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【摘要】目的 观察塞来昔布(Celecoxib)和阿霉素(Adriamycin，ADM)合用对人乳腺癌MCF-7细胞裸鼠移植瘤生长的抑制作用，并初步探讨其作用机制。方法 采用MCF-7细胞株建立人乳腺癌裸鼠模型，将35只成瘤雌性裸鼠随机分成7组：①对照组(生理盐水0.2ml)；②ADM低剂量组(1.0 mg/kg)；③ADM高剂量组(5mg/kg)；④塞来昔布低剂量组(25mg/kg)；⑤塞来昔布高剂量组(50mg/kg)；⑥ADM低剂量组+塞来昔布低剂量组；⑦ADM低剂量组+塞来昔布高剂量组，隔天腹腔注射给药，共8次。于最后一次给药后48h处死各组小鼠，收集瘤标本行光镜观察，免疫组化检测COX-2和VEGF蛋白表达情况。结果 ①各实验组肿瘤的生长明显受到抑制，瘤质量明显低于对照组(P<0.01)。低、高剂量塞来昔布联合用药组较低剂量阿霉素组抑瘤作用明显增强(P<0.05)，其瘤重抑制率分别为40.4%和76.8%。②免疫组化：高剂量塞来昔布组与对照组比较，COX-2和VEGF的表达均下调，差异具有显著性(P<0.05)，联合用药组该调节作用进一步增强(P=0.00)。③不良反应：高剂量阿霉素组出现不良反应，其余各组无明显不良反应。结论 塞来昔布能够增强阿霉素对人乳腺癌MCF-7细胞裸鼠移植瘤生长的抑制作用，其作用机制可能与塞来昔布抑制COX-2和VEGF的表达有关。
【关键词】乳腺癌；塞来昔布；阿霉素；裸鼠移植瘤
乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，严重危害妇女的身心健康。早期乳腺癌的治疗方法以手术切除为主，中晚期乳腺癌多已发生扩散转移，手术切除几率不大，治疗方法主要有放疗、化疗以及中医药治疗[1]。化疗是乳腺癌非手术治疗的常用方法之一，但毒性反应严重，因此，提高肿瘤细胞对化疗药的敏感性和特异性日益成为研究重点。非甾体类抗炎药NSAIDs是一类在临床上应用多年的解热、镇痛、抗炎的药物。它通过阻断前列腺素和环氧化酶2（cyclooxygenase-2，COX-2）的合成发挥作用[2]。近年来，越来越多的流行病学调查和体内外实验研究都证明，NSAIDs 具有一定的抗肿瘤作用，并日益受到关注。塞来昔布(Celecoxib)是一种新的非甾体类抗炎药，可特异性抑制COX-2的合成，研究显示，COX-2在乳腺癌等多种恶性肿瘤的发生、发展过程中起着非常重要的作用[3]。因此，本研究拟采用Balb/c裸鼠移植瘤模型，观察塞来昔布在体内联合阿霉素对乳腺癌移植瘤生长的影响并探讨其可能机制。
1 材料与方法
1.1 实验动物、细胞株、药品及试剂
Balb/c-nu雌性裸鼠40只，6周龄，体重16～18g，购于中科院上海实验动物中心，由南华大学实验动物部提供SPF级饲养环境。人乳腺癌MCF-7细胞株由本所保存提供。塞来昔布够自大连美仑生物技术有限公司。阿霉素购于西格玛奥德里奇中国公司。兔抗人COX-2、VEGF多克隆抗体，S-P试剂盒等均购于福州迈新。
1.2 动物模型的建立按每只裸鼠皮下接种细胞数2.5×107，再加入无血清RPMI-1640培养基，供裸鼠皮下接种用。准备好的MCF-7细胞悬液经台盼蓝染色活细胞数占95%以上，按每只0.2ml MCF-7细胞悬液注射于消毒后的裸鼠皮下，观察肿瘤移植成功率。
1.3 动物实验分组
以40只小鼠皮下移植肿瘤细胞成瘤，接种7d后取35只成瘤裸鼠随机均衡分成7组(每组5只)。各组别均采用隔天腹腔注射给药，共8次。末次给药后48h后脱颈臼处死裸鼠，切除移植瘤。所有动物实验均遵循中华人民共和国动物实验管理规定操作。
1.4 观察指标及方法
计算瘤重抑瘤率，瘤重抑制率（%）=[1-(实验组平均瘤重/对照组平均瘤重)]×100%。合并用药效果根据文献提供的金氏公式求出Q值进行判断：Q =Ea+b/[ Ea+ ( 1-Ea )×Eb]，Ea+b为二药合用的抑制率，Ea和Eb为各药单用的抑制率，若Q < 0.85说明二药合用有拮抗作用，若0.85< Q <1.15说明二药合用有相加作用，若Q >1.15说明二药合用有协同作用。
