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［摘 要］ 目的 探讨ox_LDL受体LOX_1在ox_LDL诱导单核/巨噬细胞 凋亡中的角色和卡托普利的干预作用。方法 应用流式细胞术检测细胞 凋亡，采用免疫组织化学技术和Western Blot测定Caspase3、8、9的表达。结果 ox_LDL可诱导U937细胞的凋亡峰出现(12.773±1.413)，应用卡托普利和LOX_1的 阻断剂角叉菜胶、PIA后凋亡峰明显减少，其百分比分别为(1.02±0.166)(4.94±0.47) (2.62±0.656)，同时U937细胞在用ox_LDL培养后代表线粒体通路的Caspase9，3和代表死 亡受体通路caspases8,3表达都增加，应用卡托普利和LOX_1的阻断剂角叉菜胶、PIA后caspa se3、8、9的表达均减少。结论 ox_LDL是通过与其受体LOX_1结合发挥损 伤作用的。卡托普利可以抑制ox_LDL对U937细胞凋亡的诱导作用，从而对单核巨噬细胞起到 保护作用。
［关键词］ LOX_1；U937细胞；ox_LDL；凋亡；卡托普利
中图分类号：R363 文献标识码 ：A 文章编号：1009_816X(2007)03_0164_04
The Effect of LOX_1 on U937 Cell Apoptosis Induced by Oxidized LDL an d the Protective Effect of Captopril. QI Yan-hong, ZHENG Yang. Depart ment of Cardiology, The First Clinical Hospital of Jilin Universityf, Jilin 1300 21, China
［Abstract］ Objective To investigate the effect of LOX_1 on U93 7 cell apoptosis induced by oxidized LDL and the protective effect of Captopril. Methods U937 cells were preincubated with different LOX_1 inhib itors and captop ril for 1 hour, then incubated with ox_LDL 100ug/ml for 24 hours. The change of apoptosis and proteolytic enzymes was observed. The degree of U937 cell apoptosi s was determined by flow cytometry. The expression of caspase 3, 8 and 9 was det ected by immunohistochemistry and Western Blot. Results Incubati on U937 cell with ox_LDL can induce U937 cell apoptosis and significant upregula te the expression of caspase 3, 8 and 9. Preincubation U937 cell with LOX_1 inhi bitors PIA, carrageenan and captopril for 1 hour could significantly suppresse U 937 cell apoptosis induced by ox_LDL and restraine the increase of caspase 3,8 a nd 9 (P＜0.05). Conclusions LOX_1 played a key role on U937 cell apoptosis induced by ox_LDL. Ox_LDL/LOX_1 interaction on U937 cell can ind uce apoptosis via death receptor and mitochondria pathway. Captopril can protect U937 cell from ox_LDL induced apoptosis.
