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摘 要：世界上第一个药品生产质量管理规范（GMP）1962年在美国诞生，我国于1988年3月17日公布了《药品生产质量管理规范》，2010年10月19日经卫生部部务会议审议通过，自2011年3月1日起施行《药品生产质量管理规范（2010年修订）》。新版GMP对无菌药品生产提出了严格要求，非最终灭菌原料药无菌工艺需要采用模拟验证来评估该工艺的保证能力。本文对乳糖在非最终灭菌原料药无菌工艺模拟试验中的应用进行综述。
关键词：乳糖；无菌；应用
GMP是一套适用于制药的强制性标准，要求企业从原料、人员、设施设备、生产过程、包装运输、质量控制等方面按国家有关法规达到卫生质量要求，完善的质量管理和严格的检测系统，确保最终产品质量（包括食品安全卫生）符合法规要求。世界上第一个药品生产质量管理规范（GMP）1962年在美国诞生，在以后的20多年内，许多国家的政府为了维护消费者的利益和提高本国药品在国际市场的竞争力，分别制订或修订了自己的GMP[1-2]。我国于1988年3月17日公布了《药品生产质量管理规范》，2010年10月19日经卫生部部务会议审议通过，自2011年3月1日起施行《药品生产质量管理规范（2010年修订）》。新版GMP对无菌药品生产提出了严格要求，非最终灭菌原料药无菌工艺需要采用模拟验证来评估该工艺的保证能力[3-5]。本文对乳糖在非最终灭菌原料药无菌工艺模拟试验中的应用进行综述。
1 仪器与试剂
二级生物安全柜（郑州万博仪器设备有限公司）；LHS-50CH恒温恒湿试验箱（上海上天精密仪器有限公司）；MJ-500F-I生化培养箱（上海上天精密仪器有限公司）；-86℃医用超低温冰箱（济南来宝医疗器械有限公司）；YXQ-LS-100SII立式压力蒸汽灭菌器（上海鼎科科学仪器有限公司）；JA2003电子精密天平（上海鼎科科学仪器有限公司）；集菌仪智能型HTY-601（浙江泰林生物技术股份有限公司）。沙氏葡萄糖琼脂（上海江莱生物科技有限公司）；大豆酪蛋白琼脂（上海江萊生物科技有限公司）；大豆酪蛋白肉汤（上海江莱生物科技有限公司）；沙氏葡萄糖肉汤（上海江莱生物科技有限公司）；药用乳糖（上海江莱生物科技有限公司）；硫乙醇酸盐流体培养基（上海江莱生物科技有限公司）；0.05%吐温80pH 7.0氯化钠蛋白胨缓冲液（上海远慕生物科技有限公司）；乳糖（常州洋森生物科技有限公司）0.1%无菌蛋白胨水溶液（青岛拓普生物工程有限公司）；pH 7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液（上海远慕生物科技有限公司）。
2 方法
2.1 乳糖溶液的配制
将乳糖，用钴60照射灭菌，照射当量为25kGy，备用。分别称取乳糖，加入注射用水中充分溶解，混匀，最终分别获得1%，5%和7%的乳糖溶液。
2.2 乳糖溶解性试验
取15ml西林瓶3支，分别加入乳糖粉末约0.5g、0.75g、1.0g，然后加入胰蛋白胨大豆肉汤培养基10ml，在轻微振摇后观察溶解情况，溶解后培养基应清澈透明。
2.3 乳糖溶液无菌性检查
将除菌过滤后的乳糖溶液用10支经过灭菌的取样瓶瓶接取，按量加入经灭菌的胰蛋白胨大豆肉汤培养基，保证浓度不超过1.0g/10ml，使其充分溶解。所有样品于23-28℃培养7天，再于30～35℃培养7天，每天观察，并做记录.除菌过滤后的乳糖溶液应无菌生长。
2.4 乳糖溶液促生长实验
取经0.22um除菌过滤的乳糖溶液分装于16支50ml已灭菌的试管中，每试管装20毫升，在每支试管内加入胰蛋白胨大豆肉汤培养基20ml，混匀，在2支50ml试管中接种枯草芽孢杆菌，接种量<100cfu/管；在2支50ml试管中接种白色念珠菌，接种量<100cfu/管，在2支50ml试管中接种黑曲霉，接种量<100cfu/管，在2支50ml试管中接种生孢梭菌，接种量<100cfu/管，在2支50ml试管中接种金黄色葡萄球菌，接种量<100cfu/管，在2支50ml试管中接种铜绿假单胞菌，接种量<100cfu/管，剩余作为空白对照。接种后盖塞、封口并分别在30～35℃（枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、生孢梭菌、2支空白对照）和23～28℃（黑曲霉、白色念珠菌、2支空白对照）培养7天。7天内接种的各试管的胰蛋白胨大豆肉汤培养基中应出现明显的所接种的微生物的生长，且空白对照管应无菌生长则判定该培养基微生物性能生长试验符合要求规定。