1.5 光镜观察及免疫组化
肿瘤标本行常规病理切片，HE染色，光镜观察。采用免疫组化SP法检测，操作步骤按照试剂盒说明书进行，用PBS缓冲液代替一抗作阴性对照。免疫组化的判定标准：COX-2蛋白以癌细胞胞浆显棕黄色颗粒，间质清晰，无背景着色，同时阳性细胞要在5％以上，才能定为阳性。高倍镜下计数100个细胞，呈棕黄色颗粒的阳性细胞< l0%为阴性，≥10%阳性。VEGF以胞质及核膜着色，结果判断同COX-2。应用Image Pro专业图像分析软件对免疫组化结果进行定量分析，测出阳性细胞的积分光密度(integrated optical density，IOD)，积分光密度是阳性细胞的平均光密度和其面积的乘积，可以反映蛋白表达量(IOD值越高，表明蛋白含量越高)。
1.6统计学处理
计量资料数据采用采用SPSS 13.0，单因素方差分析(One-way ANOVA)进行样本均数间多重比较。
2结果
2.1 裸鼠体内成瘤情况
自接种后5天，可见接种部位小结节，约5mm×5mm大小，随后结节逐渐增大，至第10天，约7mm×7mm大小。40只裸鼠中37只成瘤，成瘤率达92.5%。
2.2移植瘤组织的病理形态学观察
大体观瘤块有侵犯皮肤并伴溃疡坏死，质地硬度中等，切面呈灰白色。光镜下可见癌组织内实质多，间质少，其间可见腺管、腺腔样结构；癌细胞大，胞浆丰富，核大，核仁清晰，细胞大小不等，病理诊断为浸润性导管癌。
2.3各组药物对裸鼠皮下移植瘤生长的影响
实验结束后，各用药组瘤质量及瘤体积明显低于对照组(P<0.01)，ADM低剂量+塞来昔布低剂量组和ADM低剂量组+塞来昔布高剂量组抑瘤作用进一步增强，抑瘤率分别为40.4%，76.8%，Q值分别为0.913和1.415。结果见表一。
表一 各组瘤重及瘤重抑制率
**P < 0.01 vs control group (NS) ; # P < 0.05 vs low-dose ADM group
2.5塞来昔布、阿霉素对肿瘤细胞COX-2、VEGF表达的影响
免疫组织化学检测发现：塞来昔布单独组与对照组比较，COX-2和VEGF表达均减小，与阴性对照组比较差异有显著性(P<0.05)，联合用药组进一步增强(P<0.01，见Fig1)。
图一 免疫组织化学法检测COX-2和VEGF的表达(S-P ×200)
3 讨论
环氧化酶（COX）是催化花生四烯酸转化为重要活性物质前列腺素的关键限速酶,存在三种蛋白型:COX-1,COX-2和COX-3[4]。COX-1在大多数细胞中持续表达，促使生理性PGs的合成，与炎症及肿瘤的发生关系不明显。COX-3是COX-1的剪接变体。而COX-2是一种诱导型酶，在静息细胞内检测不到，只有当细胞接受生长因子、细胞因子、激素、炎症因子、促癌剂等因素的刺激后才开始合成，得到高水平的表达[5]。研究发现, COX-2 在肿瘤的发生发展过程中起着重要作用, COX-2在多种肿瘤细胞中表达增强。研究发现，肿瘤临床分期、肿瘤大小、淋巴结转移数目与COX-2表达相关[6]。
乳腺癌尤其是中晚期乳腺癌不适宜手术治疗，寻找有效的化疗联用治疗方案是乳腺癌治疗亟需解决的问题。阿霉素是乳腺癌联合化疗方案中最常用的药物，然而阿霉素的毒副作用和耐药性是化疗方案发挥作用的主要障碍[7]。塞来昔布是选择性COX-2抑制剂的一种，研究发现它能阻滞肿瘤细胞周期从而抑制增殖、诱导细胞凋亡、抑制肿瘤新血管生成。因此本实验研究主要观察阿霉素联合塞来昔布对乳腺癌移植瘤的作用，结果显示：各实验组对移植瘤肿瘤细胞的生长有一定的抑制作用，而联合用药组抑瘤作用明显增强(P<0.01)。联合用药⑦组Q值大于1.15，说明两药物联合应用有确切增效作用。而联合用药⑥组Q值等于0.913，说明二药合用有相加作用，这表明两者联合应用的效果跟塞来昔布的剂量有关，这对指导临床用药有一定的参考价值。本实验过程中，观察到高剂量单用阿霉素组有不良反应，与大剂量阿霉素的毒副作用相关，这也与临床上应用阿霉素毒副作用大、病人难以耐受相吻合。而其余组裸鼠均未出现明显不良反应，表明两药物联合应用，并未增加其毒副作用。