［Key words］ U937 cell; ox_LDL; LOX_1; Captopril
氧化型低密度脂蛋白(oxidized low_density lipoprotein receptor, ox _LDL)是致动脉粥样硬化(Atherosclerosis, AS)的一个重要的危险因素，实验证实ox_LDL以 时间浓度依赖诱导U937细胞的凋亡从而促进泡沫细胞的形成，促进AS的发生，发展［1 ］。血凝素样氧化低密度脂蛋白受体(lectin_like oxidized low_density lipoprotein r eceptor LOX_1)是新近发现的一种ox_LDL受体，主要存在于内皮细胞的表面，它可以中和降 解ox_LDL，进一步引发斑块内细胞凋亡、基质的降解和炎症反应等导致动脉粥样斑块破 裂和血栓形成。研究表明LOX_1在内皮细胞、平滑肌细胞、巨噬细胞表面都有表达［2］ 。并且在ox_LDL的作用下U937细胞表面LOX_1的表达明显增加［3］，本文探讨LOX_ 1与U937细胞凋亡的关系和卡托普利的干预作用。
1 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 实验仪器：二氧化碳孵箱(PKI日本)，倒置显微镜(物镜10×或20×，目镜10×)(H und D-6330Wetzlar21德国)，超净工作台(SW-CT-EFD苏州)，恒温水浴箱(H2S-H哈尔滨)，低 温台式离心机(AERMLE2383K德国)。
1.1.2 实验试剂：人骨髓系白血病细胞U937由吉林大学基础免疫教研室馈赠，低密度脂 蛋白(nLDL)和氧化低密度脂蛋白(ox_LDL)购自北京协和医院基础研究所。IMDM培养基(PH7. 2，100IU/ml青霉素、100μg/ml链霉素)(Sigma Chemical Co. USA)，10%胎牛血清，D-Hank 's液，其他试剂为国产分析纯，Caspase3、8、9单克隆抗体均购自Santa Cruz公司。其它二 抗和显色剂购自鼎国公司。LOX_1拮抗剂聚肌苷酸(Polyinosinic acid PIA)和角叉菜胶购自 Sigma公司。卡托普利纯品(中美上海施贵宝公司馈赠)。
1.2 实验方法
1.2.1 细胞培养及实验分组
用IMDM培养液和10%胎牛血清，常规方法培养U937细胞，2～3d传代，待细胞传至需要数量时 即可用于实验。实验共分六组：(1)对照组：细胞置IMDM培养基中于5%CO2、37℃、饱和湿 度 培养箱中培养。(2)LDL组(nLDL):在培养瓶中加入nLDL(100ug/ml)，其他同对照组。(3)ox_L DL组：在细胞的培养瓶中加入ox_LDL(100ug/ml)，然后在IMDM培养基中于5%CO2、37℃、 饱 和湿度培养箱中培养24小时。(4)PIA组：PIA(250ug/l)处理1小时后加入ox_LDL 100ug/ml共 同培育24小时。(5)角叉菜胶组：角叉菜胶(250ug/l)处理后ox_LDL 100ug/ml共同培育24小 时。(6)卡托普利组：卡托普利(10-5mol/L)处理1小时后加入ox_LDL 100ug/ml共同培 育24小时。
1.2.2 流式细胞术(FCM)检测凋亡：分组分瓶收集细胞(1×106个)。离心(1000r/min)5 min弃上清液，沉淀中加入2ml磷酸盐缓冲液(PBS)混匀，离心(1000r/min)5min。弃上清液， 加75%冷乙醇2ml固定，置4℃保存。染色前用PBS离心沉淀去除固定液，加入20μl RnaseA 3 7℃水浴30min，再加800μl碘化吡啶染色液混匀，4℃避光30min。上机检测。
