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【摘要】 目的 观察N-甲基-D-天门冬氨酸（NMDA）受体2B亚型选择性拮抗剂Ro 25-6981对胫骨癌痛大鼠脊髓后角NR2B受体及JAK/SATA3通路的影响。方法 采用Walker256乳腺癌细胞建立雄性SD大鼠胫骨癌痛模型。将大鼠随机分为3组（n=8）：假手术组（sham）、模型组（Model）、Ro 25-6981预先给药组（R）。鞘内注射后，观察Ro 25-6981对大鼠脊髓背角NR2B表达，STAT3的表达及痛阈的影响。结果 与sham组比较，M组术后7，14d时机械痛阈降低（P<0.05），R组术后7，14d时差异无统计学意义（P>0.05）；与M组比较，R组术后7，14d时机械痛阈升高（P<0.05）。与sham组相比，R组和模型组术后7，14d时脊髓背角STAT3及NR2B蛋白表达均升高（P<0.05）；与模型组比较，Ro 25-6981组术后7，14d时脊髓背角STAT3及NR2B蛋白表达降低（P<0.05）。结论 大鼠鞘内预先注射Ro 25-6981，通过特异性地拮抗含NB2B亚基NMDA受体，并抑制JAK/STAT3通路产生明显的镇痛作用，可有效地预防和治疗胫骨癌性疼痛。
【关键词】 癌性疼痛；NR2B拮抗剂；STAT3
骨癌痛引起的伤害感受不同于炎性痛和神经病理性痛引起的伤害感受，存在不同的外周机制[1]。有证据表明激活的神经胶质细胞（小胶质细胞和星形胶质细胞）参与慢性病理性疼痛的发生和维持。Taga等[2]研究认为，星形胶质细胞的活化很大程度上依赖于IL-6家族细胞因子介导的STAT3激活。越来越多的实验证实NR2B在慢性疼痛的发生及发展中起到重要的作用[3-4]。其酪氨酸磷酸化不仅调节NMDA受体通道的活性，而且还通过NMDA受体SH2位点调节细胞内信号转导[5]。
本研究旨在探讨另一种NMDA受体2B亚型高选择性拮抗剂Ro25_6981对骨癌痛大鼠脊髓背角JAK2/STAT3信号通路的影响，探讨其在骨癌痛的发生、维持及和发展中的作用机制。
1 资料与方法
1.1 实验动物 雌性SD大鼠24只，体重150-200g。由苏州大学医学院实验动物中心提供。药品Ro 25-6981及抗体NR2B，STAT3均購自美国Santa Cruz 公司，免疫组化试剂盒由北京中山生物技术有限公司提供。
1.2 实验分组与操作
1.2.1 实验分组 Sham组（n=8）：大鼠行鞘内置管选择无置管并发症的个体。M组（n=8）：建立大鼠骨癌痛模型并行鞘内置管，选择无置管并发症的个体。R组Ro25_6981预先给药组（n=8）：操作同模型组，并于建立大鼠骨癌痛模型前30min及术后1-3d连续IT Ro25-6981 20μl（5μg/μl）。
1.2.2 鞘内置管法 将PE-10微导管经切开的椎间隙置入脊髓蛛网膜下腔1.5-2cm，使导管头端位于腰膨大附近。以下情况者剔除：①下肢跛行、瘫痪、感染、活动异常、导管脱落者；②实验后蛛网膜下腔注入2%利多卡因10μl，不立即出现后肢瘫痪者。
1.2.3 模型制备 将大鼠经腹腔注射3%戊巴比妥钠麻醉后，腹部朝上，左侧后肢剪毛，消毒，切开约1cm小口，小心暴露胫骨上段，先打孔，然后换用5μl微量注射器向骨髓腔缓慢注入4μl含4×104个Walker-256癌细胞的细胞悬液，迅速用骨蜡封孔缝合；假手术组动物注入等体积的生理盐水，其余操作同模型组。给药组于模型制备前30分钟鞘内注射Ro25-6981 20μl（5μg/μl）。
1.3 模型行为学评价 分别于手术前及手术后第1、3、7、14天用大鼠足趾加压法测量机械刺激痛阈。
机械痛阈：用持续上升的金属针直接刺激大鼠双后肢足底，最大压力为50.0g/s，记录大鼠后肢收缩时的压力阈值（PWPT），每次刺激间隔5min，取三次平均值。
1.4 检测指标