免疫组化结果显示，塞来昔布联合阿霉素处理后，COX-2蛋白明显降低。而COX-2能诱导VEGF和bFGF等多种促血管生成因子的表达。VEGF是作用极强的促血管生成因子之一，是促进肿瘤生长、侵袭转移的重要因子。本实验结果显示塞来昔布联合阿霉素能显著降低VEGF蛋白的表达，抑制VEGF的表达同样能增强MCF-7细胞对阿霉素的敏感性，抑制MCF-7细胞的增殖并诱导其凋亡。同时，COX-2也能够通过调节VEGF的表达来影响肿瘤细胞对化疗药物的敏感性。
本研究证实了塞来昔布对人乳腺癌细胞株MCF-7裸鼠移植瘤模型有显著的化疗增敏作用，其机制可能是塞来昔布通过多种途径下调COX-2与VEGF的表达，促进肿瘤细胞发生凋亡，即增强了肿瘤细胞对阿霉素的敏感性，提示塞来昔布有望成为一种乳腺癌治疗的化疗增敏剂，但其在肿瘤中的作用及对化疗药物的增敏机制有待于进一步探讨。
参考文献
[1]Burstein HJ. Novel agents and future directions for refractory breast cancer. Semin Oncol. 2011. 38 Suppl 2: S17-24.
[2]Aid S, Bosetti F. Targeting cyclooxygenases-1 and -2 in neuroinflammation: Therapeutic implications. Biochimie. 2011. 93(1): 46-51.
[3]El-Sayed M, Taha MM. Immunohistochemical expression of cycloxygenase-2 in astrocytoma: correlation with angiogenesis, tumor progression and survival. Turk Neurosurg. 2011. 21(1): 27-35.
[4]Dubois RN, Abramson SB, Crofford L, et al. Cyclooxygenase in biology and disease. FASEB J. 1998. 12(12): 1063-73.
[5]Dore M. Cyclooxygenase-2 expression in animal cancers. Vet Pathol. 2011. 48(1): 254-65.
[6]Rizzo MT. Cyclooxygenase-2 in oncogenesis. Clin Chim Acta. 2011. 412(9-10): 671-87.
[7]Ogura M. Adriamycin (doxorubicin). Gan To Kagaku Ryoho. 2001. 28(10): 1331-8.
湖南省卫生厅科研项目资助
基金资助号码是：湖南省卫生厅B2006-118
【关键词】乳腺癌；塞来昔布；阿霉素；裸鼠移植瘤
乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，严重危害妇女的身心健康。早期乳腺癌的治疗方法以手术切除为主，中晚期乳腺癌多已发生扩散转移，手术切除几率不大，治疗方法主要有放疗、化疗以及中医药治疗[1]。化疗是乳腺癌非手术治疗的常用方法之一，但毒性反应严重，因此，提高肿瘤细胞对化疗药的敏感性和特异性日益成为研究重点。非甾体类抗炎药NSAIDs是一类在临床上应用多年的解热、镇痛、抗炎的药物。它通过阻断前列腺素和环氧化酶2（cyclooxygenase-2，COX-2）的合成发挥作用[2]。近年来，越来越多的流行病学调查和体内外实验研究都证明，NSAIDs 具有一定的抗肿瘤作用，并日益受到关注。塞来昔布(Celecoxib)是一种新的非甾体类抗炎药，可特异性抑制COX-2的合成，研究显示，COX-2在乳腺癌等多种恶性肿瘤的发生、发展过程中起着非常重要的作用[3]。因此，本研究拟采用Balb/c裸鼠移植瘤模型，观察塞来昔布在体内联合阿霉素对乳腺癌移植瘤生长的影响并探讨其可能机制。
1 材料与方法
1.1 实验动物、细胞株、药品及试剂
