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摘 要：文章首先归纳了重要的世界性检疫害虫-桔小实蝇的分布与为害等生物生态学特性，如其目前分布于中国的湖南、广东、广西、贵州、福建、四川、海南、云南、台湾等省份或地区，为害近300种果蔬植物，主要为害果实，世代相互重叠，具有群集取食的习性。接着从形态鉴定检测、声波检测及分子检测3个方面概述了近年来桔小实蝇的检测方法研究的发展趋势及各检测方法的优缺点，提出了为适应水果进出口贸易快速通关的大局进一步开展对桔小实蝇检测鉴定新技术研究的迫切需要，最后提出了关于桔小实蝇研究的热点问题，如生态适应规律及机制、扩散途径及机制、可持续控制措施等。
关键词：桔小实蝇；检测方法；声波；DNA条形码
中图分类号：Q966 文献标志码：A 论文编号：2013-0269
Abstract： Bactrocera dorsalis Hendel （Diptera： Tephritidae） is an invasive pest. Owing to its potential damages and rapid spread， it has been considered as an important quarantine pest in China. For improving the precaution of this invasive pest by all kinds of people， the biology and ecology of this pest were been introduced in this paper. At present， B. dorsalis have been found in many counts and provinces of China， such as Hunan， Guangdong， Guangxi， Guizhou， Fujian， Sichuan， Hainan， Yunnan and Taiwan. This pest is a polyphagous pest， which indicated that there were 300 host plants of them. Merit and demerit and development tendency of the detection method about B. dorsalis have been concluded from 3 methods just following： morphological identification， acoustic detection， molecular detection. And the developed current about this insect pest has been discussed at last of paper， including ecological adapted regular pattern and mechanism， diffusion path and mechanism， sustainable controlling methods and so on.
Key words： Bactrocera dorsalis （Hendel）； Detection Method； Sound Wave； DNA Barcode
0 引言
桔小实蝇是一种寄主范围广泛、危害严重的世界性检疫害虫，其幼虫在果实中发育，对水果生产会造成毁灭性灾害。为保护中国的农业生产和生态安全，必须制定严格的检验检疫制度和防除措施，以防止桔小实蝇的传播，而检测方法则是影响水果进出口贸易通关速度和时间的关键，因此对其检测方法的研究极其重要。笔者综述了近年来桔小实蝇在检测方面的研究进展情况，旨在为桔小实蝇检测新方法的进一步研究开发提供一些参考。
1 桔小实蝇的分布
桔小实蝇[Bactrocera dorsalis （Hendel）]亦名黄苍蝇、东方果实蝇、果蛆，隶属双翅目（Diptera）、实蝇科（Tephritidae）、寡鬃实蝇亚科（Dacinae）、果实蝇属（Bactrocera）。该害虫最先产于亚洲的热带和亚热带地区，而印度早在1916年已有报道[1]，1945年该虫传入夏威夷群岛，目前已广泛分布在亚洲以及环太平洋的多数国家和地区[2]，中国、东南亚、印度次大陆、夏威夷群岛等均有该虫的分布为害。中国于1911年首次在台湾发现该实蝇[3]，1937年谢蕴贞报道中国大陆有该虫的记录。目前该虫主要分布于湖南、广东、广西、贵州、福建、四川、海南、云南、台湾等省份或地区[4-7]，在华中和华南地区已造成了严重危害。
桔小实蝇是一种寄主广泛、危害严重的世界性检疫害虫，该虫可为害46个科250多种植物[8]，给中国及许多国家和地区的农业生产造成了很严重的经济损失。因此，世界上许多国家和地区都把该虫列为重要的检疫对象，在中国其被列为二类危险性害虫[9]。随着全球气候变暖，桔小实蝇的分布范围会逐渐扩大[10]，在国内的扩散呈自南向北扩散的趋势[11]。同时随着国内和国际贸易的日益发展和频繁，桔小实蝇的入侵扩散途径不再局限于自然状态下的扩散为害，它会随着果蔬植物的调运入侵扩散到新的区域造成为害。
