论文部分内容阅读
摘要：目的 探讨糖肾康防治糖尿病肾病的作用机制。方法 将体外培养的人肾小管上皮细胞（HK-2）分为空白组、高糖诱导组（30 mmol/L D-葡萄糖）、对照组（30 mmol/L D-葡萄糖+10%空白血清）和糖肾康低（30 mmol/L D-葡萄糖+5%糖肾康药物血清）、中（30 mmol/L D-葡萄糖+10%糖肾康药物血清）、高剂量组（30 mmol/L D-葡萄糖+20%糖肾康药物血清）。药物干预24、48 h后，ELISA检测细胞培养上清液中基质金属蛋白酶-9 （MMP-9）及其抑制剂-1（TIMP-1）的含量。结果 HK-2经高糖诱导后，MMP-9分泌显著减少，TIMP-1分泌显著增加，与空白组比较，差异有统计学意义（P<0.05）；经糖肾康干预后，MMP-9含量显著上升，TIMP-1含量显著下降，与高糖诱导组比较，差异有统计学意义（P<0.05）。结论 糖肾康通过调控高糖诱导人肾HK-2纤维化因子的分泌，达到防治糖尿病肾病的目的。
关键词：糖肾康；高糖；人肾小管上皮细胞；基质金属蛋白酶-9；基质金属蛋白酶抑制剂-1
Abstract：Objective To explore the mechanism of Tangshenkang in the prevention and treatment of diabetic nephropathy. Methods HK-2 cells were cultured in vitro and divided into control group， high glucose group （30 mmol/L D-glucose）， control group （30 mmol/L D-glucose+10% animal serum）， and Tangshenkang drug-containing serum therapy groups （30 mmol/L D-glucose+5% low concentration Tangshenkang， 30 mmol/L D-glucose+10% middle concentration Tangshenkang， 30 mmol/L D-glucose+20% high concentration Tangshenkang）. After 24 h and 48 h treatment， MMP-9 and TIMP-1 in cell cultural supernatant were observed by ELISA. Results MMP-9 of HK-2 cultured with high glucose was much decreased and TIMP-1 increased significantly than the control group， with statistical significance （P<0.05）. TIMP-1 significantly decreased and MMP-9 increased in HK-2 cultured with high glucose plus Tangshenkang compared with those only induced by high glucose， with statistical significance （P<0.05）. Conclusion Tangshenkang could regulate the secretion of fibrosis cell factor of HK-2 cell induced by high glucose， which may be one of the mechanisms in its treatment of diabetic nephropathy.