1.2.3 免疫组织化学技术检测caspase蛋白的表达：分组收集细胞，进行免疫组织化学染 色。以PBS代替一抗作为阴性对照，以已知的阳性片作为阳性对照。上镜观察阳性细胞数。 结果判定：阳性染色为细胞浆和(或)细胞核内有浅至深棕黄色颗粒，随机选择10个高倍视野 (×400)，记数1000个细胞中所占的阳性细胞数，计算百分比。
免疫印迹法(Western Blot)检测caspase蛋白的表达：取1×106个培养U937细胞洗涤，离 心，用加样缓冲液裂解细胞，100℃水浴10min，离心(10 000r×10min)，收集上清，采用考 马斯亮兰法进行蛋白定量，制备好的蛋白样品置-80℃冰箱保存备用。用20ug蛋白/泳道上样 ， 经12%聚丙烯酰胺凝胶SDS_PAGE电泳后，电转膜至硝酸纤维膜。室温封闭3h加1：100 caspas e蛋白的抗体，再加入1：200的辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗，室温孵育1h，采用二甲基 联苯胺(DAB)显色试剂盒进行显色约2～5min，待蛋白条带显色清晰时中止反应，拍摄照片， 记录实验结果。
1.3 统计学处理
各种计量数据均以均数±标准差表示，各组数据间显著性检验采用t检验，统计学分析应用S AS(6.12)软件包。P＜0.05为有显著性差异。
2 结果
2.1 各U937细胞凋亡率
各组细胞经流式细胞仪检测DNA周期的结果发现，正常培养的细胞DNA多处于G0/G1期，凋亡 率为(0.098±0.022)%，而ox_LDL处理的细胞DNA在G0/G1期前出现了明显的“亚二倍体峰 ”，又称凋亡(AP峰)，凋亡率为(12.77±1.41)%。卡托普利组与C组相比凋亡率增加，为( 1.02±0.166)%；与ox_LDL组相比，凋亡率减少。应用LOX_1阻断剂PIA和角叉菜胶后，凋 亡率分别为(4.94±0.47)%和(2.62±0.656)%与C组相比凋亡率增加，与ox_LDL组相比凋 亡率减低，差异均具有统计学意义(P＜0.05)。
2.2 LOX_1对凋亡蛋白酶的影响和卡托普利的作用
正常状态下，细胞核为圆形，周边整齐光滑，胞质和胞核内未见有棕黄色着色，经ox_LDL处 理 24小时后细胞体积缩小、细胞核出现凹沟，有的细胞核分裂成数个小核，符合细胞凋亡的光 镜学特征，在Caspase3、8、9染色的细胞核内均可见棕黄色颗粒着色，其阳性细胞百分率与 对照组明显增多(P＜0.05)。应用药物和阻断剂后可见细胞数目增多，与ox_LDL相比Ca spase3、8、9表达明显减少(P＜0.05)，见表1。
同时应用免疫印迹法发现ox_LDL作用U937细胞24小时后caspase3、8、9的免疫印迹条带的颜 色明显加深，密度增加，其蛋白质的表达量明显增多，应用药物卡托普利和LOX_1阻断剂PIA 和角叉菜胶可见其含量明显减少(图1)。
3 讨论
大量研究证实ox_LDL在动脉粥样硬化的形成和发展中扮演重要角色，而血管细胞通过受体介 导的方式中和降解ox_LDL。1997年Sawamura等［4］证明这一功能受体为血凝素样氧 化低密度脂蛋白受体(LOX_1)，它属于II型单链跨膜蛋白，有一个短的N端胞浆亲水结构和一 个 长的C端胞外亲水结构域，中间为疏水区域，从结构上看属于C型选择素家族。LOX_1作为ox_ LDL的受体与以往的清道夫受体(如CD36)不同，它具有高度的配体特异性，可以结合、内吞 、 降解ox_LDL，但对天然低密度脂蛋白(nLDL)和乙酰化低密度脂蛋白(ac_LDL)则无作用［ 5］，表明ox_LDL与LOX_1的结合是特异的，此过程可被LOX_1阻滞剂PIA和角叉菜胶抑制［6］。正常条件下主动脉内膜和富含血管的器官如胎盘，肺，脑，肝等中都有LOX_1的 表达，在胸主动脉的动脉粥样斑块中和培养的主动脉内皮细胞，巨噬细胞，血管平滑肌细胞 也有此表达［2］。
