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摘要：目的 初步探究铁调素抗乙型肝炎病毒（HBV）活性。方法 使用铁调素处理pcDNA1.3转染的HepG2细胞及pSM2转染的Huh7细胞，检测并分析不同时间点铁调素处理组与未处理组之间培养上清液中HBV-DNA、HBeAg水平的差异。结果 与未处理组比较，pcDNA1.3转染HepG2细胞铁调素处理组HBV DNA水平显著降低（P<0.05），pSM2转染Huh7细胞铁调素处理组HBV DNA水平显著降低（P<0.05）。与未处理组比较，pcDNA1.3转染HepG2细胞铁调素处理组HBeAg表达显著降低（P<0.05），pSM2转染Huh7细胞铁调素处理组HBeAg表达显著降低（P<0.05）。结论 通过研究我们初步证明了铁调素具有一定的抑制HBV复制的活性。
关键词：肝炎病毒，乙型;铁调素;HepG2细胞;Huh7细胞
铁调素（Hepcidin）是一种由肝脏合成并分泌富含半胱氨酸的生物活性多肽，由于铁调素在体外研究过程中表现出明显的抗菌活性属于高度保守的防御性多肽，作为一种阳离子抗菌多肽铁调素也被称为肝脏抗菌多肽（LEAP-1）。铁调素除在维持铁稳态中发挥作用外还具有一定的抗菌活性，既往对铁调素的抗菌活性研究中我们发现，铁调素通过限制细胞外铁得获得，一些细胞以这种“营养免疫”的形式对抗细菌感染。近期另一些研究提出，铁调素具有不依赖于以往“营养免疫”的形式而独立影响免疫应答的作用[1]。然而在目前没有体内研究结论支持的情况下，一些研究报道铁调素可能通过一种尚未被充分了解的机制抑制炎性细胞因子。然而铁调素在宿主防御中具有独立作用都仅是推测性的结论。近期有学者报道体内常量铁调素未能表现出显著的免疫学活性，而高浓度铁调素（浓度为体内常量的数十倍）在体外细胞实验中表现出一定的免疫学活性[2，3]。并有研究报道体外细胞实验中高浓度铁调素可以抑制HCV/HIV病毒复制[4]，而铁调素能否同样影响HBV的复制仍未有提及。为此，本课题通过探究高浓度铁调素对HBV病毒复制的影响，从而明确应用铁调素治疗慢性乙型病毒性肝炎的临床价值。
1 研究对象与方法
1.1 仪器与试剂 低温高速离心机;超低温冰箱;HBV-DNA病毒定量检测试剂盒（批号：20180512 R1）;雅培全自动化学发光免疫分析仪（i2000SR）;
1.2 细胞培养与质粒转染 以含有100 U/mL青霉素、100 μg/mL链霉素、10%胎牛血清的DMEM对HepG2细胞、Huh7细胞（上海富亨细胞库）在37℃、5%CO2培养箱中培养，取对数生长期细胞接种于6孔板，调整每孔细胞数约为1×106。取具备乙型肝炎病毒全基因组的pC1.3质粒（pSM2）1.8 μg，混合脂质载体（Thermo Scientific，USA）2μL，静置20 min，转染接种于6孔板24 h，继续培养细胞达到80%融合;在37℃、5%CO2培养箱中培养6 h后换液，继续培养定12h、24h、48h取细胞上清液。
1.3 统计学处理 应用SPSS 17.0软件进行分析。应用 Kolmogorov-Smirnov检验对定量资料进行正态分布检验，应用Spearman相关分析对数据进行相关性分析。以P<0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.1 铁调素处理组与未处理不同时间点HBV DNA水平的比较
与未处理组比较，pcDNA1.3转染HepG2细胞铁调素处理组在12h时即出现HBV DNA水平的下降，在处理48h时HBV DNA水平显著降低（P<0.05）如图2A所示。
与未处理组比较，pSM2转染Huh7细胞铁调素处理组在24h时即出现HBV DNA水平的下降，在处理48h时HBV DNA水平显著降低（P<0.05）如图2B所示。
2.2 铁调素处理组与未处理不同时间点HBeAg水平的比较
与未处理组比较，pcDNA1.3转染HepG2细胞铁调素处理组在24h时即出现HBeAg表达的下降，在处理48h时HBeAg表达显著降低（P<0.05）如图3A所示。
与未处理组比较，pSM2转染Huh7细胞HBeAg铁调素处理组在24h时即出现HBeAg表达的下降，在处理48h时HBeAg表达显著降低（P<0.05）如图3B所示。
4 讨论