Key words：Tangshenkang；high glucose；human renal tubular epithelial cell；MMP-9；TIMP-1
糖尿病肾病是糖尿病常见的慢性微血管并发症之一，其发病机制尚不清楚。近年来研究发现，肾小管病变引起的间质纤维化与糖尿病肾病关系密切，故肾间质纤维化的干预在糖尿病肾病的治疗中越来越受到重视，肾间质纤维化的形成与多种纤维化细胞因子相互作用有关[1]。因此，调节纤维化细胞因子的正常表达在一定程度上能够抑制纤维化的发展。糖肾康是甘肃省中医院临床经验方，具有益气养阴、清热祛湿、活血化瘀的功效。前期研究结果表明，糖肾康能够改善2型糖尿病患者血流变学指标、减少尿微量白蛋白和24 h尿蛋白定量，对糖尿病肾病具有一定的治疗作用[2]。本研究在此基础上，结合北京中医药大学刘铜华教授治疗糖尿病肾病的学术思想[3]，对组方进行了优化，通过观察糖肾康干预高糖诱导体外培养人肾小管上皮细胞（HK-2）纤维化因子基质金属蛋白酶-9 （MMP-9）及其抑制剂-1（TIMP-1）的分泌，进一步探讨其对糖尿病肾间质纤维化的作用，为其临床应用提供实验依据。
1 实验材料
1.1 细胞株
HK-2购于上海斯信生物科技有限公司。
1.2 动物
雄性SPF级Wistar大鼠20只，体质量（200±20）g，购于甘肃中医学院动物中心，动物许可证号：SCXK（甘）2004-0006。
1.3 药物与主要试剂
糖肾康胶囊由黄芪、生地黄、槐米、益母草等组成，药材由甘肃省中医院药剂科提供，用时水提醇沉。1640细胞培养基、胎牛血清（Gibco）；人MMP-9、TIMP-1 酶联免疫吸附试验试剂盒（上海晶天生物科技有限公司）；D-葡萄糖（汕头西陇化工股份有限公司），配制浓度为30 mmol/L[4]。 1.4 仪器
CO2培养箱（SANYO MCO-18AIC，日本），超净生物安全柜（苏净安泰SW-CJ-2FD，中国），倒置显微镜（Olympus IX51，日本），酶标仪（Labsystems Multiskan MS 352型，芬兰）。
2 实验方法
2.1 糖肾康药物血清制备
大鼠饲养于甘肃省中医药研究院中药研究所动物室，普通饲料喂养，随机分为空白组、中药组，每组10只。中药组按成人临床用量的6.5倍给予糖肾康灌胃，空白组灌服等容积生理盐水，每次1 mL/100 g体质量，上下午各1次，连续3 d。末次灌胃前8 h禁食不禁水，30 min后股动脉采血，静置2 h后3000 r/min冷冻离心20 min，取上清液，-20 ℃保存。
2.2 细胞培养与分组
HK-2用含10%胎牛血清的1640培养基培养于37 ℃、5%CO2细胞培养箱中。每隔1～2 d换新鲜培养基1次，培养融合至80%以上，用含0.25%胰蛋白酶、0.05%EDTA消化液消化后，用新鲜培养基将细胞重悬后进行传代培养。实验前用无血清培养基培养24 h使细胞同步化，实验重复3次。
细胞分为6组。空白组：1640培养液；高糖诱导组：1640培养液+30 mmol/L D-葡萄糖；对照组：1640培养液+30 mmol/L D-葡萄糖+10%空白血清；糖肾康低剂量组：1640培养液+30 mmol/L D-葡萄糖+5%糖肾康药物血清；糖肾康中剂量组：1640培养液+30 mmol/L D-葡萄糖+10%糖肾康药物血清；糖肾康高剂量组：1640培养液+30 mmol/L D-葡萄糖+20%糖肾康药物血清。
2.3 基质金属蛋白酶-9及其抑制剂-1检测
细胞接种于24孔板，每孔1 mL，每组2个复孔，培养过夜。按分组加入含相应浓度药物的培养液，每孔1 mL。于24、48 h收集细胞上清液，4 ℃、2000 r/min离心20 min，取上清液，-20 ℃保存待测。按照酶联免疫吸附试验试剂盒说明书进行检测。取出细胞上清液，在试剂盒包被反应条，每孔加入不同质量浓度的标准品或待测标本，空白对照孔加稀释液100 μL，37 ℃孵育、洗涤、加酶标抗体和终止反应。在酶标仪450 nm处，以空白对照孔调零，直接测定各孔OD值及样品浓度值。
