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摘要：目的：研究树舌多糖（GAPS）与硫化氢对实验鼠神经元凋亡相关基因Bcl-2，caspas-9表达的影响。方法：实验分5组，阴性对照组（A组：腹腔注射生理盐水）、5% H2O2模型组（ B组：15mg/kg）、树舌给药组（c组：10mg/kg）、硫化氢给药组（d组：0.3mg/kg）、树舌与硫化氢联合给药组（E组： 10mg/kg+ 0.3mg/kg），用过氧化氢对B，C，D，E组实验鼠进行氧应激处理6h，造成损伤模型，再按照各组药物剂量腹腔注射。硫化氢与树舌多糖作为保护剂，连续处理3周后处死大鼠，取出海马，检测凋亡相关基因Bcl-2，caspas-9的表达水平。结果：B组与A组比较，BCL-2表达水平降低，而caspas-9表达有所升高。C，D，E组与B组比较，BCL-2表达水平明显提高，caspas-9表达明显降低。E组较C，D组Bcl-2表达水平明显提高，，caspas-9表达明显降低。结论：树舌多糖、硫化氢具有对过氧化氢造成的动物模型神经损伤有保护作用，联合用药保护性增强，可减轻神经细胞凋亡。
关键词：硫化氢；树舌多糖；氧化应激；细胞凋亡
【中图分类号】R749.053 【文献标识码】A 【文章编号】1672-8602（2014）08-0001-02
海马是具有学习记忆功能的重要脑区。衰老及Alzheimer病（AD）等神经退行性疾病与海马神经元病變有密切的关系[1]。硫化氢是一种具有臭鸡蛋气味的有毒气体，人类如果吸入含800PPM浓度硫化氢气体，5分钟即可死亡。最近10年，科学家发现人体合成少量的硫化氢却具有重要生理功能[2]。树舌多糖为树舌的干燥实体经过提取所得到的有效组分，研究表明，其具有广泛的生物活性，具有提高机体免疫力、消除自由基和抗衰老等作用。Bcl-2是凋亡分子机制研究的主要靶分子。在哺乳动物细胞中，Bcl-2调节线粒体外膜通透性，主要定位在线粒体外膜上，或受到信号刺激后转移到线粒体外膜上。细胞接受凋亡信号后促凋亡因子Bax和Bax发生寡聚化，从细胞质中转移到线粒体外膜上，并与膜上的电压依赖阴离子通道相互作用，使通道开放到足以使线粒体内的凋亡因子如细胞色素C等释放到细胞质基质中，引起细胞死亡[3]。caspase是一个在细胞凋亡过程中起重要作用的蛋白酶家族。caspase-9是细胞凋亡信号转导过程中比较上游的一个caspase。线粒体释放细胞色素C以后，caspase-9可以和细胞色素C以及Apaf1形成复合物，同时被激活。激活的caspase-9可以激活细胞凋亡的最关键酶caspase-3，从而促进后续的细胞凋亡信号[4]。本文以H2O2作为氧化应激损伤的诱导物，树舌多糖和过氧化氢作为神经元保护剂，观察其对氧化应激损伤的海马神经元凋亡基因Bcl-2，caspas-9表达的影响，为阐明其作用机制及防治神经退行性疾病提供实验依据。
1. 材料与方法
1.1 材料
1.1.1实验动物
实验动物由齐齐哈尔医学院动物实验中心提供。
1.1.2 试剂
硫化氢由硫化钠与盐酸反应生成。树舌多糖由黑龙江中医药大学于英君教授惠赠，经黑龙江省药检所验证。过氧化氢为天津市凯通化学试剂有限公司生产（分析纯）。
1.1.3 仪器
离心机 PCR仪 电泳仪
1.2 方法
1.2.1 实验动物模型的制作及分组
实验动物分5组（每组10只），阴性对照组（A组：腹腔注射生理盐水）、H2O2模型组（B组：5% H2O2 15mg/kg）、树舌给药组（c组：0.2mL[10mg/ml]）、硫化氢给药组（d组：0.3mL[0.3mg/ml]）、树舌与硫化氢联合给药组（E组： 0.2ml[10mg/ml]+ 0.3ml[0.3mg/ml]），A组为正常饲养的大鼠；B组为过氧化氢诱导组；C、D、E组实验鼠进行氧应激处理6h，造成损伤模型，再按照各组药物剂量腹腔注射。用药3周，分别处死动物。