1.4.1 脊髓背角NR2B亚基蛋白表达的测定 三组于术后14d测定痛阈后取左侧L4-6脊髓背角组织，立即置于液氮中，最后转移至-80℃冰箱内保存。采用Western-blot法测定脊髓背角NR2B亚基蛋白表达。
1.4.2 STAT3表达的测定 免疫细胞组织化学染色法。各组大鼠在第14天测痛后行常规灌注固定之后摘取L4-6段脊髓，行20μm厚水平连续冰冻切片。经STAT3免疫细胞化学染色吸光度测定。每张切片平均选取4个视野进行分析，并以无阳性产物处吸光度为背景值以获得校正吸光度值（correct optic density，CA）。
1.4.3 脊髓中IL-6含量的变化 三组于术后14d测定痛阈后取左侧L4-6脊髓组织，根据IL-6ELISA检测试剂盒说明书进行操作，求出各组浓度值。
1.5 统计学处理 用SPSSl7.0统计软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差（χ±s）表示，组间比较采用单因素方差分析（X2），P<0.05为差异具有统计学意义。
2 结 果
2.1 给药组与模型组比较 NR2B蛋白表达降低（图1）。
2.2 行为学改变 三组机械痛阈的比较（图2）。
2.3 给药组与模型组比较IL-6表达下调（图3）。
2.4 免疫组化染色 各组大鼠腰脊髓背角STAT3表达的光密度值（图4）。R组，M组比Sham组增加，差异有统计学意义（P<0.05），R组比M组降低，差异有统计学意义（P<0.05）。
3 讨 论
Ro 25-6981是一种新型的、高选择性的NR2B拮抗剂，与传统的NR2B拮抗剂相比，不仅它与NR2B的亲和力更高，而且其选择性也更强[6-7]。脊髓背角是外周信息传入的初级整合中枢，蛛网膜下腔插管鞘内给药的方式，可保证Ro 25-6981主要是通过拮抗脊髓水平的NR2B而发挥其镇痛作用的。 JAK2-STAT3通路是许多细胞因子及多种炎症介质的重要信号交汇（cross talk）和调控系统之一。骨癌痛模型大鼠脊髓背角GFAP表達增加[8]，免疫荧光组化双标显示患侧脊髓STAT3与星形胶质细胞标志物GFAP有共表达，表明脊髓星形胶质细胞可能通过JAK2/STAT3信号通路参与骨癌痛的发生和发展。Taga等[2]研究认为，由于在星形胶质细胞标志物GFAP的基因启动子区存在着STAT3结合元件，星形胶质细胞的活化很大程度上依赖于IL-6家族细胞因子介导的STAT3激活。由于STAT3能被多个gpl30相关的细胞因子（如IL-6，IL-1等）激活[9-10]，而阻断IL-6的表达能有效缓解疼痛[11]，表明IL-6/JAK/STAT3通路在骨癌痛的发生发展中起到了重要作用。
本研究结果显示应用Ro 25-6981后大鼠在肿瘤负荷侧腰段脊髓背角浅层可见STAT3免疫反应吸光度值降低。正常情况下脊髓神经细胞胞浆内也含有一定水平的STAT3，多处于非活性状态。骨癌痛敏产生后，STAT3的表达显著上调，核转位现象增多，表明有STAT3的激活，提示脊髓星形胶质细胞可能通过JAK2/STAT3信号通路参与骨癌痛的发生和发展。
近年已将NMDAR拮抗药用于缓解癌痛。预先阻断NR2B受体能有效减轻神经病理性疼痛[12]。本实验中预先给与Ro 25-6981在大鼠骨癌痛模型上产生明显的镇痛作用，其机制可能是预先阻断脊髓背角的NMDA受体，使其在伤害性刺激传入及损伤初期不能与相应的配体结合，因而胶质细胞不能被激活，对伤害性刺激导致的癌性疼痛产生预防作用。
参考文献
[1] Leem JW，Hwang JH，Hwang SJ，et al.The Role of Peripheral N-Methyl-D-Aspartate Receptors in Freund’s Complete Adjuvant-Induced Mechnical Hyperalgesia in Rats[J].Neurosci.Lett，2001，297：155-158.