2 生物生态学特性
据报道，桔小实蝇可为害柑桔、柚子、芒果、枇杷、甜橙、番石榴、葡萄、桃、李、番茄、杨桃、石榴、辣椒、香蕉、茄子、苦瓜等近300种果蔬植物，其常常造成瓜果腐烂，被称为瓜果的“头号杀手”。此虫主要为害果实，具有群集取食的习性。成虫产卵时，在果实的表面先形成伤口，致使汁液大量溢出，然后产卵孔处就开始慢慢腐烂[9]。同时，产卵时形成的伤口很容易导致病原微生物入侵；卵产于果皮下，幼虫孵化后即可钻人果实内取食，严重时可导致果实组织软化至腐烂，造成大量的落果，为害轻微时，致使果品品质等级降低[12]。 桔小实蝇每年发生3～6代，多数地区以第3代为主害代，无严格的越冬过程；世代相互重叠，各世代发生不整齐，同一时期可见各种虫态。成虫一年四季均可以在野外活动，雌虫对甲基丁香酚有趋向性，可利用此特性引诱雌成虫[9，12-13]。
3 检测方法
3.1 形态鉴定检测
早期对桔小实蝇的鉴定主要应用传统的成虫形态鉴定方法。而通常口岸或其他渠道截获的大部分是幼虫或卵，通常的做法是室内饲养获得成虫后，再进行形态鉴定。
形态鉴定具有快速、简便和经济等特点，但同时也有局限性。尤其在鉴别或区分实蝇类害虫的近似种时，要求害虫具备完整的形态结构，同时操作人员需具备丰富的鉴定实践经验和专业技能[14]。而形态分类上某些重要特征同时存在表型可塑性和基因可变性，形态上的同形种（种间的形态特征完全一致，但是基因差异显著的几个物种的总称）通常不能通过常规的形态鉴定的来进行区别[15]。同时形态鉴定只能借助成虫的形态特征，才能准确鉴定到种。实际上口岸截获的实蝇多数为未成熟虫态（卵、幼虫或蛹），饲养到成虫需要较长的时间，实蝇形态鉴定的周期一般情况下约需15～25天，检测周期较长，因此传统的成虫形态鉴定并不利于口岸快速检验通关的实际需求。
3.2 声波检测
不同的声波频谱特征反映了各种虫声所特有的信息，20世纪80年代，中外部分学者曾开展过应用声波检测害虫的研究。美国农业研究的科学家于1985年提出了一种新的检测方法，通过组装一系列的中间装置，使扬声器最终传出果实内感染实蝇幼虫取食与活动的声音，输入不同声音信息，应用单片微机处理，贮存，识别，显示与自动控制系统检测，在几秒钟内即可检测出来[16]。Litzcow[17]设计与发展了具有1个或几个听诊器探头的工具，通过探测昆虫响声而确定商品柑桔、坚果、谷粒是否受害虫侵染。邱友德等[18]通过对芒果内桔小实蝇幼虫为害声波进行测试录音，将这些录音虫声进行频谱分比较，从已得出的蜜柑大实蝇幼虫为害声2个样本频谱分析显示出一定的模式。邱友德初步试验表明，应用探测器可探测到芒果中海地西印度实蝇与德州墨西哥实蝇幼虫的取食声，并能准确地用来探测各种实蝇幼虫在芒果中取食的颤动声。
声波检测中关于器械灵敏度与抗外界噪声干扰的矛盾问题，一直成为该技术发展的一个瓶颈。在灵敏度太高时，稍有声音传入，感应可很快显示，各种干扰信号也同时输入，从指示器上很难区别干扰信号与害虫声波之间的差异；而如果灵敏度太低，又不利于检测目标物的信号[19]。幼虫混合振动信号具有较大的随机性和变异性，规律性不强，采用常规示波技术难以进行比较和得出定量的结论[20]。由于诸多因素，该技术后来一直没有广泛推广应用。
3.3 分子检测
害虫的分子鉴定具有快速、准确、客观和对样品要求低等诸多特点，可对形态鉴定起补充作用。分子检测鉴定实蝇类害虫的方法很多，各有千秋[21]。从20世纪80年代开始，分子生物学的飞速发展使分子遗传标记（molecular genetic marker）技术层出不穷。同时，PCR（DNA聚合酶链反应）技术的发展以及用于分析遗传数据的相关计算机应用软件和统计方法的开发应用，大大推动了分子遗传标记技术在昆虫分类学、遗传学、系统学、生态学等多学科多领域的应用，同时也促进了害虫分子鉴定的发展。
分子检测周期短速度快，尤其不受靶标的形态、性状、大小等方面的影响，如在昆虫鉴定中不受虫态、数量、个体间性状差异及材料完整度的限制（如个体的残缺）等因素的限制[21]，如Muraji等[23]从实蝇的腿节和很少的个体残肢中提取DNA，成功地进行PCR扩增反应，通过基因序列分析，保存了实蝇材料的完整。