Balb/c-nu雌性裸鼠40只，6周龄，体重16～18g，购于中科院上海实验动物中心，由南华大学实验动物部提供SPF级饲养环境。人乳腺癌MCF-7细胞株由本所保存提供。塞来昔布够自大连美仑生物技术有限公司。阿霉素购于西格玛奥德里奇中国公司。兔抗人COX-2、VEGF多克隆抗体，S-P试剂盒等均购于福州迈新。
1.2 动物模型的建立按每只裸鼠皮下接种细胞数2.5×107，再加入无血清RPMI-1640培养基，供裸鼠皮下接种用。准备好的MCF-7细胞悬液经台盼蓝染色活细胞数占95%以上，按每只0.2ml MCF-7细胞悬液注射于消毒后的裸鼠皮下，观察肿瘤移植成功率。
1.3 动物实验分组
以40只小鼠皮下移植肿瘤细胞成瘤，接种7d后取35只成瘤裸鼠随机均衡分成7组(每组5只)。各组别均采用隔天腹腔注射给药，共8次。末次给药后48h后脱颈臼处死裸鼠，切除移植瘤。所有动物实验均遵循中华人民共和国动物实验管理规定操作。
1.4 观察指标及方法
计算瘤重抑瘤率，瘤重抑制率（%）=[1-(实验组平均瘤重/对照组平均瘤重)]×100%。合并用药效果根据文献提供的金氏公式求出Q值进行判断：Q =Ea+b/[ Ea+ ( 1-Ea )×Eb]，Ea+b为二药合用的抑制率，Ea和Eb为各药单用的抑制率，若Q < 0.85说明二药合用有拮抗作用，若0.85< Q <1.15说明二药合用有相加作用，若Q >1.15说明二药合用有协同作用。
1.5 光镜观察及免疫组化
肿瘤标本行常规病理切片，HE染色，光镜观察。采用免疫组化SP法检测，操作步骤按照试剂盒说明书进行，用PBS缓冲液代替一抗作阴性对照。免疫组化的判定标准：COX-2蛋白以癌细胞胞浆显棕黄色颗粒，间质清晰，无背景着色，同时阳性细胞要在5％以上，才能定为阳性。高倍镜下计数100个细胞，呈棕黄色颗粒的阳性细胞< l0%为阴性，≥10%阳性。VEGF以胞质及核膜着色，结果判断同COX-2。应用Image Pro专业图像分析软件对免疫组化结果进行定量分析，测出阳性细胞的积分光密度(integrated optical density，IOD)，积分光密度是阳性细胞的平均光密度和其面积的乘积，可以反映蛋白表达量(IOD值越高，表明蛋白含量越高)。
1.6统计学处理
计量资料数据采用采用SPSS 13.0，单因素方差分析(One-way ANOVA)进行样本均数间多重比较。
2结果
2.1 裸鼠体内成瘤情况
自接种后5天，可见接种部位小结节，约5mm×5mm大小，随后结节逐渐增大，至第10天，约7mm×7mm大小。40只裸鼠中37只成瘤，成瘤率达92.5%。
2.2移植瘤组织的病理形态学观察
大体观瘤块有侵犯皮肤并伴溃疡坏死，质地硬度中等，切面呈灰白色。光镜下可见癌组织内实质多，间质少，其间可见腺管、腺腔样结构；癌细胞大，胞浆丰富，核大，核仁清晰，细胞大小不等，病理诊断为浸润性导管癌。
2.3各组药物对裸鼠皮下移植瘤生长的影响
实验结束后，各用药组瘤质量及瘤体积明显低于对照组(P<0.01)，ADM低剂量+塞来昔布低剂量组和ADM低剂量组+塞来昔布高剂量组抑瘤作用进一步增强，抑瘤率分别为40.4%，76.8%，Q值分别为0.913和1.415。结果见表一。
表一 各组瘤重及瘤重抑制率
**P < 0.01 vs control group (NS) ; # P < 0.05 vs low-dose ADM group
2.5塞来昔布、阿霉素对肿瘤细胞COX-2、VEGF表达的影响
免疫组织化学检测发现：塞来昔布单独组与对照组比较，COX-2和VEGF表达均减小，与阴性对照组比较差异有显著性(P<0.05)，联合用药组进一步增强(P<0.01，见Fig1)。
图一 免疫组织化学法检测COX-2和VEGF的表达(S-P ×200)
3 讨论
环氧化酶（COX）是催化花生四烯酸转化为重要活性物质前列腺素的关键限速酶,存在三种蛋白型:COX-1,COX-2和COX-3[4]。COX-1在大多数细胞中持续表达，促使生理性PGs的合成，与炎症及肿瘤的发生关系不明显。COX-3是COX-1的剪接变体。而COX-2是一种诱导型酶，在静息细胞内检测不到，只有当细胞接受生长因子、细胞因子、激素、炎症因子、促癌剂等因素的刺激后才开始合成，得到高水平的表达[5]。研究发现, COX-2 在肿瘤的发生发展过程中起着重要作用, COX-2在多种肿瘤细胞中表达增强。研究发现，肿瘤临床分期、肿瘤大小、淋巴结转移数目与COX-2表达相关[6]。