[2] Taga T，Fukuda S.Role of IL-6 in the neural stem cell differentiation[J].Clin Rev Allergy Immunol，2005，28：249-256.
[3] Hu，J，Wang Z，Guo YY，et al，A role of periaqueductal grey NR2B-containing NMDA receptor in mediating persistent inflammatory pain[J].Mol.Pain 2009，12：71.
[4] Qu XX，Cai J，Li MJ et al.Role of the spinal cord NR2B-containing NMDA receptors in the development of neuropathic pain.Experimental Neurology，2009：215.
[5] Moon IS.Relative extent of tyrosine phosphorylation of the NR2A and NR2B subunits in the rat forebrain postsynaptic density fraction[J].Mol Cells，2003，16：28-33.
[6] Kim Y，Cho HY，Ahn YJ，et al.Effect of NMDA NR2B antagonist on neuropathic pain in two spinal cord injury models [J].Pain，2012，153：1022-1029.
[7] Wang W，Mei XP，Wei YY，at al.Neuronal NR2B-containing NMDA receptor mediates spinal astrocytic c-Jun N-terminal kinase activation in a rat model of neuropathic pain[J].Brain Behav Immun，2011，25：1355-1366.
[8] Medhurst SJ，Walker K，Bowes M，et a1.A rat model of bone cancerpain[J].Pain，2002，96：129-140.
[9] Heinrich PC，Behrmann I，Mtaller-Newen G，et a1.1nterleukin-6-type cytokine signalling through the gpl30/Jak/STAT pathway[J].Biochem J，1998，334：297-314.
[10] Cattaneo E，Conti L，De-Fraja C.Signalling through the JAK-STAT pathway in the developing brain[J].Trends Neurosci，1999，22：365-369.
[11] Guerrero AR，Uchida K，Nakajima H，et al.Blockade of inter-leukin-6 signaling inhibits the classic pathway and promotes an alternative pathway of macrophage activation after spinal cord injury in mice [J].Neuroinflammation，2012，9：40.
[12] Véronique Morel，Monique Etienne，Anne-Sophie Wattiez，et al.Memantine，a promising drug for the prevention of neuropathic pain in rat[J].European Journal of Pharmacology，2013，721：382–390.
【关键词】 癌性疼痛；NR2B拮抗剂；STAT3
骨癌痛引起的伤害感受不同于炎性痛和神经病理性痛引起的伤害感受，存在不同的外周机制[1]。有证据表明激活的神经胶质细胞（小胶质细胞和星形胶质细胞）参与慢性病理性疼痛的发生和维持。Taga等[2]研究认为，星形胶质细胞的活化很大程度上依赖于IL-6家族细胞因子介导的STAT3激活。越来越多的实验证实NR2B在慢性疼痛的发生及发展中起到重要的作用[3-4]。其酪氨酸磷酸化不仅调节NMDA受体通道的活性，而且还通过NMDA受体SH2位点调节细胞内信号转导[5]。
本研究旨在探讨另一种NMDA受体2B亚型高选择性拮抗剂Ro25_6981对骨癌痛大鼠脊髓背角JAK2/STAT3信号通路的影响，探讨其在骨癌痛的发生、维持及和发展中的作用机制。