1.2.2 蛋白免疫印迹法检测细胞内BCL-2、caspase-9的表达[5]：分别取各组大鼠新鲜海马组织，称重，剪碎样品，按1：3加入裂解液，超声粉碎，高速低温离心，取上清。考马斯亮蓝法蛋白质定量，每例标本提取蛋白50ug。以12%十二烷基硫酸钠（SDS）聚丙烯酰胺凝胶电泳分离， 分离的蛋白用半干电转移法转移到事先用甲醇激活的聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，用配好的5%脱脂奶粉封闭液封闭2h，TBST洗3次。加入兔单克隆抗体Bcl-2（l：800）与兔多克隆抗体caspase-9 （1：300），4℃过夜. TBST洗3次，辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗兔IgG（l：2000），室温下孵育2h.TBST洗4次，ECL显色，应用FluorchemV2.0系统进行光密度测定，以目的条带与内参照GAPDH的平均吸光度的比值表示蛋白水平，进行半定量分析。
1.2.3 RT-PCR检测Bcl-2和caspase-9的表达
每只鼠取海马100mg放入处理好的玻璃匀浆器内，加lmL的Trizol液，提取总RNA， ，并逆转录成cDNA，以cDNA为模板进行实时定量PCR扩增。Bcl-2mRNA扩增产物所需的引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，上游为5-ATGTGTGTGGAGAGCGTCAAC-3.；下游为5-CAGCCAGGAGAAATCAAACAG-3； caspase-9mRNA上游引物：5-
CCTTGTGTCCTACTCCACCTTC-3，下游引物：5-ATCTGCTTGTAA-
GTCCCTTTCG-3；GAPDH内参上游引物：5-AGGCCGGTGCTGAG TATGCT
-3，下游引物：TGCCTGCTTCACCACATTCT-3。PCR反应体系及反应条件按TaKaRa Code：DRR420A试剂盒说明书操作。每个样品做3个复孔。 1.2.4 统计学处理与分析
采用SPSS13.0软件进行处理，数据用x+s表示，one-way AN0vA法进行方差分析，再进行t检验，以p<0.05为差异显著.
2. 结果
2.1 树舌多糖、硫化氢对氧应激大鼠神经元凋亡基因Bcl-2和caspase-9蛋白表达的影响
通过western blot方法检测了H2S处理处理对Bcl-2蛋白表达的影响，结果显示，氧应激大鼠脑组织的Bcl-2蛋白表达下调，而树舌多糖与H2S共处理组和H2S组Bcl-2蛋白表达上调，表明H2S处理、树舌多糖处理或H2S和树舌多糖共处理均在转录和翻译水平上调了Bcl-2的表达。（见图1）
通过western blot方法检测了H2S处理对caspase-9蛋白表达的影响，结果显示，氧应激大鼠脑组织的caspase-9蛋白表达上调，而H2S处理、树舌多糖处理或H2S和树舌多糖共处理组caspase-9蛋白表达下调，表明H2S处理、树舌多糖处理或H2S和树舌多糖共处理均在转录和翻译水平下调了caspase-9的表达。（见图2）
图1 树舌多糖、H2S处理提高了脑组织中Bcl-2蛋白表达
图2 树舌多糖、H2S处理抑制了脑组织中caspase-9蛋白表达
2.2 树舌多糖、硫化氢对氧应激（大）鼠神经元凋亡基因BCL-2和caspase-9 mRNA表达表达的影响
通过实时定量PCR检测了Bcl-2 mRNA表达，结果显示，在氧应激大鼠脑组织的Bcl-2 mRNA表达水平为0.92 ± 0.40，较正常对照组1.00 ± 0.00表达水平降低，而树舌多糖组、树舌多糖与H2S处理组和H2S组Bcl-2 mRNA表达水平分别提高为1.20 ± 0.63、1.66 ± 0.80和1.52 ± 0.91。均较模型组升高。表明H2S单独处理或H2S和树舌多糖共处理均具有上调Bcl-2 mRNA表达的作用。（见表1）