已有研究证实ox_LDL诱导斑块内多种细胞凋亡都有LOX_1的参与。双重免疫斑点实验证实LOX _1表达与凋亡共存在［7］，其主要集中在斑块中有破裂倾向的区域。在培育的牛主 动脉平滑肌细胞［8］，ox_LDL通过使受胞外信号调控的激酶磷酸化，从而上调LOX_1 介导凋亡，LOX_1中和抗体可阻止细胞通过LOX_1对ox_LDL的摄取从而抑制ox_LDL诱导凋亡过 程，该抗体也抑制由ox_LDL引起Bax/Bcl-2的增加，因此ox_LDL通过LOX_1调节Bax/Bcl-2比 例诱导SMC 凋亡。把人脐静脉内皮细胞与抗Fas抗体激动剂CH11和低浓度ox_LDL共孵育测凋亡，发现ox_ L DL浓度依赖性上调Fas的表达，从而促进Fas介导的凋亡，LOX_1中和抗体则阻止LOX_1介导的 对ox_LDL的摄取，从而抑制凋亡。因此ox_LDL通过与LOX_1相互作用上调细胞表面Fas，调节 Fas系统介导凋亡，从而通过死亡受体途径诱导凋亡［9］。在人冠状动脉内皮细胞， Li等［6］发现与ox_LDL共孵育24小时LOX_1蛋白质和mRNA表达明显增加，而与nLDL共 同培养则无此现象，这种上调作用可被反义LOX_1抑制，但不被顺义LOX_1所抑制，PIA和角 叉菜胶也降低ox_LDL介导的凋亡。
在粥样斑块内尚存在巨噬细胞凋亡，然后坏死，使脂核不断增大，同时巨噬细胞凋亡使其对 脂质，胆固醇消除减少，促进AS的发生发展。ox_LDL可诱导巨噬细胞凋亡的发生，可诱导细 胞表面LOX_1的表达，但LOX_1与巨噬细胞凋亡的关系研究较少。研究证实在ox_LDL可时间和 浓度依赖性诱导U937细胞凋亡和LOX_1的表明［1，3］，本文应用LOX_1的化学阻断剂 PIA的角叉菜胶探讨LOX_1在这一过程中的作用，结果表明LOX_1阻断剂可使ox_LDL诱导U937 细胞凋亡百分比减少，同时凋亡蛋白酶caspase3、8、9表达均减少。在细胞凋亡中的信号通 路及通路分子中，目前认为主要通过两条信号通路发生，一条是通过Fas和Fas配体激活天冬 氨酸特异的半胱氨酸蛋白酶8(Caspase8)和3(Caspase3)的死亡受体途径，另一条是通过细胞 色素C释放进而逐步激活天冬氨酸特异的半胱氨酸蛋白酶9(Caspase9)和3(Caspase3)的线粒 体途径。本实验结果显示U937细胞通过LOX_1摄取ox_LDL进而诱导细胞凋亡，应用LOX_1阻断 剂后Caspase8，9，3的表达减少，提示ox_LDL通过与LOX_1结合后是通过上述两条信号通路 诱导U937细胞凋亡现象的发生。
肾素_血管紧张素_醛固酮和动脉粥样硬化发生和发展之间有着密切的联系［10］，有 研究证实血管紧张素(Ang)II可上调LOX_1的表达［11］，ACEI为血管紧张素转换酶抑 制剂，它可抑制AngI向AngII的转换，从而使LOX_1的表达减少。本文在培养液中预先加入AC EI类代表药物卡托普利，发现ox_LDL诱导的U937细胞的凋亡现象明显减少，免疫组织化学染 色亦证实应用卡托普利处理后细胞凋亡蛋白酶表达明显减少，表明卡托普利可抑制ox_LDL对 U937细胞的损害作用，其具体机制尚待进一步研究。
总之，ox_LDL是导致AS的重要的危险因子，ox_LDL与其受体LOX_1结合通过以caspase为代表 的两条信号通路引起U937细胞凋亡，促进AS的发生、发展，ACEI类药物卡托普利则可通过抑 制ox_LDL的上述作用，起到抗动脉粥样硬化作用，这为我们对AS的发生发展机制的研究及其 防治方法提供新的思路。
参考文献
［1］齐艳红，郑杨，王凌云.氧化低密度脂蛋白对U937细胞凋亡的影响及其机制的 研究［Ｊ］.中国心血管杂志，2005，4：255-257.
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［3］齐艳红，郑杨，曾炜炜.ox_LDL诱导U937细胞LOX_1的表达及其卡托普利的干预作用［ Ｊ］.心血管康复医学杂志，2007，16(1)：21-24.
［4］Sawamura T, Kume N, Aoyama T, et al. An endothelial receptor for oxidized l ow_density lipoprotein［Ｊ］. Nature, 1997, 386(1):73-77.