1 资料与方法
1.1 实验动物 雌性SD大鼠24只，体重150-200g。由苏州大学医学院实验动物中心提供。药品Ro 25-6981及抗体NR2B，STAT3均購自美国Santa Cruz 公司，免疫组化试剂盒由北京中山生物技术有限公司提供。
1.2 实验分组与操作
1.2.1 实验分组 Sham组（n=8）：大鼠行鞘内置管选择无置管并发症的个体。M组（n=8）：建立大鼠骨癌痛模型并行鞘内置管，选择无置管并发症的个体。R组Ro25_6981预先给药组（n=8）：操作同模型组，并于建立大鼠骨癌痛模型前30min及术后1-3d连续IT Ro25-6981 20μl（5μg/μl）。
1.2.2 鞘内置管法 将PE-10微导管经切开的椎间隙置入脊髓蛛网膜下腔1.5-2cm，使导管头端位于腰膨大附近。以下情况者剔除：①下肢跛行、瘫痪、感染、活动异常、导管脱落者；②实验后蛛网膜下腔注入2%利多卡因10μl，不立即出现后肢瘫痪者。
1.2.3 模型制备 将大鼠经腹腔注射3%戊巴比妥钠麻醉后，腹部朝上，左侧后肢剪毛，消毒，切开约1cm小口，小心暴露胫骨上段，先打孔，然后换用5μl微量注射器向骨髓腔缓慢注入4μl含4×104个Walker-256癌细胞的细胞悬液，迅速用骨蜡封孔缝合；假手术组动物注入等体积的生理盐水，其余操作同模型组。给药组于模型制备前30分钟鞘内注射Ro25-6981 20μl（5μg/μl）。
1.3 模型行为学评价 分别于手术前及手术后第1、3、7、14天用大鼠足趾加压法测量机械刺激痛阈。
机械痛阈：用持续上升的金属针直接刺激大鼠双后肢足底，最大压力为50.0g/s，记录大鼠后肢收缩时的压力阈值（PWPT），每次刺激间隔5min，取三次平均值。
1.4 检测指标
1.4.1 脊髓背角NR2B亚基蛋白表达的测定 三组于术后14d测定痛阈后取左侧L4-6脊髓背角组织，立即置于液氮中，最后转移至-80℃冰箱内保存。采用Western-blot法测定脊髓背角NR2B亚基蛋白表达。
1.4.2 STAT3表达的测定 免疫细胞组织化学染色法。各组大鼠在第14天测痛后行常规灌注固定之后摘取L4-6段脊髓，行20μm厚水平连续冰冻切片。经STAT3免疫细胞化学染色吸光度测定。每张切片平均选取4个视野进行分析，并以无阳性产物处吸光度为背景值以获得校正吸光度值（correct optic density，CA）。
1.4.3 脊髓中IL-6含量的变化 三组于术后14d测定痛阈后取左侧L4-6脊髓组织，根据IL-6ELISA检测试剂盒说明书进行操作，求出各组浓度值。
1.5 统计学处理 用SPSSl7.0统计软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差（χ±s）表示，组间比较采用单因素方差分析（X2），P<0.05为差异具有统计学意义。
2 结 果
2.1 给药组与模型组比较 NR2B蛋白表达降低（图1）。
2.2 行为学改变 三组机械痛阈的比较（图2）。
2.3 给药组与模型组比较IL-6表达下调（图3）。
2.4 免疫组化染色 各组大鼠腰脊髓背角STAT3表达的光密度值（图4）。R组，M组比Sham组增加，差异有统计学意义（P<0.05），R组比M组降低，差异有统计学意义（P<0.05）。
3 讨 论
Ro 25-6981是一种新型的、高选择性的NR2B拮抗剂，与传统的NR2B拮抗剂相比，不仅它与NR2B的亲和力更高，而且其选择性也更强[6-7]。脊髓背角是外周信息传入的初级整合中枢，蛛网膜下腔插管鞘内给药的方式，可保证Ro 25-6981主要是通过拮抗脊髓水平的NR2B而发挥其镇痛作用的。 JAK2-STAT3通路是许多细胞因子及多种炎症介质的重要信号交汇（cross talk）和调控系统之一。骨癌痛模型大鼠脊髓背角GFAP表達增加[8]，免疫荧光组化双标显示患侧脊髓STAT3与星形胶质细胞标志物GFAP有共表达，表明脊髓星形胶质细胞可能通过JAK2/STAT3信号通路参与骨癌痛的发生和发展。Taga等[2]研究认为，由于在星形胶质细胞标志物GFAP的基因启动子区存在着STAT3结合元件，星形胶质细胞的活化很大程度上依赖于IL-6家族细胞因子介导的STAT3激活。由于STAT3能被多个gpl30相关的细胞因子（如IL-6，IL-1等）激活[9-10]，而阻断IL-6的表达能有效缓解疼痛[11]，表明IL-6/JAK/STAT3通路在骨癌痛的发生发展中起到了重要作用。
本研究结果显示应用Ro 25-6981后大鼠在肿瘤负荷侧腰段脊髓背角浅层可见STAT3免疫反应吸光度值降低。正常情况下脊髓神经细胞胞浆内也含有一定水平的STAT3，多处于非活性状态。骨癌痛敏产生后，STAT3的表达显著上调，核转位现象增多，表明有STAT3的激活，提示脊髓星形胶质细胞可能通过JAK2/STAT3信号通路参与骨癌痛的发生和发展。