通过实时定量PCR检测了caspase-9 mRNA表达，结果显示，在氧应激大鼠脑组织的caspase-9 mRNA表达水平为5.13 ± 6.01，较正常对照组1.00 ± 0.00 mRNA表达上调，而树舌多糖组、树舌多糖与H2S共处理组和H2S组caspase-9 mRNA表达水平分别下调为2.06 ± 1.81、2.80 ± 3.31和3.48 ± 3.68，均较模型组下调，但仍然较正常对照组的水平高。表明H2S单独处理或H2S和树舌多糖共处理均具有下调caspase-9 mRNA表达的作用。（见表2）
表 1 树舌多糖、H2S对过氧化氢处理大鼠脑组织Bcl-2 mRNA
表达的影响（x ± s，2ΔΔct）
组 别 n Bcl-2的2ΔΔct值
空白对照组 5 1.00 ± 0.00
模型组 5 0.92 ± 0.40
树舌多糖组 5 1.20 ± 0.63
树舌+H2S组 5 1.66 ± 0.80
H2S组 5 1.52 ± 0.91
表2树舌多糖、 H2S对过氧化氢处理大鼠脑组织
caspase-9 mRNA表达的影响（X± s，2ΔΔct）
组 别 n caspase-9的2ΔΔct值
空白对照组 5 1.00 ± 0.00
模型组 5 5.13 ± 6.01
树舌多糖组 5 2.06 ± 1.81
树舌+H2S组 5 2.80 ± 3.31
H2S组 5 3.48 ± 3.68
讨论
凋亡是多基因严格控制的过程。这些基因在种属之间非常保守，如Bcl-2家族、caspase家族、癌基因C-myc、抑癌基因P53等。凋亡过程的紊乱可能与许多疾病的发生有直接或间接的关系。如肿瘤、自身免疫性疾病等。
机体在代谢过程中会产生大量自由基，如果自由基的产生和清除失去平衡，导致自由基在体内大量积累，就会产生氧化应激损伤。由于神经组织的特殊性质，对氧自由基较为敏感，易遭受其攻击。目前许多学者认为阿尔茨海默症、帕金森症等均以进行性认知障碍和记忆力损害为主的神经退行性疾病，都与氧自由基有关。在氧自由基的损伤下，细胞膜通透性增加，DNA断裂损伤，激活凋亡基因。其中Bcl-2基因表达上调、caspas-9基因表达下调，细胞发生凋亡。
本实验采用腹腔注射过氧化氢刺激大鼠，以树舌多糖和硫化氢作为保护性药物，分别及联合用药观察对实验大鼠神经元凋亡的影响。本研究结果显示：与空白对照组比较，模型组Bcl-2 蛋白及mRNA表达下调，而树舌多糖组、树舌多糖与H2S处理组和H2S组Bcl-2蛋白及 mRNA表达水平分别提高，但是联合用药组提高最为明显。与空白对照组比较，模型组caspase-9蛋白及mRNA表达上调，而树舌多糖组、树舌多糖与H2S处理组和H2S组caspase-9蛋白及 mRNA表达水平分别下调，但是联合用药组下调最为明显。据以上实验推测，树舌多糖、硫化氢及联合用药对实验鼠神经元具有保护作用，可能是通过抗氧化途径、抑制凋亡途径，从而达到减轻神经元损伤，但其抗氧化作用的分子机制有待于近一步研究細化。为中西药结合治疗氧应激脑损伤、保护大脑功能提供实验依据。
参考资料：
[1] Brinton RD.Estrogen regulation of glucose metabolism and mitochondrial function： therapeutic implications for preven-lion of Alzheimer's disease （JJ. Adv Drug Deliv Rev， 2008，60（13-14）： 1504-1511.
[2] 戴鸿雁，凌亦凌，黄新莉，等.硫化氢在内毒素血症大鼠动脉舒张反应性改变中的作用及其与一氧化氮的关系[J].河北医科大学学报，2O04，25（6）：355-35
[3] 李玉莉，胡静姿，刘惠敏，等. Bcl-2、Bcl-xL和Bax蛋白在结直肠癌中的表达[J].