2.5 培养基微生物性能和无菌性试验
2.5.1 培养基微生物性能实验
取装有4ml培养基的已灭菌的管制注射剂瓶，8支不接种作为空白对照、4支接种金黄色葡萄球菌（<100cfu）、4支接种铜绿假单胞菌（<100cfu）、4支接种生孢梭菌（<100cfu）、4支接种枯草芽孢杆菌（<100cfu）、4支接种白色念珠菌（<100cfu），分别在相应的条件培养，每天观察并记录。
2.5.2 培养基无菌性试验
实验前，取培养基4ml装于已灭菌的管制注射剂瓶中压盖密封，按照此方法取20个样依次做好标记，其中18支为阴性实验，2支接种金黄色葡萄球菌（<100cfu）作阳性对照，所有样品于20～25℃培养7天，再于30～35℃培养7天，每天观察，并做记录.培养基无菌性试验：阴性实验应无菌生长，阳性对照实验应有菌生长。
3 乳糖溶液模拟罐装无菌验证
将乳糖溶液经过除菌滤芯过滤进入生产区，进行无菌工艺模拟试验后，分别在硫乙醇酸盐液体培养基30～35℃和大豆酪蛋白肉汤培养基20～25℃下连续培养14天，每天观察并记录培养室温湿度、同时观察记录培养情况，最后统计污染数。结果均呈阴性，说明取样点的无菌检验通过，无菌挑战成功。
参考文献
[1]余超，高菁，田克仁，周鹃，万凯化，李穗，袁兴东.江西省药品生产企业人员药品安全性监测技术管理及风险干预的长效机制研究[J].中国药物依赖性杂志，2014（3）.
[2]邓志华，徐胜东，祁型婵.谈药品生产企业《药品生产质量管理规范》认证的帮促措施[J].时珍国医国药，2004（2）.
[3]夏振华，薛苏栋.新版《药品生产质量管理规范》（GMP专家修订稿）解析[J].药学与临床研究，2010（3）.
[4]申丽莎，胡启飞，陈国庆.药品生产质量管理规范（GMP）在我国的实施与展望[J].重庆中草药研究，2010（1）.
[5]柯华东.新建头孢无菌原料药生产设施如何符合2010版GMP要求的关键几个问题讨论[J].医药工程设计，2012（1）.
关键词：乳糖；无菌；应用
GMP是一套适用于制药的强制性标准，要求企业从原料、人员、设施设备、生产过程、包装运输、质量控制等方面按国家有关法规达到卫生质量要求，完善的质量管理和严格的检测系统，确保最终产品质量（包括食品安全卫生）符合法规要求。世界上第一个药品生产质量管理规范（GMP）1962年在美国诞生，在以后的20多年内，许多国家的政府为了维护消费者的利益和提高本国药品在国际市场的竞争力，分别制订或修订了自己的GMP[1-2]。我国于1988年3月17日公布了《药品生产质量管理规范》，2010年10月19日经卫生部部务会议审议通过，自2011年3月1日起施行《药品生产质量管理规范（2010年修订）》。新版GMP对无菌药品生产提出了严格要求，非最终灭菌原料药无菌工艺需要采用模拟验证来评估该工艺的保证能力[3-5]。本文对乳糖在非最终灭菌原料药无菌工艺模拟试验中的应用进行综述。
1 仪器与试剂
二级生物安全柜（郑州万博仪器设备有限公司）；LHS-50CH恒温恒湿试验箱（上海上天精密仪器有限公司）；MJ-500F-I生化培养箱（上海上天精密仪器有限公司）；-86℃医用超低温冰箱（济南来宝医疗器械有限公司）；YXQ-LS-100SII立式压力蒸汽灭菌器（上海鼎科科学仪器有限公司）；JA2003电子精密天平（上海鼎科科学仪器有限公司）；集菌仪智能型HTY-601（浙江泰林生物技术股份有限公司）。沙氏葡萄糖琼脂（上海江莱生物科技有限公司）；大豆酪蛋白琼脂（上海江萊生物科技有限公司）；大豆酪蛋白肉汤（上海江莱生物科技有限公司）；沙氏葡萄糖肉汤（上海江莱生物科技有限公司）；药用乳糖（上海江莱生物科技有限公司）；硫乙醇酸盐流体培养基（上海江莱生物科技有限公司）；0.05%吐温80pH 7.0氯化钠蛋白胨缓冲液（上海远慕生物科技有限公司）；乳糖（常州洋森生物科技有限公司）0.1%无菌蛋白胨水溶液（青岛拓普生物工程有限公司）；pH 7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液（上海远慕生物科技有限公司）。