［5］Kume N, Murase T, Moriwaki H, et al. Inducible Expression of Lectin_like Ox i dized LDL Receptor_1 in Vascular Endothelial Cells［Ｊ］. Circulation Research, 1998, 83(3):322-327.
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［7］Kataoka H, Kume N, Miyamoto S, et al. Expression of Lectin_like Oxidized Lo w_Density Lipoprotein Receptor_1 in Human Atherosclerotic Lesions［Ｊ］. Circula tion, 1999, 99(24):3110-3117.
［8］Kataoka H, Kume N, Miyamoto S, et al. Oxidezed LDL modulates Bax/Bcl_2 thro ugh the lectin_like ox_LDL receptor_1 in vascular smooth muscle cells［Ｊ］. Art eriosclerosis Thrombosis & Vascular Biology, 2001, 21(6):955-960.
［9］Imanishi T, Hano T, Sawamara T, et al. Oxidixed low_density lipoprotein pot entiation of Fas_induced apoptosis through lectin_like oxidized_low density lipo protein receptor_1 in human umbilical vascular endothelial cells［Ｊ］. Circ J, 2002, 66:1060-1064.
［10］Nickenig G, Harrison DG. The AT(1)_Type angiotensin receptor in oxidative stress and atherogenesis: part1: oxidative stress and atherogenesis［Ｊ］. Circu lation, 2002, 105(3):393-396.
［11］Li D. Y, Zhang Y. C, Philips M. I, et al. Upregulation of endothelial rece ptor for oxidized low_densit lipoprotein (LOX_1) in cultured human coronary arte ry endothelial cells by angiotensin II type 1 receptor activation［Ｊ］. Circula tion Research, 1999, 84(9):1043-1049.
［关键词］ LOX_1；U937细胞；ox_LDL；凋亡；卡托普利
中图分类号：R363 文献标识码 ：A 文章编号：1009_816X(2007)03_0164_04
The Effect of LOX_1 on U937 Cell Apoptosis Induced by Oxidized LDL an d the Protective Effect of Captopril. QI Yan-hong, ZHENG Yang. Depart ment of Cardiology, The First Clinical Hospital of Jilin Universityf, Jilin 1300 21, China
［Abstract］ Objective To investigate the effect of LOX_1 on U93 7 cell apoptosis induced by oxidized LDL and the protective effect of Captopril. Methods U937 cells were preincubated with different LOX_1 inhib itors and captop ril for 1 hour, then incubated with ox_LDL 100ug/ml for 24 hours. The change of apoptosis and proteolytic enzymes was observed. The degree of U937 cell apoptosi s was determined by flow cytometry. The expression of caspase 3, 8 and 9 was det ected by immunohistochemistry and Western Blot. Results Incubati on U937 cell with ox_LDL can induce U937 cell apoptosis and significant upregula te the expression of caspase 3, 8 and 9. Preincubation U937 cell with LOX_1 inhi bitors PIA, carrageenan and captopril for 1 hour could significantly suppresse U 937 cell apoptosis induced by ox_LDL and restraine the increase of caspase 3,8 a nd 9 (P＜0.05). Conclusions LOX_1 played a key role on U937 cell apoptosis induced by ox_LDL. Ox_LDL/LOX_1 interaction on U937 cell can ind uce apoptosis via death receptor and mitochondria pathway. Captopril can protect U937 cell from ox_LDL induced apoptosis.