近年已将NMDAR拮抗药用于缓解癌痛。预先阻断NR2B受体能有效减轻神经病理性疼痛[12]。本实验中预先给与Ro 25-6981在大鼠骨癌痛模型上产生明显的镇痛作用，其机制可能是预先阻断脊髓背角的NMDA受体，使其在伤害性刺激传入及损伤初期不能与相应的配体结合，因而胶质细胞不能被激活，对伤害性刺激导致的癌性疼痛产生预防作用。
参考文献
[1] Leem JW，Hwang JH，Hwang SJ，et al.The Role of Peripheral N-Methyl-D-Aspartate Receptors in Freund’s Complete Adjuvant-Induced Mechnical Hyperalgesia in Rats[J].Neurosci.Lett，2001，297：155-158.
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[3] Hu，J，Wang Z，Guo YY，et al，A role of periaqueductal grey NR2B-containing NMDA receptor in mediating persistent inflammatory pain[J].Mol.Pain 2009，12：71.
[4] Qu XX，Cai J，Li MJ et al.Role of the spinal cord NR2B-containing NMDA receptors in the development of neuropathic pain.Experimental Neurology，2009：215.
[5] Moon IS.Relative extent of tyrosine phosphorylation of the NR2A and NR2B subunits in the rat forebrain postsynaptic density fraction[J].Mol Cells，2003，16：28-33.
[6] Kim Y，Cho HY，Ahn YJ，et al.Effect of NMDA NR2B antagonist on neuropathic pain in two spinal cord injury models [J].Pain，2012，153：1022-1029.
[7] Wang W，Mei XP，Wei YY，at al.Neuronal NR2B-containing NMDA receptor mediates spinal astrocytic c-Jun N-terminal kinase activation in a rat model of neuropathic pain[J].Brain Behav Immun，2011，25：1355-1366.
[8] Medhurst SJ，Walker K，Bowes M，et a1.A rat model of bone cancerpain[J].Pain，2002，96：129-140.
[9] Heinrich PC，Behrmann I，Mtaller-Newen G，et a1.1nterleukin-6-type cytokine signalling through the gpl30/Jak/STAT pathway[J].Biochem J，1998，334：297-314.
[10] Cattaneo E，Conti L，De-Fraja C.Signalling through the JAK-STAT pathway in the developing brain[J].Trends Neurosci，1999，22：365-369.
[11] Guerrero AR，Uchida K，Nakajima H，et al.Blockade of inter-leukin-6 signaling inhibits the classic pathway and promotes an alternative pathway of macrophage activation after spinal cord injury in mice [J].Neuroinflammation，2012，9：40.
[12] Véronique Morel，Monique Etienne，Anne-Sophie Wattiez，et al.Memantine，a promising drug for the prevention of neuropathic pain in rat[J].European Journal of Pharmacology，2013，721：382–390.