关于桔小实蝇分子的鉴定检测，国内外学者也开展了许多研究。He等[24]曾对夏威夷和泰国两国的桔小实蝇种群进行了鉴别研究，他们利用2个室内种群和3个野生种群，运用PCR扩增技术和EPIC技术，针对不同种群个体间肌动蛋白基因内含子序列进行了分析检测，通过测序比对发现，3个等位基因在5个种群中存在频率不同，他们用限制酶切技术对不同种群的非等位基因也进行了分析研究。Lu-KH等[21]利用RAPD技术从实蝇类害虫中找出特异带，并对特异带进行筛选、纯化、测序，然后根据序列设计特异引物来区分桔小实蝇、瓜实蝇和南瓜实蝇等几类实蝇类害虫。张亮等[25]筛选得出的5个引物对桔小实蝇及其幼虫以及番石榴实蝇及其幼虫的基因组DNA扩增结果基本一致，所建立的指纹图谱可以作为6个种各虫态的鉴定依据，试验结果稳定、可靠，可对6种实蝇近缘种类进行鉴定区分。孔秋莲等[26]利用特异性嵌套式PCR引物对桔小实蝇的rDNA基因片段进行扩增，通过进一步序列分析，确定该虫与其近缘种的关系，并能确定样本的种属关系，该试验建立的分子鉴定体系，可应用于口岸微量桔小实蝇卵快速、准确检验。张红梅等[27]用RAPD技术对陕西省常见的4种实蝇进行了研究，试验筛选出的5种RAPD引物S61、S107、S126、S275、S1142，可以对4种实蝇基因组DNA扩增出稳定清晰的多态性片段，其中RAPD引物S126可以把南瓜实蝇和具条实蝇、具条实蝇和三点棍腹实蝇分开，利用UPGMA法聚类后构建的发育系统树与传统分类结果完全一致。以上研究结果对开发桔小实蝇快速可靠的分子检测新技术提供了很好的参考作用。
DNA条形码技术（DNA barcoding）是通过对标准目的基因DNA序列的分析来进行物种鉴定的技术[28]。2003年，加拿大动物学家Hebert[29]首次将DNA条形码概念引入了生物界。DNA条形码，也称DNA条形编码，其类似于超市商品包装上用于识别商品的粗细、间隔不同的黑白条纹图案，是一段长度约为650 bp的线粒体基因片段，线粒体细胞色素C氧化酶亚基I （Cytochrome C oxidase I， COI）的前部。它普遍存在于所有的有氧生物，参与生物的有氧呼吸和能量生产过程，其进化速率适中，因此被广泛应用于节肢动物包括大多数昆虫的分类鉴定[30-31]。为了弥补昆虫外部形态鉴定在检验检疫中的不足，近年来，DNA条形码技术成为快速鉴定检疫性害虫的重要手段之一，具有广泛的应用前景。目前国内尚未见到桔小实蝇DNA条形码鉴定的相关报道，然而这方面的研究目前已有许多科学家着手进行，相信不久将来就能取得很好的结果。 4 展望
当前，国内外经济贸易快速发展，为适应时局，快速、准确确认检疫对象的疫情并有效保护农作物生产任重道远，如水果的进出口发展越来越快，进一步开展对桔小实蝇的检测鉴定新技术研究对于快速通关等具有重要的意义。如何采用先进的分子技术手段研究桔小实蝇地理种群间的遗传分化和种群亲缘关系，掌握了解该虫的生态适应规律及机制、扩散途径及机制、可持续控制措施等，成为当前倍受关注的主要热点问题，今后加快这些领域的研究对于可持续防控桔小实蝇也具有重要意义。
参考文献
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关键词：桔小实蝇；检测方法；声波；DNA条形码
中图分类号：Q966 文献标志码：A 论文编号：2013-0269
Abstract： Bactrocera dorsalis Hendel （Diptera： Tephritidae） is an invasive pest. Owing to its potential damages and rapid spread， it has been considered as an important quarantine pest in China. For improving the precaution of this invasive pest by all kinds of people， the biology and ecology of this pest were been introduced in this paper. At present， B. dorsalis have been found in many counts and provinces of China， such as Hunan， Guangdong， Guangxi， Guizhou， Fujian， Sichuan， Hainan， Yunnan and Taiwan. This pest is a polyphagous pest， which indicated that there were 300 host plants of them. Merit and demerit and development tendency of the detection method about B. dorsalis have been concluded from 3 methods just following： morphological identification， acoustic detection， molecular detection. And the developed current about this insect pest has been discussed at last of paper， including ecological adapted regular pattern and mechanism， diffusion path and mechanism， sustainable controlling methods and so on.
