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摘要： 目的：HPLC法测定金莲花中荭草苷和牡荆苷的含量。方法：采用高效液相色谱法（HPLC） 结论：用HPLC法对金莲花中荭草苷和牡荆苷进行含量测定，方法可靠。用丙酮提取色素后的金莲花残渣中荭草苷和牡荆苷的含量与金莲花原药中的荭草苷和牡荆苷含量相比无明显变化。
关键词： 金莲花； 荭草苷； 牡荆苷； HPLC
金莲花（Trollius chinensis Bunge.）为毛茛科植物金莲花的干燥花，据记载[1]中药金莲花功能为清热解毒，现代药理研究表明金莲花具有很好的抗菌、抗病毒作用[2]。金莲花提取物中药效组分主要是荭草苷、牡荆苷等黄酮碳苷类化合物[3]。对不同提取溶剂的金莲花提取物中荭草苷和牡荆苷含量测定的比较未见报道，本研究目的在于建立HPLC测定金莲花提取物中荭草苷和牡荆苷的方法，比较不同提取溶剂中荭草苷和牡荆苷的含量。
1 仪器与试药
Agilent1100高效液相色谱仪
MP1100B型电子天平 （上海精科天平）
756MC型紫外可见分光光度计 （上海精密科学仪器有限公司）
荭草苷、牡荆苷对照品，纯度≥98%（天津一方科技有限公司 ）
槲皮素对照品，纯度≥97.3%（中国药品生物制品检定所）
金莲花采自张家口市坝上地区
甲醇、乙腈为色谱纯，其他试剂为分析纯。
2 方法
2.1 最大吸收波长的确定
用甲醇配制荭草苷和牡荆苷溶液，在190～450 nm处进行紫外扫描， 可得到荭草苷和牡荆苷的紫外-可见吸收光谱。
2.2 色谱条件
色谱柱：Hypersil BDS C18（4.6mm×200mm，5 μm），流动相：乙腈-1%醋酸溶液（15︰85），流速：1.0 mL˙min-1，检测波长：340 nm，柱温：25℃，进样量：20 μL。
2.3 对照品溶液的制备
称取荭草苷对照品4.33 mg和牡荆苷对照品2.83 mg，分别置于5 mL的容量瓶中，加入甲醇使之溶解，定容至刻度，过0.45 μm的微孔滤膜，即得。（荭草苷含量0.867 mg·mL-1，牡荆苷含量0.567 mg·mL-1）。
2.4供试品溶液的制备
精密称定清洗并干燥粉碎的金莲花两份各0.1 g，置于250 mL具塞锥形瓶中，用移液管分别加入甲醇或水50 mL，称重，浸泡30 min，超声处理60 min，取出放冷。用甲醇补足损失的重量，摇匀，取上清液用0.45 μm微孔滤膜过滤。同样，取丙酮提取色素后的金莲花残渣两份各0.1 g，分别以甲醇和水作为溶剂，按上述方法制备，得4份供试品溶液。
3 结 果
3.1 最大吸收波长的选择
荭草苷在260，343 nm处有两个吸收峰，牡荆苷在270，338 nm处有两个吸收峰，为减少干扰峰，选择340 nm作为最佳检测波长。
3.2 标准工作曲线
取荭草苷对照品溶液和牡荆苷对照品溶液各100 μL，混匀，即得荭草苷含量为433.333 μg·mL-1，牡荆苷含量为283.333 μg·mL-1的标准溶液，用甲醇倍比稀释得2、4、8、16、32倍稀释的溶液，得荭草苷、牡荆苷含量分别为433.333，278.333 μg·mL-1；216.667，141.667 μg·mL-1；108.333，70.833 μg·mL-1；54.167，35.417 μg·mL-1；27.083，17.708 μg·mL-1；13.542，8.854 μg·mL-16份标准溶液。分别进样20 μL测定，以峰面积为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线，回归方程为：
荭草苷：Y1=32.4675X1-2.2207，r=0.9999
牡荆苷：Y2=29.6640X2-59.2597，r=0.9997
表明均有良好的线性关系。
3.3 精密度试验
取同一份供试品溶液，重复进样5次，测定荭草苷和牡荆苷峰面积，结果为荭草苷的RSD=0.64%，牡荆苷的RSD=0.90%。
3.4 重复性试验
取粉碎后金莲花5份，按照2.4项下方法制备5份供试品溶液，测定荭草苷和牡荆苷的峰面积，结果为荭草苷的RSD=2.1%，牡荆苷的RSD=2.2%.