3 统计学方法
采用SPSS13.0统计软件进行分析。实验数据用—x±s表示，组间比较采用方差分析。P<0.05表示差异有统计学意义。
4 结果
HK-2经高糖诱导24、48 h后，TIMP-1分泌显著增加，MMP-9分泌有所减少，与空白组比较差异有统计学意义（P<0.05）；经糖肾康药物血清干预后，TIMP-1分泌开始减少，48 h时效果更为显著，糖肾康各剂量组与高糖诱导组比较差异均有统计学意义（P<0.05）；24 h时糖肾康对MMP-9的作用不如预期，这可能与药物的作用时间较短有关，48 h时糖肾康中、高剂量组对MMP-9的作用明显，差异有统计学意义（P<0.05）。结果见表1、表2。
5 讨论
现代医学认为，糖尿病患者肾功能损害与肾小管间质病变的严重程度密切相关，其病理学特征为肾小管细胞外基质（ECM）积聚、间质纤维化。一般情况下炎症、损伤、细胞因子、高糖、终末糖基化产物均可诱导肾间质纤维化。由于肾间质纤维化的程度与肾功能受损的程度密切相关，而且早期肾间质纤维化可完全逆转，因此近来的研究已集中于肾间质纤维化的分子学发病机制。目前已发现许多促纤维化分子，如TIMPs、转化生长因子-β1、结缔组织生长因子等；同时也发现许多抗纤维化分子，如MMPs、骨形态发生蛋白-7、肝细胞生长因子等[5]。鉴于纤维化的发展与细胞因子网络关系密切，调控纤维化因子的正常表达将成为防治纤维化的一条新途径。
MMPs是一类锌离子依赖内肽酶家族，是维持体内正常代谢和重塑所必须的酶。生理情况下，MMPs表达受到平衡控制，负责体内组织重建、胚胎形成、伤口愈合、血管生成、骨质吸收等。但在特殊情况下，如肿瘤发生、器官纤维化时，MMPs会异常表达。MMP-9也称明胶酶B，是MMPs中分子质量最大的酶。MMP-9以酶原的形式分泌，需在激活剂的作用下脱去前肽才具有活性，它可降解多种底物，包括Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅹ、Ⅺ型胶原，蛋白聚糖的核心蛋白、明胶、纤维黏连蛋白、层黏连蛋白、弹性蛋白等多种ECM成分。TIMPs是MMPs天然抑制剂，TIMPs的主要功能是调节MMPs的分泌及活性，目前发现有4个成员（TIMP1～4）。TIMP-1作为MMP-9的生理抑制剂，与MMP-9以共价键的形式结合形成酶原复合物而特异性抑制MMP-9的活性，被认为在纤维化中发挥重要作用[6]。
糖尿病肾病属中医“消渴”范畴，其基本病机特点为本虚标实。本虚指阴虚、阳虚、气虚、血虚、肝虚、心虚、脾虚、肺虚、肾虚，标实即痰浊、水湿、瘀血。本虚与标实互为因果，相互为病。如《圣济总录》云：“消渴病久，肾气受伤，肾主水，肾气虚衰，气化失常，开阖不利，水液凝聚体内而出现水肿。”本研究所选糖肾康有益气养阴、清热祛湿、活血化瘀之功效，组方符合糖尿病肾病本虚标实之病机。
本研究主要观察了糖肾康对高糖环境下HK-2纤维化因子MMP-9和TIMP-1的作用。研究发现，HK-2在高糖刺激后促纤维化分子TIMP-1的分泌显著上升，而抗纤维化分子MMP-9的分泌减少，与空白组比较差异明显，说明高糖可以引起纤维化因子失衡，同时在一定程度上也说明TIMP-1对MMP-9的活性抑制；经糖肾康干预后，TIMP-1分泌开始下降，而MMP-9分泌逐渐增多，与高糖诱导组比较差异有统计学意义，说明糖肾康能够调控纤维化因子TIMP-1和MMP-9的平衡，有效阻止纤维化的进一步发展。
参考文献：
[1] 李能娟，李红.肾小管上皮细胞表型转化与糖尿病肾病[J].国际内分泌代谢杂志，2006，26（4）：277-279.
[2] 张东鹏，张定华，王晓晖.糖肾康胶囊对早期糖尿病肾病患者血浆内皮素-1、尿微量白蛋白的影响[J].中华实用中西医杂志，2010，23（3）：16-18.
[3] 杨丽霞.刘铜华教授中医诊治糖尿病肾病的学术思想[J].国际中医中药杂志，2008，30（5）：385-386.
