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目前，国内外主要采用肝门静脉灌流的方式分离肝星形细胞，此方法操作复杂，时程长，污染风险大，对于本科生实验教学学时有限制。本实验通过非灌流法分离大鼠肝星形细胞，与传统的灌流法相比，不需要一系列灌流设备，而且避免了肝门静脉插管等繁琐的操作，降低了污染的风险，在一定程度上减少了肝星形细胞的体外分离操作时间，从而进一步提高了细胞活性，为本科生实验教学实验方法进行了改进。此方法不论对于科学研究还是基础教学，均具有着重要的指导意义。
一、该实验方法改进主要有三大特点
（1）综合性：将细胞工程、组织工程等专业课程的基础实验内容融合于综合实验设计中， 将生物工程的多种技术有机结合在一起，既减少实验重复内容， 给予学生全局的观念，又有利于学生开阔视野，培养学生综合运用生物工程技能分析问题和解决问题的能力。
（2）多样性：实验材料包括动物组织、实验细胞等。根据指导教师的专业背景和科研方向，开出次实验项目，让学生根据兴趣选择，具有较强的灵活性。
（3）创新性：课程安排了由浅入深的不同层次的实验环节，首先进行实验技能的基本训练，在此基础上安排实验方法的改进，增加了设计性实验内容 。
二、该实验方法改进创新点
本实验采用更简洁、可行性更强，耗材更少的方法来提取肝脏星形细胞，与以往的灌流法相比在步骤、方法及提取纯度上均体现明显优势，力求在有效简化复杂提取工作的同时，获得纯度更好，状态更好的肝脏星形细胞，简化了实验方法、减少实验步骤、节省了实验时间。此方法的改进为本科生实验教学改革提供了简捷可靠的实验基础。
【吉林大学 2013 年实验技术研究立项项目】项目负责人：石毅，“非灌流法分离大鼠肝脏星形细胞及其鉴定”（ 20131104）
三、实验方法
（一）大鼠肝星状细胞的分离培养和鉴定
1.大鼠肝星形细胞的分离
断颈处死Wistar大鼠，用75%酒精浸泡大鼠进行全身消毒，打开腹腔取出肝脏，迅速放入离心管内，并用剪刀将肝脏尽量剪碎，加入PBS缓冲液，混合均匀，200g离心30s，沉淀组织块，如此反复洗涤3次以洗净肝脏组织中的血液成分。加入混合酶液（胶原酶IV溶液和链霉蛋白酶溶液1：1），37℃消化20min，收集消化液，并用适量PBS溶液洗涤组织块2次，收集清洗液，消化液和清洗液经400目尼龙膜过滤后，200g离心5min收集细胞。用PBS清洗2-3次后，细胞用高糖DMEM培养基悬起，在离心管中加入40% Percoll分离液，加上述细胞悬液，1200g离心20min，在培养基与分离液交界处的悬浮细胞即为肝星形细胞。将细胞接种在培养皿内，记为P1代细胞，细胞于37℃、5%CO2条件下，用含10%胎牛血清的高糖DMEM培养基进行常规培养，隔日半量换液，并在倒置相差显微镜下观察细胞生长状态。
2.肝星状细胞的体外分离培养
当原代细胞长至80%左右时，对细胞进行传代。弃掉培养皿中培养基，加入PBS清洗2-3次后，加入含有EDTA的胰酶37℃消化，待细胞大部分脱落时，加入含有血清的培养基终止消化，轻轻吹打培养皿，待细胞充分脱落后，200g离心5min收集细胞。加入培养基重悬之后，均匀分配到培养皿中，37℃、5% CO2条件下继续培养。
3.大鼠肝星形细胞的鉴定
大鼠肝星形细胞的脂质油红O染色鉴定按脂质油红O染色试剂盒操作说明进行。
四、实验结果
（一）大鼠肝星形细胞的形态观察
P1代细胞培养一段时间后，可见大鼠肝星细胞贴壁生长，细胞形态呈梭形或星形，细胞生长状态良好，于首次接种后的10-14天可用0.25%的胰酶进行传代处理。
（二）大鼠肝星形细胞的脂质油红O染色结果
肝星形细胞的细胞核经苏木素复染后可变为蓝色，由脂质油红O染色结果可见：细胞的胞质中含有大量脂滴，分散在细胞核周围，脂滴可被染为红色。
（三）大鼠肝星形细胞的特异蛋白免疫组化染色结果
免疫组化染色结果可见：大鼠肝星形细胞在结蛋白、α-平滑肌肌动蛋白、GFAP表达方面均呈阳性；从低倍镜下可以观察到，细胞的着色率在90%以上，由此可对细胞纯度进行初步评估；本实验分别取P2代和P5代细胞进行GFAP染色，染色结果一致，细胞着色比率未出现明显改变，进一步证实本方法分离的肝星形细胞，随着细胞传代的进行，纯度基本不会发生明显变化。