3.5回收率试验
取同一份金莲花供试品溶液，置三个锥形瓶中，分别精密加入荭草苷标准品4.3275 mg，0.4956 mg，0.1415 mg，牡荆苷标准品2.8323 mg，0.3426 mg，0.0947 mg，按供试品溶液制备方法制备。取20 μL进样，测定并计算结果见表1。
表1 金莲花中荭草苷和牡荆苷回收率试验结果
样品含量/mg 加入样品量/mg 测得量/mg 回收率 % 平均值 % RSD %
荭草苷 牡荆苷 荭草苷 牡荆苷 荭草苷 牡荆苷 荭草苷 牡荆苷 荭草苷 牡荆苷 荭草苷 牡荆苷
0.3676
0.3676
0.3676 0.1408
0.1408
0.1408 4.3275
0.4956
0.1415 2.8323
0.3426
0.0947 4.6464
0.8960
0.5152 2.9410
0.4914
0.2366 98.96
103.8
101.2 98.92
101.64
100.4 101.32 100.32 2.4 1.4
3.6样品的含量测定：取上述4份供试品溶液，各取20 μL进样，测定并计算结果见表2
表2样品的测定结果
提取溶剂 荭草苷 牡荆苷
金莲花
金莲花
提取色素后金莲花
提取色素后金莲花 甲醇
水
甲醇
水 1.32%
2.06%
1.45%
2.04% 0.809%
1.108%
0.608%
1.004%
4 讨 论
4.1 分别用甲醇和水作为溶剂，测得水提液中荭草苷和牡荆苷的含量较高，但产生的杂峰较多，验证了水提效率高的结果。
4.2 用HPLC法测定金莲花中荭草苷和牡荆苷的含量，色谱峰分离完全，该方法操作简便，结果准确，可用于金莲花药材的质量监测，为进一步开发金莲花资源奠定了基础。
参考文献
[1] 江苏新医学院编. 中药大辞典（上册）[M]. 上海：上海人民出版社，1977：1398-1399.
[2] Lin Q F，Feng S Q，Li Y L，etal. Study on the antibacterial and antiviral activity compositions of Trollius chinensis Bunge[J]. J zhejiang Univ： Sci （浙江大学：科学版），2004，31（4）：412-415.
[3] 杨雅信，张贵君. 金莲花70%乙醇浸液中黄酮碳苷类成分的研究[J].黑龙江医药，2006，19（2）：93-94.
关键词： 金莲花； 荭草苷； 牡荆苷； HPLC
金莲花（Trollius chinensis Bunge.）为毛茛科植物金莲花的干燥花，据记载[1]中药金莲花功能为清热解毒，现代药理研究表明金莲花具有很好的抗菌、抗病毒作用[2]。金莲花提取物中药效组分主要是荭草苷、牡荆苷等黄酮碳苷类化合物[3]。对不同提取溶剂的金莲花提取物中荭草苷和牡荆苷含量测定的比较未见报道，本研究目的在于建立HPLC测定金莲花提取物中荭草苷和牡荆苷的方法，比较不同提取溶剂中荭草苷和牡荆苷的含量。
1 仪器与试药
Agilent1100高效液相色谱仪
MP1100B型电子天平 （上海精科天平）
756MC型紫外可见分光光度计 （上海精密科学仪器有限公司）
荭草苷、牡荆苷对照品，纯度≥98%（天津一方科技有限公司 ）
槲皮素对照品，纯度≥97.3%（中国药品生物制品检定所）
金莲花采自张家口市坝上地区
甲醇、乙腈为色谱纯，其他试剂为分析纯。
2 方法
2.1 最大吸收波长的确定
用甲醇配制荭草苷和牡荆苷溶液，在190～450 nm处进行紫外扫描， 可得到荭草苷和牡荆苷的紫外-可见吸收光谱。
2.2 色谱条件
色谱柱：Hypersil BDS C18（4.6mm×200mm，5 μm），流动相：乙腈-1%醋酸溶液（15︰85），流速：1.0 mL˙min-1，检测波长：340 nm，柱温：25℃，进样量：20 μL。
2.3 对照品溶液的制备
称取荭草苷对照品4.33 mg和牡荆苷对照品2.83 mg，分别置于5 mL的容量瓶中，加入甲醇使之溶解，定容至刻度，过0.45 μm的微孔滤膜，即得。（荭草苷含量0.867 mg·mL-1，牡荆苷含量0.567 mg·mL-1）。
2.4供试品溶液的制备