据既往研究报道铁调素在体外实验中表現出显著的抗菌活性，并且铁调素的抗菌活性与它的生理活性相关，具体机制为铁调素通过降铁作用导致体内铁元素的低水平，低铁环境使得细菌生长繁殖受到这种“铁营养”缺乏的影响，表现出抑制细菌生长繁殖的活性。所以最初铁调素抗菌活性正是依靠这种营养性免疫的形式实现的。所以在感染性疾病中铁调素扮演的角色仍存在争议。近期研究发现铁调素在HCV及HIV感染过程中表达受到显著抑制，在体外实验中铁调素可以抑制Huh7细胞中HCV病毒的复制[5]，此外在HIV感染的过程中铁调素的早期表达对于随后的病毒载量有着密切联系，但是这种相关机制尚未明确。于是我们对铁调素影响HBV复制进行了初步研究。
我们通过模拟HBV感染肝细胞对肝炎、肝癌体外细胞系进行HBV病毒质粒的转染，并以高浓度的铁调素加以处理，通过定时测定培养上清液HBeAg、HBV DNA表达水平来了解铁调素对HBV复制的影响，本研究发现在铁调素的作用下HBV的复制受到显著抑制。结合国内外的研究我们对铁调素抑制HBV复制的具体机制进行了推测，据国外学者对铁调素抗HCV活性研究的过程中发现，铁调素的抗病毒活性可能与其对肝细胞内抗病毒状态的影响相关。在铁调素处理的肝细胞中IFN的表达不是定向的，但是在铁调素的作用下肝细胞中一些IFN诱导基因的表达显著上调，如OAS1和IFIT1（ISG56）。其中已知的IFIT1是影响细胞内抗病毒状态中的重要蛋白质，而铁调素刺激上调的IFIT1可能直接参与了铁调素介导的抗病毒作用。另外，高水平铁调素可直接导致体内的低铁环境，并通过这种营养限制的方式导致病毒在胞内的复制繁殖过程受阻，从而表现出对病毒复制抑制效应。以上两点皆是我们对铁调素抗HBV活性具体机制的推测，然而由于铁调素对机体免疫反应的复杂作用，所以这种抗HBV活性的具体机制需要进一步探究。我们的研究初步证明了铁调素具有一定的抑制HBV复制的活性，也进一步佐证了应用铁调素对于治疗慢性乙型病毒肝炎的临床价值。 基金：安徽省科技厅重点研究与开发计划项目（1804h08020236）;安徽省高校自然科学研究项目（KJ2018A0206）;安徽医科大学第二附属医院首批“火花计划”科研项目（2015hhjh06）
参考文献：
[1]Sow FB，Florence WC，Satoskar AR，Schlesinger LS，Zwilling BS，Lafuse WP. Expression and localization of hepcidin in macrophages：a role in host defense against tuberculosis. Journal of LeukocyteBiology. 2007;82（4）：934–45.
[2]Peyssonnaux C，Zinkernagel AS，Datta V，Lauth X，Johnson RS，Nizet V. TLR4-dependent hepcidin expression by myeloid cells in response to bacterial pathogens. Blood. 2006;107（9）：3727–32.
[3]Hunter HN，Fulton DB，Ganz T，Vogel HJ. The solution structure of human hepcidin，apeptide hormone with antimicrobial activity that is involved in iron uptake and hereditary hemochromatosis. Journal of Biological Chemistry. 2002;277（40）：37597–603.
[4] Lambrecht RW，Sterling RK，Naishadham D，Stoddard AM，Rogers T，Morishima C，et al. Iron levels in hepatocytes and portal tract cells predict progression and outcomes of patients with advanced chronic hepatitis C. Gastroenterology. 2011;140（5）：1490–500.