[4] 凌光辉，唐文彬，孙林，等.Smad锚着蛋白在高糖诱导人肾小管上皮细胞细胞外基质沉积中的作用[J].肾脏病与透析肾移植杂志，2012，21（4）：346-352.
[5] 宋小乐.TGF-β1/Smad信号转导通路对肾间质纤维化的影响[J].南昌大学学报：医学版，2011，51（6）：92-95.
[6] 李芳，王文林.MMP-9和TIMP-1及其在肺纤维化中的作用[J].中国病原生物学杂志，2011，6（12）：935-938.
（收稿日期：2014-05-20；编辑：华强）
关键词：糖肾康；高糖；人肾小管上皮细胞；基质金属蛋白酶-9；基质金属蛋白酶抑制剂-1
Abstract：Objective To explore the mechanism of Tangshenkang in the prevention and treatment of diabetic nephropathy. Methods HK-2 cells were cultured in vitro and divided into control group， high glucose group （30 mmol/L D-glucose）， control group （30 mmol/L D-glucose+10% animal serum）， and Tangshenkang drug-containing serum therapy groups （30 mmol/L D-glucose+5% low concentration Tangshenkang， 30 mmol/L D-glucose+10% middle concentration Tangshenkang， 30 mmol/L D-glucose+20% high concentration Tangshenkang）. After 24 h and 48 h treatment， MMP-9 and TIMP-1 in cell cultural supernatant were observed by ELISA. Results MMP-9 of HK-2 cultured with high glucose was much decreased and TIMP-1 increased significantly than the control group， with statistical significance （P<0.05）. TIMP-1 significantly decreased and MMP-9 increased in HK-2 cultured with high glucose plus Tangshenkang compared with those only induced by high glucose， with statistical significance （P<0.05）. Conclusion Tangshenkang could regulate the secretion of fibrosis cell factor of HK-2 cell induced by high glucose， which may be one of the mechanisms in its treatment of diabetic nephropathy.
Key words：Tangshenkang；high glucose；human renal tubular epithelial cell；MMP-9；TIMP-1