癌变畸变突变， 2007， 19（1）： 53.
[4] 李立平，韦瑛，蔡捷，李小平，邝晓聪，何少键. 过氧化氢诱导血管内皮细胞凋亡与Caspase-3表达的实验研究[J]. 陕西医学杂志. 2009（08）
[5] 申洪.免疫组织化学染色定量方法研究（III ）[J].中国组织化学与细胞化学杂志，1995，4（1）：89-91.
关键词：硫化氢；树舌多糖；氧化应激；细胞凋亡
【中图分类号】R749.053 【文献标识码】A 【文章编号】1672-8602（2014）08-0001-02
海马是具有学习记忆功能的重要脑区。衰老及Alzheimer病（AD）等神经退行性疾病与海马神经元病變有密切的关系[1]。硫化氢是一种具有臭鸡蛋气味的有毒气体，人类如果吸入含800PPM浓度硫化氢气体，5分钟即可死亡。最近10年，科学家发现人体合成少量的硫化氢却具有重要生理功能[2]。树舌多糖为树舌的干燥实体经过提取所得到的有效组分，研究表明，其具有广泛的生物活性，具有提高机体免疫力、消除自由基和抗衰老等作用。Bcl-2是凋亡分子机制研究的主要靶分子。在哺乳动物细胞中，Bcl-2调节线粒体外膜通透性，主要定位在线粒体外膜上，或受到信号刺激后转移到线粒体外膜上。细胞接受凋亡信号后促凋亡因子Bax和Bax发生寡聚化，从细胞质中转移到线粒体外膜上，并与膜上的电压依赖阴离子通道相互作用，使通道开放到足以使线粒体内的凋亡因子如细胞色素C等释放到细胞质基质中，引起细胞死亡[3]。caspase是一个在细胞凋亡过程中起重要作用的蛋白酶家族。caspase-9是细胞凋亡信号转导过程中比较上游的一个caspase。线粒体释放细胞色素C以后，caspase-9可以和细胞色素C以及Apaf1形成复合物，同时被激活。激活的caspase-9可以激活细胞凋亡的最关键酶caspase-3，从而促进后续的细胞凋亡信号[4]。本文以H2O2作为氧化应激损伤的诱导物，树舌多糖和过氧化氢作为神经元保护剂，观察其对氧化应激损伤的海马神经元凋亡基因Bcl-2，caspas-9表达的影响，为阐明其作用机制及防治神经退行性疾病提供实验依据。
1. 材料与方法
1.1 材料
1.1.1实验动物
实验动物由齐齐哈尔医学院动物实验中心提供。
1.1.2 试剂
硫化氢由硫化钠与盐酸反应生成。树舌多糖由黑龙江中医药大学于英君教授惠赠，经黑龙江省药检所验证。过氧化氢为天津市凯通化学试剂有限公司生产（分析纯）。
1.1.3 仪器
离心机 PCR仪 电泳仪
1.2 方法
1.2.1 实验动物模型的制作及分组
实验动物分5组（每组10只），阴性对照组（A组：腹腔注射生理盐水）、H2O2模型组（B组：5% H2O2 15mg/kg）、树舌给药组（c组：0.2mL[10mg/ml]）、硫化氢给药组（d组：0.3mL[0.3mg/ml]）、树舌与硫化氢联合给药组（E组： 0.2ml[10mg/ml]+ 0.3ml[0.3mg/ml]），A组为正常饲养的大鼠；B组为过氧化氢诱导组；C、D、E组实验鼠进行氧应激处理6h，造成损伤模型，再按照各组药物剂量腹腔注射。用药3周，分别处死动物。
1.2.2 蛋白免疫印迹法检测细胞内BCL-2、caspase-9的表达[5]：分别取各组大鼠新鲜海马组织，称重，剪碎样品，按1：3加入裂解液，超声粉碎，高速低温离心，取上清。考马斯亮蓝法蛋白质定量，每例标本提取蛋白50ug。以12%十二烷基硫酸钠（SDS）聚丙烯酰胺凝胶电泳分离， 分离的蛋白用半干电转移法转移到事先用甲醇激活的聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，用配好的5%脱脂奶粉封闭液封闭2h，TBST洗3次。加入兔单克隆抗体Bcl-2（l：800）与兔多克隆抗体caspase-9 （1：300），4℃过夜. TBST洗3次，辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗兔IgG（l：2000），室温下孵育2h.TBST洗4次，ECL显色，应用FluorchemV2.0系统进行光密度测定，以目的条带与内参照GAPDH的平均吸光度的比值表示蛋白水平，进行半定量分析。