［Key words］ U937 cell; ox_LDL; LOX_1; Captopril
氧化型低密度脂蛋白(oxidized low_density lipoprotein receptor, ox _LDL)是致动脉粥样硬化(Atherosclerosis, AS)的一个重要的危险因素，实验证实ox_LDL以 时间浓度依赖诱导U937细胞的凋亡从而促进泡沫细胞的形成，促进AS的发生，发展［1 ］。血凝素样氧化低密度脂蛋白受体(lectin_like oxidized low_density lipoprotein r eceptor LOX_1)是新近发现的一种ox_LDL受体，主要存在于内皮细胞的表面，它可以中和降 解ox_LDL，进一步引发斑块内细胞凋亡、基质的降解和炎症反应等导致动脉粥样斑块破 裂和血栓形成。研究表明LOX_1在内皮细胞、平滑肌细胞、巨噬细胞表面都有表达［2］ 。并且在ox_LDL的作用下U937细胞表面LOX_1的表达明显增加［3］，本文探讨LOX_ 1与U937细胞凋亡的关系和卡托普利的干预作用。
1 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 实验仪器：二氧化碳孵箱(PKI日本)，倒置显微镜(物镜10×或20×，目镜10×)(H und D-6330Wetzlar21德国)，超净工作台(SW-CT-EFD苏州)，恒温水浴箱(H2S-H哈尔滨)，低 温台式离心机(AERMLE2383K德国)。
1.1.2 实验试剂：人骨髓系白血病细胞U937由吉林大学基础免疫教研室馈赠，低密度脂 蛋白(nLDL)和氧化低密度脂蛋白(ox_LDL)购自北京协和医院基础研究所。IMDM培养基(PH7. 2，100IU/ml青霉素、100μg/ml链霉素)(Sigma Chemical Co. USA)，10%胎牛血清，D-Hank 's液，其他试剂为国产分析纯，Caspase3、8、9单克隆抗体均购自Santa Cruz公司。其它二 抗和显色剂购自鼎国公司。LOX_1拮抗剂聚肌苷酸(Polyinosinic acid PIA)和角叉菜胶购自 Sigma公司。卡托普利纯品(中美上海施贵宝公司馈赠)。
1.2 实验方法
1.2.1 细胞培养及实验分组
用IMDM培养液和10%胎牛血清，常规方法培养U937细胞，2～3d传代，待细胞传至需要数量时 即可用于实验。实验共分六组：(1)对照组：细胞置IMDM培养基中于5%CO2、37℃、饱和湿 度 培养箱中培养。(2)LDL组(nLDL):在培养瓶中加入nLDL(100ug/ml)，其他同对照组。(3)ox_L DL组：在细胞的培养瓶中加入ox_LDL(100ug/ml)，然后在IMDM培养基中于5%CO2、37℃、 饱 和湿度培养箱中培养24小时。(4)PIA组：PIA(250ug/l)处理1小时后加入ox_LDL 100ug/ml共 同培育24小时。(5)角叉菜胶组：角叉菜胶(250ug/l)处理后ox_LDL 100ug/ml共同培育24小 时。(6)卡托普利组：卡托普利(10-5mol/L)处理1小时后加入ox_LDL 100ug/ml共同培 育24小时。
1.2.2 流式细胞术(FCM)检测凋亡：分组分瓶收集细胞(1×106个)。离心(1000r/min)5 min弃上清液，沉淀中加入2ml磷酸盐缓冲液(PBS)混匀，离心(1000r/min)5min。弃上清液， 加75%冷乙醇2ml固定，置4℃保存。染色前用PBS离心沉淀去除固定液，加入20μl RnaseA 3 7℃水浴30min，再加800μl碘化吡啶染色液混匀，4℃避光30min。上机检测。
