假阴性,其适用范围是现场初筛,不适用于做法医学或医学诊断依据。
4.3问题处理
如因血型导致的家庭或婚姻问题的咨询,实验室应及时进行正反向定型试验,或采用敏感性与特异性更高的试管法及分子筛实验确诊。
参考文献
[1] 叶应妩、王毓三、申子瑜 主编.全国临床检验操作规程(第三版). 南京: 东南大学 出版社,2006,10: 210.
[2] 朱立清、陈学敏 主编.免疫学常用实验方法. 北京: 人民军医出版社, 2003.3: 111.
作者简介:
林雪迟男(1971-5), 医学博士, 湘潭职业技术学院医学技术系临床检验基础教师。