[5] Liu H，Trinh T L，Dong H，et al. Iron Regulator Hepcidin Exhibits Antiviral Activity against Hepatitis C Virus. PLoS ONE，2012，7（10）：e46631.
作者簡介：
王兆飞，男，硕士研究生;单位：安徽医科大学第二附属医院 检验科，合肥230601
管世鹤，男，教授，主任技师，博士生导师，责任作者，单位：安徽医科大学第二附属医院 检验科，合肥230601，E-mail：[email protected]。
关键词：肝炎病毒，乙型;铁调素;HepG2细胞;Huh7细胞
铁调素（Hepcidin）是一种由肝脏合成并分泌富含半胱氨酸的生物活性多肽，由于铁调素在体外研究过程中表现出明显的抗菌活性属于高度保守的防御性多肽，作为一种阳离子抗菌多肽铁调素也被称为肝脏抗菌多肽（LEAP-1）。铁调素除在维持铁稳态中发挥作用外还具有一定的抗菌活性，既往对铁调素的抗菌活性研究中我们发现，铁调素通过限制细胞外铁得获得，一些细胞以这种“营养免疫”的形式对抗细菌感染。近期另一些研究提出，铁调素具有不依赖于以往“营养免疫”的形式而独立影响免疫应答的作用[1]。然而在目前没有体内研究结论支持的情况下，一些研究报道铁调素可能通过一种尚未被充分了解的机制抑制炎性细胞因子。然而铁调素在宿主防御中具有独立作用都仅是推测性的结论。近期有学者报道体内常量铁调素未能表现出显著的免疫学活性，而高浓度铁调素（浓度为体内常量的数十倍）在体外细胞实验中表现出一定的免疫学活性[2，3]。并有研究报道体外细胞实验中高浓度铁调素可以抑制HCV/HIV病毒复制[4]，而铁调素能否同样影响HBV的复制仍未有提及。为此，本课题通过探究高浓度铁调素对HBV病毒复制的影响，从而明确应用铁调素治疗慢性乙型病毒性肝炎的临床价值。
1 研究对象与方法
1.1 仪器与试剂 低温高速离心机;超低温冰箱;HBV-DNA病毒定量检测试剂盒（批号：20180512 R1）;雅培全自动化学发光免疫分析仪（i2000SR）;
1.2 细胞培养与质粒转染 以含有100 U/mL青霉素、100 μg/mL链霉素、10%胎牛血清的DMEM对HepG2细胞、Huh7细胞（上海富亨细胞库）在37℃、5%CO2培养箱中培养，取对数生长期细胞接种于6孔板，调整每孔细胞数约为1×106。取具备乙型肝炎病毒全基因组的pC1.3质粒（pSM2）1.8 μg，混合脂质载体（Thermo Scientific，USA）2μL，静置20 min，转染接种于6孔板24 h，继续培养细胞达到80%融合;在37℃、5%CO2培养箱中培养6 h后换液，继续培养定12h、24h、48h取细胞上清液。
1.3 统计学处理 应用SPSS 17.0软件进行分析。应用 Kolmogorov-Smirnov检验对定量资料进行正态分布检验，应用Spearman相关分析对数据进行相关性分析。以P<0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.1 铁调素处理组与未处理不同时间点HBV DNA水平的比较
与未处理组比较，pcDNA1.3转染HepG2细胞铁调素处理组在12h时即出现HBV DNA水平的下降，在处理48h时HBV DNA水平显著降低（P<0.05）如图2A所示。
与未处理组比较，pSM2转染Huh7细胞铁调素处理组在24h时即出现HBV DNA水平的下降，在处理48h时HBV DNA水平显著降低（P<0.05）如图2B所示。
2.2 铁调素处理组与未处理不同时间点HBeAg水平的比较
与未处理组比较，pcDNA1.3转染HepG2细胞铁调素处理组在24h时即出现HBeAg表达的下降，在处理48h时HBeAg表达显著降低（P<0.05）如图3A所示。
与未处理组比较，pSM2转染Huh7细胞HBeAg铁调素处理组在24h时即出现HBeAg表达的下降，在处理48h时HBeAg表达显著降低（P<0.05）如图3B所示。
4 讨论
据既往研究报道铁调素在体外实验中表現出显著的抗菌活性，并且铁调素的抗菌活性与它的生理活性相关，具体机制为铁调素通过降铁作用导致体内铁元素的低水平，低铁环境使得细菌生长繁殖受到这种“铁营养”缺乏的影响，表现出抑制细菌生长繁殖的活性。所以最初铁调素抗菌活性正是依靠这种营养性免疫的形式实现的。所以在感染性疾病中铁调素扮演的角色仍存在争议。近期研究发现铁调素在HCV及HIV感染过程中表达受到显著抑制，在体外实验中铁调素可以抑制Huh7细胞中HCV病毒的复制[5]，此外在HIV感染的过程中铁调素的早期表达对于随后的病毒载量有着密切联系，但是这种相关机制尚未明确。于是我们对铁调素影响HBV复制进行了初步研究。