1.2.3 免疫组织化学技术检测caspase蛋白的表达：分组收集细胞，进行免疫组织化学染 色。以PBS代替一抗作为阴性对照，以已知的阳性片作为阳性对照。上镜观察阳性细胞数。 结果判定：阳性染色为细胞浆和(或)细胞核内有浅至深棕黄色颗粒，随机选择10个高倍视野 (×400)，记数1000个细胞中所占的阳性细胞数，计算百分比。
免疫印迹法(Western Blot)检测caspase蛋白的表达：取1×106个培养U937细胞洗涤，离 心，用加样缓冲液裂解细胞，100℃水浴10min，离心(10 000r×10min)，收集上清，采用考 马斯亮兰法进行蛋白定量，制备好的蛋白样品置-80℃冰箱保存备用。用20ug蛋白/泳道上样 ， 经12%聚丙烯酰胺凝胶SDS_PAGE电泳后，电转膜至硝酸纤维膜。室温封闭3h加1：100 caspas e蛋白的抗体，再加入1：200的辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗，室温孵育1h，采用二甲基 联苯胺(DAB)显色试剂盒进行显色约2～5min，待蛋白条带显色清晰时中止反应，拍摄照片， 记录实验结果。
1.3 统计学处理
各种计量数据均以均数±标准差表示，各组数据间显著性检验采用t检验，统计学分析应用S AS(6.12)软件包。P＜0.05为有显著性差异。
2 结果
2.1 各U937细胞凋亡率
各组细胞经流式细胞仪检测DNA周期的结果发现，正常培养的细胞DNA多处于G0/G1期，凋亡 率为(0.098±0.022)%，而ox_LDL处理的细胞DNA在G0/G1期前出现了明显的“亚二倍体峰 ”，又称凋亡(AP峰)，凋亡率为(12.77±1.41)%。卡托普利组与C组相比凋亡率增加，为( 1.02±0.166)%；与ox_LDL组相比，凋亡率减少。应用LOX_1阻断剂PIA和角叉菜胶后，凋 亡率分别为(4.94±0.47)%和(2.62±0.656)%与C组相比凋亡率增加，与ox_LDL组相比凋 亡率减低，差异均具有统计学意义(P＜0.05)。
2.2 LOX_1对凋亡蛋白酶的影响和卡托普利的作用
正常状态下，细胞核为圆形，周边整齐光滑，胞质和胞核内未见有棕黄色着色，经ox_LDL处 理 24小时后细胞体积缩小、细胞核出现凹沟，有的细胞核分裂成数个小核，符合细胞凋亡的光 镜学特征，在Caspase3、8、9染色的细胞核内均可见棕黄色颗粒着色，其阳性细胞百分率与 对照组明显增多(P＜0.05)。应用药物和阻断剂后可见细胞数目增多，与ox_LDL相比Ca spase3、8、9表达明显减少(P＜0.05)，见表1。
同时应用免疫印迹法发现ox_LDL作用U937细胞24小时后caspase3、8、9的免疫印迹条带的颜 色明显加深，密度增加，其蛋白质的表达量明显增多，应用药物卡托普利和LOX_1阻断剂PIA 和角叉菜胶可见其含量明显减少(图1)。
3 讨论
大量研究证实ox_LDL在动脉粥样硬化的形成和发展中扮演重要角色，而血管细胞通过受体介 导的方式中和降解ox_LDL。1997年Sawamura等［4］证明这一功能受体为血凝素样氧 化低密度脂蛋白受体(LOX_1)，它属于II型单链跨膜蛋白，有一个短的N端胞浆亲水结构和一 个 长的C端胞外亲水结构域，中间为疏水区域，从结构上看属于C型选择素家族。LOX_1作为ox_ LDL的受体与以往的清道夫受体(如CD36)不同，它具有高度的配体特异性，可以结合、内吞 、 降解ox_LDL，但对天然低密度脂蛋白(nLDL)和乙酰化低密度脂蛋白(ac_LDL)则无作用［ 5］，表明ox_LDL与LOX_1的结合是特异的，此过程可被LOX_1阻滞剂PIA和角叉菜胶抑制［6］。正常条件下主动脉内膜和富含血管的器官如胎盘，肺，脑，肝等中都有LOX_1的 表达，在胸主动脉的动脉粥样斑块中和培养的主动脉内皮细胞，巨噬细胞，血管平滑肌细胞 也有此表达［2］。