糖尿病肾病是糖尿病常见的慢性微血管并发症之一，其发病机制尚不清楚。近年来研究发现，肾小管病变引起的间质纤维化与糖尿病肾病关系密切，故肾间质纤维化的干预在糖尿病肾病的治疗中越来越受到重视，肾间质纤维化的形成与多种纤维化细胞因子相互作用有关[1]。因此，调节纤维化细胞因子的正常表达在一定程度上能够抑制纤维化的发展。糖肾康是甘肃省中医院临床经验方，具有益气养阴、清热祛湿、活血化瘀的功效。前期研究结果表明，糖肾康能够改善2型糖尿病患者血流变学指标、减少尿微量白蛋白和24 h尿蛋白定量，对糖尿病肾病具有一定的治疗作用[2]。本研究在此基础上，结合北京中医药大学刘铜华教授治疗糖尿病肾病的学术思想[3]，对组方进行了优化，通过观察糖肾康干预高糖诱导体外培养人肾小管上皮细胞（HK-2）纤维化因子基质金属蛋白酶-9 （MMP-9）及其抑制剂-1（TIMP-1）的分泌，进一步探讨其对糖尿病肾间质纤维化的作用，为其临床应用提供实验依据。
1 实验材料
1.1 细胞株
HK-2购于上海斯信生物科技有限公司。
1.2 动物
雄性SPF级Wistar大鼠20只，体质量（200±20）g，购于甘肃中医学院动物中心，动物许可证号：SCXK（甘）2004-0006。
1.3 药物与主要试剂
糖肾康胶囊由黄芪、生地黄、槐米、益母草等组成，药材由甘肃省中医院药剂科提供，用时水提醇沉。1640细胞培养基、胎牛血清（Gibco）；人MMP-9、TIMP-1 酶联免疫吸附试验试剂盒（上海晶天生物科技有限公司）；D-葡萄糖（汕头西陇化工股份有限公司），配制浓度为30 mmol/L[4]。 1.4 仪器
CO2培养箱（SANYO MCO-18AIC，日本），超净生物安全柜（苏净安泰SW-CJ-2FD，中国），倒置显微镜（Olympus IX51，日本），酶标仪（Labsystems Multiskan MS 352型，芬兰）。
2 实验方法
2.1 糖肾康药物血清制备
大鼠饲养于甘肃省中医药研究院中药研究所动物室，普通饲料喂养，随机分为空白组、中药组，每组10只。中药组按成人临床用量的6.5倍给予糖肾康灌胃，空白组灌服等容积生理盐水，每次1 mL/100 g体质量，上下午各1次，连续3 d。末次灌胃前8 h禁食不禁水，30 min后股动脉采血，静置2 h后3000 r/min冷冻离心20 min，取上清液，-20 ℃保存。
2.2 细胞培养与分组
HK-2用含10%胎牛血清的1640培养基培养于37 ℃、5%CO2细胞培养箱中。每隔1～2 d换新鲜培养基1次，培养融合至80%以上，用含0.25%胰蛋白酶、0.05%EDTA消化液消化后，用新鲜培养基将细胞重悬后进行传代培养。实验前用无血清培养基培养24 h使细胞同步化，实验重复3次。
细胞分为6组。空白组：1640培养液；高糖诱导组：1640培养液+30 mmol/L D-葡萄糖；对照组：1640培养液+30 mmol/L D-葡萄糖+10%空白血清；糖肾康低剂量组：1640培养液+30 mmol/L D-葡萄糖+5%糖肾康药物血清；糖肾康中剂量组：1640培养液+30 mmol/L D-葡萄糖+10%糖肾康药物血清；糖肾康高剂量组：1640培养液+30 mmol/L D-葡萄糖+20%糖肾康药物血清。
2.3 基质金属蛋白酶-9及其抑制剂-1检测
细胞接种于24孔板，每孔1 mL，每组2个复孔，培养过夜。按分组加入含相应浓度药物的培养液，每孔1 mL。于24、48 h收集细胞上清液，4 ℃、2000 r/min离心20 min，取上清液，-20 ℃保存待测。按照酶联免疫吸附试验试剂盒说明书进行检测。取出细胞上清液，在试剂盒包被反应条，每孔加入不同质量浓度的标准品或待测标本，空白对照孔加稀释液100 μL，37 ℃孵育、洗涤、加酶标抗体和终止反应。在酶标仪450 nm处，以空白对照孔调零，直接测定各孔OD值及样品浓度值。
3 统计学方法
采用SPSS13.0统计软件进行分析。实验数据用—x±s表示，组间比较采用方差分析。P<0.05表示差异有统计学意义。
4 结果
HK-2经高糖诱导24、48 h后，TIMP-1分泌显著增加，MMP-9分泌有所减少，与空白组比较差异有统计学意义（P<0.05）；经糖肾康药物血清干预后，TIMP-1分泌开始减少，48 h时效果更为显著，糖肾康各剂量组与高糖诱导组比较差异均有统计学意义（P<0.05）；24 h时糖肾康对MMP-9的作用不如预期，这可能与药物的作用时间较短有关，48 h时糖肾康中、高剂量组对MMP-9的作用明显，差异有统计学意义（P<0.05）。结果见表1、表2。