我们通过模拟HBV感染肝细胞对肝炎、肝癌体外细胞系进行HBV病毒质粒的转染，并以高浓度的铁调素加以处理，通过定时测定培养上清液HBeAg、HBV DNA表达水平来了解铁调素对HBV复制的影响，本研究发现在铁调素的作用下HBV的复制受到显著抑制。结合国内外的研究我们对铁调素抑制HBV复制的具体机制进行了推测，据国外学者对铁调素抗HCV活性研究的过程中发现，铁调素的抗病毒活性可能与其对肝细胞内抗病毒状态的影响相关。在铁调素处理的肝细胞中IFN的表达不是定向的，但是在铁调素的作用下肝细胞中一些IFN诱导基因的表达显著上调，如OAS1和IFIT1（ISG56）。其中已知的IFIT1是影响细胞内抗病毒状态中的重要蛋白质，而铁调素刺激上调的IFIT1可能直接参与了铁调素介导的抗病毒作用。另外，高水平铁调素可直接导致体内的低铁环境，并通过这种营养限制的方式导致病毒在胞内的复制繁殖过程受阻，从而表现出对病毒复制抑制效应。以上两点皆是我们对铁调素抗HBV活性具体机制的推测，然而由于铁调素对机体免疫反应的复杂作用，所以这种抗HBV活性的具体机制需要进一步探究。我们的研究初步证明了铁调素具有一定的抑制HBV复制的活性，也进一步佐证了应用铁调素对于治疗慢性乙型病毒肝炎的临床价值。 基金：安徽省科技厅重点研究与开发计划项目（1804h08020236）;安徽省高校自然科学研究项目（KJ2018A0206）;安徽医科大学第二附属医院首批“火花计划”科研项目（2015hhjh06）
参考文献：
[1]Sow FB，Florence WC，Satoskar AR，Schlesinger LS，Zwilling BS，Lafuse WP. Expression and localization of hepcidin in macrophages：a role in host defense against tuberculosis. Journal of LeukocyteBiology. 2007;82（4）：934–45.
[2]Peyssonnaux C，Zinkernagel AS，Datta V，Lauth X，Johnson RS，Nizet V. TLR4-dependent hepcidin expression by myeloid cells in response to bacterial pathogens. Blood. 2006;107（9）：3727–32.
[3]Hunter HN，Fulton DB，Ganz T，Vogel HJ. The solution structure of human hepcidin，apeptide hormone with antimicrobial activity that is involved in iron uptake and hereditary hemochromatosis. Journal of Biological Chemistry. 2002;277（40）：37597–603.
[4] Lambrecht RW，Sterling RK，Naishadham D，Stoddard AM，Rogers T，Morishima C，et al. Iron levels in hepatocytes and portal tract cells predict progression and outcomes of patients with advanced chronic hepatitis C. Gastroenterology. 2011;140（5）：1490–500.
[5] Liu H，Trinh T L，Dong H，et al. Iron Regulator Hepcidin Exhibits Antiviral Activity against Hepatitis C Virus. PLoS ONE，2012，7（10）：e46631.
作者簡介：
王兆飞，男，硕士研究生;单位：安徽医科大学第二附属医院 检验科，合肥230601
管世鹤，男，教授，主任技师，博士生导师，责任作者，单位：安徽医科大学第二附属医院 检验科，合肥230601，E-mail：[email protected]。