1.2.3 RT-PCR检测Bcl-2和caspase-9的表达
每只鼠取海马100mg放入处理好的玻璃匀浆器内，加lmL的Trizol液，提取总RNA， ，并逆转录成cDNA，以cDNA为模板进行实时定量PCR扩增。Bcl-2mRNA扩增产物所需的引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，上游为5-ATGTGTGTGGAGAGCGTCAAC-3.；下游为5-CAGCCAGGAGAAATCAAACAG-3； caspase-9mRNA上游引物：5-
CCTTGTGTCCTACTCCACCTTC-3，下游引物：5-ATCTGCTTGTAA-
GTCCCTTTCG-3；GAPDH内参上游引物：5-AGGCCGGTGCTGAG TATGCT
-3，下游引物：TGCCTGCTTCACCACATTCT-3。PCR反应体系及反应条件按TaKaRa Code：DRR420A试剂盒说明书操作。每个样品做3个复孔。 1.2.4 统计学处理与分析
采用SPSS13.0软件进行处理，数据用x+s表示，one-way AN0vA法进行方差分析，再进行t检验，以p<0.05为差异显著.
2. 结果
2.1 树舌多糖、硫化氢对氧应激大鼠神经元凋亡基因Bcl-2和caspase-9蛋白表达的影响
通过western blot方法检测了H2S处理处理对Bcl-2蛋白表达的影响，结果显示，氧应激大鼠脑组织的Bcl-2蛋白表达下调，而树舌多糖与H2S共处理组和H2S组Bcl-2蛋白表达上调，表明H2S处理、树舌多糖处理或H2S和树舌多糖共处理均在转录和翻译水平上调了Bcl-2的表达。（见图1）
通过western blot方法检测了H2S处理对caspase-9蛋白表达的影响，结果显示，氧应激大鼠脑组织的caspase-9蛋白表达上调，而H2S处理、树舌多糖处理或H2S和树舌多糖共处理组caspase-9蛋白表达下调，表明H2S处理、树舌多糖处理或H2S和树舌多糖共处理均在转录和翻译水平下调了caspase-9的表达。（见图2）
图1 树舌多糖、H2S处理提高了脑组织中Bcl-2蛋白表达
图2 树舌多糖、H2S处理抑制了脑组织中caspase-9蛋白表达
2.2 树舌多糖、硫化氢对氧应激（大）鼠神经元凋亡基因BCL-2和caspase-9 mRNA表达表达的影响
通过实时定量PCR检测了Bcl-2 mRNA表达，结果显示，在氧应激大鼠脑组织的Bcl-2 mRNA表达水平为0.92 ± 0.40，较正常对照组1.00 ± 0.00表达水平降低，而树舌多糖组、树舌多糖与H2S处理组和H2S组Bcl-2 mRNA表达水平分别提高为1.20 ± 0.63、1.66 ± 0.80和1.52 ± 0.91。均较模型组升高。表明H2S单独处理或H2S和树舌多糖共处理均具有上调Bcl-2 mRNA表达的作用。（见表1）
通过实时定量PCR检测了caspase-9 mRNA表达，结果显示，在氧应激大鼠脑组织的caspase-9 mRNA表达水平为5.13 ± 6.01，较正常对照组1.00 ± 0.00 mRNA表达上调，而树舌多糖组、树舌多糖与H2S共处理组和H2S组caspase-9 mRNA表达水平分别下调为2.06 ± 1.81、2.80 ± 3.31和3.48 ± 3.68，均较模型组下调，但仍然较正常对照组的水平高。表明H2S单独处理或H2S和树舌多糖共处理均具有下调caspase-9 mRNA表达的作用。（见表2）