5 讨论
现代医学认为，糖尿病患者肾功能损害与肾小管间质病变的严重程度密切相关，其病理学特征为肾小管细胞外基质（ECM）积聚、间质纤维化。一般情况下炎症、损伤、细胞因子、高糖、终末糖基化产物均可诱导肾间质纤维化。由于肾间质纤维化的程度与肾功能受损的程度密切相关，而且早期肾间质纤维化可完全逆转，因此近来的研究已集中于肾间质纤维化的分子学发病机制。目前已发现许多促纤维化分子，如TIMPs、转化生长因子-β1、结缔组织生长因子等；同时也发现许多抗纤维化分子，如MMPs、骨形态发生蛋白-7、肝细胞生长因子等[5]。鉴于纤维化的发展与细胞因子网络关系密切，调控纤维化因子的正常表达将成为防治纤维化的一条新途径。
MMPs是一类锌离子依赖内肽酶家族，是维持体内正常代谢和重塑所必须的酶。生理情况下，MMPs表达受到平衡控制，负责体内组织重建、胚胎形成、伤口愈合、血管生成、骨质吸收等。但在特殊情况下，如肿瘤发生、器官纤维化时，MMPs会异常表达。MMP-9也称明胶酶B，是MMPs中分子质量最大的酶。MMP-9以酶原的形式分泌，需在激活剂的作用下脱去前肽才具有活性，它可降解多种底物，包括Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅹ、Ⅺ型胶原，蛋白聚糖的核心蛋白、明胶、纤维黏连蛋白、层黏连蛋白、弹性蛋白等多种ECM成分。TIMPs是MMPs天然抑制剂，TIMPs的主要功能是调节MMPs的分泌及活性，目前发现有4个成员（TIMP1～4）。TIMP-1作为MMP-9的生理抑制剂，与MMP-9以共价键的形式结合形成酶原复合物而特异性抑制MMP-9的活性，被认为在纤维化中发挥重要作用[6]。
糖尿病肾病属中医“消渴”范畴，其基本病机特点为本虚标实。本虚指阴虚、阳虚、气虚、血虚、肝虚、心虚、脾虚、肺虚、肾虚，标实即痰浊、水湿、瘀血。本虚与标实互为因果，相互为病。如《圣济总录》云：“消渴病久，肾气受伤，肾主水，肾气虚衰，气化失常，开阖不利，水液凝聚体内而出现水肿。”本研究所选糖肾康有益气养阴、清热祛湿、活血化瘀之功效，组方符合糖尿病肾病本虚标实之病机。
本研究主要观察了糖肾康对高糖环境下HK-2纤维化因子MMP-9和TIMP-1的作用。研究发现，HK-2在高糖刺激后促纤维化分子TIMP-1的分泌显著上升，而抗纤维化分子MMP-9的分泌减少，与空白组比较差异明显，说明高糖可以引起纤维化因子失衡，同时在一定程度上也说明TIMP-1对MMP-9的活性抑制；经糖肾康干预后，TIMP-1分泌开始下降，而MMP-9分泌逐渐增多，与高糖诱导组比较差异有统计学意义，说明糖肾康能够调控纤维化因子TIMP-1和MMP-9的平衡，有效阻止纤维化的进一步发展。
参考文献：
[1] 李能娟，李红.肾小管上皮细胞表型转化与糖尿病肾病[J].国际内分泌代谢杂志，2006，26（4）：277-279.
[2] 张东鹏，张定华，王晓晖.糖肾康胶囊对早期糖尿病肾病患者血浆内皮素-1、尿微量白蛋白的影响[J].中华实用中西医杂志，2010，23（3）：16-18.
[3] 杨丽霞.刘铜华教授中医诊治糖尿病肾病的学术思想[J].国际中医中药杂志，2008，30（5）：385-386.
[4] 凌光辉，唐文彬，孙林，等.Smad锚着蛋白在高糖诱导人肾小管上皮细胞细胞外基质沉积中的作用[J].肾脏病与透析肾移植杂志，2012，21（4）：346-352.
[5] 宋小乐.TGF-β1/Smad信号转导通路对肾间质纤维化的影响[J].南昌大学学报：医学版，2011，51（6）：92-95.
[6] 李芳，王文林.MMP-9和TIMP-1及其在肺纤维化中的作用[J].中国病原生物学杂志，2011，6（12）：935-938.
（收稿日期：2014-05-20；编辑：华强）