本实验成功建立了大鼠肝星形细胞的非灌流分离模式，且所获星形细胞纯度较高，该方法稳定简便，减少体外分离操作时间，进一步提高了细胞活性，免疫组化染色结果显示细胞纯度可达90%以上，所以，该方法在分离肝星形细胞方面可以有效的利用本科生实验教学中，使本科生从动物组织取材开始，到组织工程种子细胞的分离、提取、纯化及鉴定，在整个实验过程提高了学生实验的综合能力，创新能力和实验的多样性。力争在实验教学中取得较好的效果。
一、该实验方法改进主要有三大特点
（1）综合性：将细胞工程、组织工程等专业课程的基础实验内容融合于综合实验设计中， 将生物工程的多种技术有机结合在一起，既减少实验重复内容， 给予学生全局的观念，又有利于学生开阔视野，培养学生综合运用生物工程技能分析问题和解决问题的能力。
（2）多样性：实验材料包括动物组织、实验细胞等。根据指导教师的专业背景和科研方向，开出次实验项目，让学生根据兴趣选择，具有较强的灵活性。
（3）创新性：课程安排了由浅入深的不同层次的实验环节，首先进行实验技能的基本训练，在此基础上安排实验方法的改进，增加了设计性实验内容 。
二、该实验方法改进创新点
本实验采用更简洁、可行性更强，耗材更少的方法来提取肝脏星形细胞，与以往的灌流法相比在步骤、方法及提取纯度上均体现明显优势，力求在有效简化复杂提取工作的同时，获得纯度更好，状态更好的肝脏星形细胞，简化了实验方法、减少实验步骤、节省了实验时间。此方法的改进为本科生实验教学改革提供了简捷可靠的实验基础。
【吉林大学 2013 年实验技术研究立项项目】项目负责人：石毅，“非灌流法分离大鼠肝脏星形细胞及其鉴定”（ 20131104）
三、实验方法
（一）大鼠肝星状细胞的分离培养和鉴定
1.大鼠肝星形细胞的分离
断颈处死Wistar大鼠，用75%酒精浸泡大鼠进行全身消毒，打开腹腔取出肝脏，迅速放入离心管内，并用剪刀将肝脏尽量剪碎，加入PBS缓冲液，混合均匀，200g离心30s，沉淀组织块，如此反复洗涤3次以洗净肝脏组织中的血液成分。加入混合酶液（胶原酶IV溶液和链霉蛋白酶溶液1：1），37℃消化20min，收集消化液，并用适量PBS溶液洗涤组织块2次，收集清洗液，消化液和清洗液经400目尼龙膜过滤后，200g离心5min收集细胞。用PBS清洗2-3次后，细胞用高糖DMEM培养基悬起，在离心管中加入40% Percoll分离液，加上述细胞悬液，1200g离心20min，在培养基与分离液交界处的悬浮细胞即为肝星形细胞。将细胞接种在培养皿内，记为P1代细胞，细胞于37℃、5%CO2条件下，用含10%胎牛血清的高糖DMEM培养基进行常规培养，隔日半量换液，并在倒置相差显微镜下观察细胞生长状态。
2.肝星状细胞的体外分离培养
当原代细胞长至80%左右时，对细胞进行传代。弃掉培养皿中培养基，加入PBS清洗2-3次后，加入含有EDTA的胰酶37℃消化，待细胞大部分脱落时，加入含有血清的培养基终止消化，轻轻吹打培养皿，待细胞充分脱落后，200g离心5min收集细胞。加入培养基重悬之后，均匀分配到培养皿中，37℃、5% CO2条件下继续培养。
3.大鼠肝星形细胞的鉴定
大鼠肝星形细胞的脂质油红O染色鉴定按脂质油红O染色试剂盒操作说明进行。
四、实验结果
（一）大鼠肝星形细胞的形态观察
P1代细胞培养一段时间后，可见大鼠肝星细胞贴壁生长，细胞形态呈梭形或星形，细胞生长状态良好，于首次接种后的10-14天可用0.25%的胰酶进行传代处理。
（二）大鼠肝星形细胞的脂质油红O染色结果
肝星形细胞的细胞核经苏木素复染后可变为蓝色，由脂质油红O染色结果可见：细胞的胞质中含有大量脂滴，分散在细胞核周围，脂滴可被染为红色。
（三）大鼠肝星形细胞的特异蛋白免疫组化染色结果
免疫组化染色结果可见：大鼠肝星形细胞在结蛋白、α-平滑肌肌动蛋白、GFAP表达方面均呈阳性；从低倍镜下可以观察到，细胞的着色率在90%以上，由此可对细胞纯度进行初步评估；本实验分别取P2代和P5代细胞进行GFAP染色，染色结果一致，细胞着色比率未出现明显改变，进一步证实本方法分离的肝星形细胞，随着细胞传代的进行，纯度基本不会发生明显变化。
本实验成功建立了大鼠肝星形细胞的非灌流分离模式，且所获星形细胞纯度较高，该方法稳定简便，减少体外分离操作时间，进一步提高了细胞活性，免疫组化染色结果显示细胞纯度可达90%以上，所以，该方法在分离肝星形细胞方面可以有效的利用本科生实验教学中，使本科生从动物组织取材开始，到组织工程种子细胞的分离、提取、纯化及鉴定，在整个实验过程提高了学生实验的综合能力，创新能力和实验的多样性。力争在实验教学中取得较好的效果。