精密称定清洗并干燥粉碎的金莲花两份各0.1 g，置于250 mL具塞锥形瓶中，用移液管分别加入甲醇或水50 mL，称重，浸泡30 min，超声处理60 min，取出放冷。用甲醇补足损失的重量，摇匀，取上清液用0.45 μm微孔滤膜过滤。同样，取丙酮提取色素后的金莲花残渣两份各0.1 g，分别以甲醇和水作为溶剂，按上述方法制备，得4份供试品溶液。
3 结 果
3.1 最大吸收波长的选择
荭草苷在260，343 nm处有两个吸收峰，牡荆苷在270，338 nm处有两个吸收峰，为减少干扰峰，选择340 nm作为最佳检测波长。
3.2 标准工作曲线
取荭草苷对照品溶液和牡荆苷对照品溶液各100 μL，混匀，即得荭草苷含量为433.333 μg·mL-1，牡荆苷含量为283.333 μg·mL-1的标准溶液，用甲醇倍比稀释得2、4、8、16、32倍稀释的溶液，得荭草苷、牡荆苷含量分别为433.333，278.333 μg·mL-1；216.667，141.667 μg·mL-1；108.333，70.833 μg·mL-1；54.167，35.417 μg·mL-1；27.083，17.708 μg·mL-1；13.542，8.854 μg·mL-16份标准溶液。分别进样20 μL测定，以峰面积为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线，回归方程为：
荭草苷：Y1=32.4675X1-2.2207，r=0.9999
牡荆苷：Y2=29.6640X2-59.2597，r=0.9997
表明均有良好的线性关系。
3.3 精密度试验
取同一份供试品溶液，重复进样5次，测定荭草苷和牡荆苷峰面积，结果为荭草苷的RSD=0.64%，牡荆苷的RSD=0.90%。
3.4 重复性试验
取粉碎后金莲花5份，按照2.4项下方法制备5份供试品溶液，测定荭草苷和牡荆苷的峰面积，结果为荭草苷的RSD=2.1%，牡荆苷的RSD=2.2%.
3.5回收率试验
取同一份金莲花供试品溶液，置三个锥形瓶中，分别精密加入荭草苷标准品4.3275 mg，0.4956 mg，0.1415 mg，牡荆苷标准品2.8323 mg，0.3426 mg，0.0947 mg，按供试品溶液制备方法制备。取20 μL进样，测定并计算结果见表1。
表1 金莲花中荭草苷和牡荆苷回收率试验结果
样品含量/mg 加入样品量/mg 测得量/mg 回收率 % 平均值 % RSD %
荭草苷 牡荆苷 荭草苷 牡荆苷 荭草苷 牡荆苷 荭草苷 牡荆苷 荭草苷 牡荆苷 荭草苷 牡荆苷
0.3676
0.3676
0.3676 0.1408
0.1408
0.1408 4.3275
0.4956
0.1415 2.8323
0.3426
0.0947 4.6464
0.8960
0.5152 2.9410
0.4914
0.2366 98.96
103.8
101.2 98.92
101.64
100.4 101.32 100.32 2.4 1.4
3.6样品的含量测定：取上述4份供试品溶液，各取20 μL进样，测定并计算结果见表2
表2样品的测定结果
提取溶剂 荭草苷 牡荆苷
金莲花
金莲花
提取色素后金莲花
提取色素后金莲花 甲醇
水
甲醇
水 1.32%
2.06%
1.45%
2.04% 0.809%
1.108%
0.608%
1.004%
4 讨 论
4.1 分别用甲醇和水作为溶剂，测得水提液中荭草苷和牡荆苷的含量较高，但产生的杂峰较多，验证了水提效率高的结果。
4.2 用HPLC法测定金莲花中荭草苷和牡荆苷的含量，色谱峰分离完全，该方法操作简便，结果准确，可用于金莲花药材的质量监测，为进一步开发金莲花资源奠定了基础。
参考文献
[1] 江苏新医学院编. 中药大辞典（上册）[M]. 上海：上海人民出版社，1977：1398-1399.
[2] Lin Q F，Feng S Q，Li Y L，etal. Study on the antibacterial and antiviral activity compositions of Trollius chinensis Bunge[J]. J zhejiang Univ： Sci （浙江大学：科学版），2004，31（4）：412-415.
[3] 杨雅信，张贵君. 金莲花70%乙醇浸液中黄酮碳苷类成分的研究[J].黑龙江医药，2006，19（2）：93-94.