2 方法
2.1 乳糖溶液的配制
将乳糖，用钴60照射灭菌，照射当量为25kGy，备用。分别称取乳糖，加入注射用水中充分溶解，混匀，最终分别获得1%，5%和7%的乳糖溶液。
2.2 乳糖溶解性试验
取15ml西林瓶3支，分别加入乳糖粉末约0.5g、0.75g、1.0g，然后加入胰蛋白胨大豆肉汤培养基10ml，在轻微振摇后观察溶解情况，溶解后培养基应清澈透明。
2.3 乳糖溶液无菌性检查
将除菌过滤后的乳糖溶液用10支经过灭菌的取样瓶瓶接取，按量加入经灭菌的胰蛋白胨大豆肉汤培养基，保证浓度不超过1.0g/10ml，使其充分溶解。所有样品于23-28℃培养7天，再于30～35℃培养7天，每天观察，并做记录.除菌过滤后的乳糖溶液应无菌生长。
2.4 乳糖溶液促生长实验
取经0.22um除菌过滤的乳糖溶液分装于16支50ml已灭菌的试管中，每试管装20毫升，在每支试管内加入胰蛋白胨大豆肉汤培养基20ml，混匀，在2支50ml试管中接种枯草芽孢杆菌，接种量<100cfu/管；在2支50ml试管中接种白色念珠菌，接种量<100cfu/管，在2支50ml试管中接种黑曲霉，接种量<100cfu/管，在2支50ml试管中接种生孢梭菌，接种量<100cfu/管，在2支50ml试管中接种金黄色葡萄球菌，接种量<100cfu/管，在2支50ml试管中接种铜绿假单胞菌，接种量<100cfu/管，剩余作为空白对照。接种后盖塞、封口并分别在30～35℃（枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、生孢梭菌、2支空白对照）和23～28℃（黑曲霉、白色念珠菌、2支空白对照）培养7天。7天内接种的各试管的胰蛋白胨大豆肉汤培养基中应出现明显的所接种的微生物的生长，且空白对照管应无菌生长则判定该培养基微生物性能生长试验符合要求规定。
2.5 培养基微生物性能和无菌性试验
2.5.1 培养基微生物性能实验
取装有4ml培养基的已灭菌的管制注射剂瓶，8支不接种作为空白对照、4支接种金黄色葡萄球菌（<100cfu）、4支接种铜绿假单胞菌（<100cfu）、4支接种生孢梭菌（<100cfu）、4支接种枯草芽孢杆菌（<100cfu）、4支接种白色念珠菌（<100cfu），分别在相应的条件培养，每天观察并记录。
2.5.2 培养基无菌性试验
实验前，取培养基4ml装于已灭菌的管制注射剂瓶中压盖密封，按照此方法取20个样依次做好标记，其中18支为阴性实验，2支接种金黄色葡萄球菌（<100cfu）作阳性对照，所有样品于20～25℃培养7天，再于30～35℃培养7天，每天观察，并做记录.培养基无菌性试验：阴性实验应无菌生长，阳性对照实验应有菌生长。
3 乳糖溶液模拟罐装无菌验证
将乳糖溶液经过除菌滤芯过滤进入生产区，进行无菌工艺模拟试验后，分别在硫乙醇酸盐液体培养基30～35℃和大豆酪蛋白肉汤培养基20～25℃下连续培养14天，每天观察并记录培养室温湿度、同时观察记录培养情况，最后统计污染数。结果均呈阴性，说明取样点的无菌检验通过，无菌挑战成功。
参考文献
[1]余超，高菁，田克仁，周鹃，万凯化，李穗，袁兴东.江西省药品生产企业人员药品安全性监测技术管理及风险干预的长效机制研究[J].中国药物依赖性杂志，2014（3）.
[2]邓志华，徐胜东，祁型婵.谈药品生产企业《药品生产质量管理规范》认证的帮促措施[J].时珍国医国药，2004（2）.
[3]夏振华，薛苏栋.新版《药品生产质量管理规范》（GMP专家修订稿）解析[J].药学与临床研究，2010（3）.
[4]申丽莎，胡启飞，陈国庆.药品生产质量管理规范（GMP）在我国的实施与展望[J].重庆中草药研究，2010（1）.
[5]柯华东.新建头孢无菌原料药生产设施如何符合2010版GMP要求的关键几个问题讨论[J].医药工程设计，2012（1）.