已有研究证实ox_LDL诱导斑块内多种细胞凋亡都有LOX_1的参与。双重免疫斑点实验证实LOX _1表达与凋亡共存在［7］，其主要集中在斑块中有破裂倾向的区域。在培育的牛主 动脉平滑肌细胞［8］，ox_LDL通过使受胞外信号调控的激酶磷酸化，从而上调LOX_1 介导凋亡，LOX_1中和抗体可阻止细胞通过LOX_1对ox_LDL的摄取从而抑制ox_LDL诱导凋亡过 程，该抗体也抑制由ox_LDL引起Bax/Bcl-2的增加，因此ox_LDL通过LOX_1调节Bax/Bcl-2比 例诱导SMC 凋亡。把人脐静脉内皮细胞与抗Fas抗体激动剂CH11和低浓度ox_LDL共孵育测凋亡，发现ox_ L DL浓度依赖性上调Fas的表达，从而促进Fas介导的凋亡，LOX_1中和抗体则阻止LOX_1介导的 对ox_LDL的摄取，从而抑制凋亡。因此ox_LDL通过与LOX_1相互作用上调细胞表面Fas，调节 Fas系统介导凋亡，从而通过死亡受体途径诱导凋亡［9］。在人冠状动脉内皮细胞， Li等［6］发现与ox_LDL共孵育24小时LOX_1蛋白质和mRNA表达明显增加，而与nLDL共 同培养则无此现象，这种上调作用可被反义LOX_1抑制，但不被顺义LOX_1所抑制，PIA和角 叉菜胶也降低ox_LDL介导的凋亡。
在粥样斑块内尚存在巨噬细胞凋亡，然后坏死，使脂核不断增大，同时巨噬细胞凋亡使其对 脂质，胆固醇消除减少，促进AS的发生发展。ox_LDL可诱导巨噬细胞凋亡的发生，可诱导细 胞表面LOX_1的表达，但LOX_1与巨噬细胞凋亡的关系研究较少。研究证实在ox_LDL可时间和 浓度依赖性诱导U937细胞凋亡和LOX_1的表明［1，3］，本文应用LOX_1的化学阻断剂 PIA的角叉菜胶探讨LOX_1在这一过程中的作用，结果表明LOX_1阻断剂可使ox_LDL诱导U937 细胞凋亡百分比减少，同时凋亡蛋白酶caspase3、8、9表达均减少。在细胞凋亡中的信号通 路及通路分子中，目前认为主要通过两条信号通路发生，一条是通过Fas和Fas配体激活天冬 氨酸特异的半胱氨酸蛋白酶8(Caspase8)和3(Caspase3)的死亡受体途径，另一条是通过细胞 色素C释放进而逐步激活天冬氨酸特异的半胱氨酸蛋白酶9(Caspase9)和3(Caspase3)的线粒 体途径。本实验结果显示U937细胞通过LOX_1摄取ox_LDL进而诱导细胞凋亡，应用LOX_1阻断 剂后Caspase8，9，3的表达减少，提示ox_LDL通过与LOX_1结合后是通过上述两条信号通路 诱导U937细胞凋亡现象的发生。
肾素_血管紧张素_醛固酮和动脉粥样硬化发生和发展之间有着密切的联系［10］，有 研究证实血管紧张素(Ang)II可上调LOX_1的表达［11］，ACEI为血管紧张素转换酶抑 制剂，它可抑制AngI向AngII的转换，从而使LOX_1的表达减少。本文在培养液中预先加入AC EI类代表药物卡托普利，发现ox_LDL诱导的U937细胞的凋亡现象明显减少，免疫组织化学染 色亦证实应用卡托普利处理后细胞凋亡蛋白酶表达明显减少，表明卡托普利可抑制ox_LDL对 U937细胞的损害作用，其具体机制尚待进一步研究。
总之，ox_LDL是导致AS的重要的危险因子，ox_LDL与其受体LOX_1结合通过以caspase为代表 的两条信号通路引起U937细胞凋亡，促进AS的发生、发展，ACEI类药物卡托普利则可通过抑 制ox_LDL的上述作用，起到抗动脉粥样硬化作用，这为我们对AS的发生发展机制的研究及其 防治方法提供新的思路。
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