乳腺癌尤其是中晚期乳腺癌不适宜手术治疗，寻找有效的化疗联用治疗方案是乳腺癌治疗亟需解决的问题。阿霉素是乳腺癌联合化疗方案中最常用的药物，然而阿霉素的毒副作用和耐药性是化疗方案发挥作用的主要障碍[7]。塞来昔布是选择性COX-2抑制剂的一种，研究发现它能阻滞肿瘤细胞周期从而抑制增殖、诱导细胞凋亡、抑制肿瘤新血管生成。因此本实验研究主要观察阿霉素联合塞来昔布对乳腺癌移植瘤的作用，结果显示：各实验组对移植瘤肿瘤细胞的生长有一定的抑制作用，而联合用药组抑瘤作用明显增强(P<0.01)。联合用药⑦组Q值大于1.15，说明两药物联合应用有确切增效作用。而联合用药⑥组Q值等于0.913，说明二药合用有相加作用，这表明两者联合应用的效果跟塞来昔布的剂量有关，这对指导临床用药有一定的参考价值。本实验过程中，观察到高剂量单用阿霉素组有不良反应，与大剂量阿霉素的毒副作用相关，这也与临床上应用阿霉素毒副作用大、病人难以耐受相吻合。而其余组裸鼠均未出现明显不良反应，表明两药物联合应用，并未增加其毒副作用。
免疫组化结果显示，塞来昔布联合阿霉素处理后，COX-2蛋白明显降低。而COX-2能诱导VEGF和bFGF等多种促血管生成因子的表达。VEGF是作用极强的促血管生成因子之一，是促进肿瘤生长、侵袭转移的重要因子。本实验结果显示塞来昔布联合阿霉素能显著降低VEGF蛋白的表达，抑制VEGF的表达同样能增强MCF-7细胞对阿霉素的敏感性，抑制MCF-7细胞的增殖并诱导其凋亡。同时，COX-2也能够通过调节VEGF的表达来影响肿瘤细胞对化疗药物的敏感性。
本研究证实了塞来昔布对人乳腺癌细胞株MCF-7裸鼠移植瘤模型有显著的化疗增敏作用，其机制可能是塞来昔布通过多种途径下调COX-2与VEGF的表达，促进肿瘤细胞发生凋亡，即增强了肿瘤细胞对阿霉素的敏感性，提示塞来昔布有望成为一种乳腺癌治疗的化疗增敏剂，但其在肿瘤中的作用及对化疗药物的增敏机制有待于进一步探讨。
参考文献
[1]Burstein HJ. Novel agents and future directions for refractory breast cancer. Semin Oncol. 2011. 38 Suppl 2: S17-24.
[2]Aid S, Bosetti F. Targeting cyclooxygenases-1 and -2 in neuroinflammation: Therapeutic implications. Biochimie. 2011. 93(1): 46-51.
[3]El-Sayed M, Taha MM. Immunohistochemical expression of cycloxygenase-2 in astrocytoma: correlation with angiogenesis, tumor progression and survival. Turk Neurosurg. 2011. 21(1): 27-35.
[4]Dubois RN, Abramson SB, Crofford L, et al. Cyclooxygenase in biology and disease. FASEB J. 1998. 12(12): 1063-73.
[5]Dore M. Cyclooxygenase-2 expression in animal cancers. Vet Pathol. 2011. 48(1): 254-65.
[6]Rizzo MT. Cyclooxygenase-2 in oncogenesis. Clin Chim Acta. 2011. 412(9-10): 671-87.
[7]Ogura M. Adriamycin (doxorubicin). Gan To Kagaku Ryoho. 2001. 28(10): 1331-8.
湖南省卫生厅科研项目资助
基金资助号码是：湖南省卫生厅B2006-118