表 1 树舌多糖、H2S对过氧化氢处理大鼠脑组织Bcl-2 mRNA
表达的影响（x ± s，2ΔΔct）
组 别 n Bcl-2的2ΔΔct值
空白对照组 5 1.00 ± 0.00
模型组 5 0.92 ± 0.40
树舌多糖组 5 1.20 ± 0.63
树舌+H2S组 5 1.66 ± 0.80
H2S组 5 1.52 ± 0.91
表2树舌多糖、 H2S对过氧化氢处理大鼠脑组织
caspase-9 mRNA表达的影响（X± s，2ΔΔct）
组 别 n caspase-9的2ΔΔct值
空白对照组 5 1.00 ± 0.00
模型组 5 5.13 ± 6.01
树舌多糖组 5 2.06 ± 1.81
树舌+H2S组 5 2.80 ± 3.31
H2S组 5 3.48 ± 3.68
讨论
凋亡是多基因严格控制的过程。这些基因在种属之间非常保守，如Bcl-2家族、caspase家族、癌基因C-myc、抑癌基因P53等。凋亡过程的紊乱可能与许多疾病的发生有直接或间接的关系。如肿瘤、自身免疫性疾病等。
机体在代谢过程中会产生大量自由基，如果自由基的产生和清除失去平衡，导致自由基在体内大量积累，就会产生氧化应激损伤。由于神经组织的特殊性质，对氧自由基较为敏感，易遭受其攻击。目前许多学者认为阿尔茨海默症、帕金森症等均以进行性认知障碍和记忆力损害为主的神经退行性疾病，都与氧自由基有关。在氧自由基的损伤下，细胞膜通透性增加，DNA断裂损伤，激活凋亡基因。其中Bcl-2基因表达上调、caspas-9基因表达下调，细胞发生凋亡。
本实验采用腹腔注射过氧化氢刺激大鼠，以树舌多糖和硫化氢作为保护性药物，分别及联合用药观察对实验大鼠神经元凋亡的影响。本研究结果显示：与空白对照组比较，模型组Bcl-2 蛋白及mRNA表达下调，而树舌多糖组、树舌多糖与H2S处理组和H2S组Bcl-2蛋白及 mRNA表达水平分别提高，但是联合用药组提高最为明显。与空白对照组比较，模型组caspase-9蛋白及mRNA表达上调，而树舌多糖组、树舌多糖与H2S处理组和H2S组caspase-9蛋白及 mRNA表达水平分别下调，但是联合用药组下调最为明显。据以上实验推测，树舌多糖、硫化氢及联合用药对实验鼠神经元具有保护作用，可能是通过抗氧化途径、抑制凋亡途径，从而达到减轻神经元损伤，但其抗氧化作用的分子机制有待于近一步研究細化。为中西药结合治疗氧应激脑损伤、保护大脑功能提供实验依据。
参考资料：
[1] Brinton RD.Estrogen regulation of glucose metabolism and mitochondrial function： therapeutic implications for preven-lion of Alzheimer's disease （JJ. Adv Drug Deliv Rev， 2008，60（13-14）： 1504-1511.
[2] 戴鸿雁，凌亦凌，黄新莉，等.硫化氢在内毒素血症大鼠动脉舒张反应性改变中的作用及其与一氧化氮的关系[J].河北医科大学学报，2O04，25（6）：355-35
[3] 李玉莉，胡静姿，刘惠敏，等. Bcl-2、Bcl-xL和Bax蛋白在结直肠癌中的表达[J].
癌变畸变突变， 2007， 19（1）： 53.
[4] 李立平，韦瑛，蔡捷，李小平，邝晓聪，何少键. 过氧化氢诱导血管内皮细胞凋亡与Caspase-3表达的实验研究[J]. 陕西医学杂志. 2009（08）
[5] 申洪.免疫组织化学染色定量方法研究（III ）[J].中国组织化学与细胞化学杂志，1995，4（1）：89-91.