Key words： Bactrocera dorsalis （Hendel）； Detection Method； Sound Wave； DNA Barcode
0 引言
桔小实蝇是一种寄主范围广泛、危害严重的世界性检疫害虫，其幼虫在果实中发育，对水果生产会造成毁灭性灾害。为保护中国的农业生产和生态安全，必须制定严格的检验检疫制度和防除措施，以防止桔小实蝇的传播，而检测方法则是影响水果进出口贸易通关速度和时间的关键，因此对其检测方法的研究极其重要。笔者综述了近年来桔小实蝇在检测方面的研究进展情况，旨在为桔小实蝇检测新方法的进一步研究开发提供一些参考。
1 桔小实蝇的分布
桔小实蝇[Bactrocera dorsalis （Hendel）]亦名黄苍蝇、东方果实蝇、果蛆，隶属双翅目（Diptera）、实蝇科（Tephritidae）、寡鬃实蝇亚科（Dacinae）、果实蝇属（Bactrocera）。该害虫最先产于亚洲的热带和亚热带地区，而印度早在1916年已有报道[1]，1945年该虫传入夏威夷群岛，目前已广泛分布在亚洲以及环太平洋的多数国家和地区[2]，中国、东南亚、印度次大陆、夏威夷群岛等均有该虫的分布为害。中国于1911年首次在台湾发现该实蝇[3]，1937年谢蕴贞报道中国大陆有该虫的记录。目前该虫主要分布于湖南、广东、广西、贵州、福建、四川、海南、云南、台湾等省份或地区[4-7]，在华中和华南地区已造成了严重危害。
桔小实蝇是一种寄主广泛、危害严重的世界性检疫害虫，该虫可为害46个科250多种植物[8]，给中国及许多国家和地区的农业生产造成了很严重的经济损失。因此，世界上许多国家和地区都把该虫列为重要的检疫对象，在中国其被列为二类危险性害虫[9]。随着全球气候变暖，桔小实蝇的分布范围会逐渐扩大[10]，在国内的扩散呈自南向北扩散的趋势[11]。同时随着国内和国际贸易的日益发展和频繁，桔小实蝇的入侵扩散途径不再局限于自然状态下的扩散为害，它会随着果蔬植物的调运入侵扩散到新的区域造成为害。
2 生物生态学特性
据报道，桔小实蝇可为害柑桔、柚子、芒果、枇杷、甜橙、番石榴、葡萄、桃、李、番茄、杨桃、石榴、辣椒、香蕉、茄子、苦瓜等近300种果蔬植物，其常常造成瓜果腐烂，被称为瓜果的“头号杀手”。此虫主要为害果实，具有群集取食的习性。成虫产卵时，在果实的表面先形成伤口，致使汁液大量溢出，然后产卵孔处就开始慢慢腐烂[9]。同时，产卵时形成的伤口很容易导致病原微生物入侵；卵产于果皮下，幼虫孵化后即可钻人果实内取食，严重时可导致果实组织软化至腐烂，造成大量的落果，为害轻微时，致使果品品质等级降低[12]。 桔小实蝇每年发生3～6代，多数地区以第3代为主害代，无严格的越冬过程；世代相互重叠，各世代发生不整齐，同一时期可见各种虫态。成虫一年四季均可以在野外活动，雌虫对甲基丁香酚有趋向性，可利用此特性引诱雌成虫[9，12-13]。
3 检测方法
3.1 形态鉴定检测
早期对桔小实蝇的鉴定主要应用传统的成虫形态鉴定方法。而通常口岸或其他渠道截获的大部分是幼虫或卵，通常的做法是室内饲养获得成虫后，再进行形态鉴定。
形态鉴定具有快速、简便和经济等特点，但同时也有局限性。尤其在鉴别或区分实蝇类害虫的近似种时，要求害虫具备完整的形态结构，同时操作人员需具备丰富的鉴定实践经验和专业技能[14]。而形态分类上某些重要特征同时存在表型可塑性和基因可变性，形态上的同形种（种间的形态特征完全一致，但是基因差异显著的几个物种的总称）通常不能通过常规的形态鉴定的来进行区别[15]。同时形态鉴定只能借助成虫的形态特征，才能准确鉴定到种。实际上口岸截获的实蝇多数为未成熟虫态（卵、幼虫或蛹），饲养到成虫需要较长的时间，实蝇形态鉴定的周期一般情况下约需15～25天，检测周期较长，因此传统的成虫形态鉴定并不利于口岸快速检验通关的实际需求。
3.2 声波检测
不同的声波频谱特征反映了各种虫声所特有的信息，20世纪80年代，中外部分学者曾开展过应用声波检测害虫的研究。美国农业研究的科学家于1985年提出了一种新的检测方法，通过组装一系列的中间装置，使扬声器最终传出果实内感染实蝇幼虫取食与活动的声音，输入不同声音信息，应用单片微机处理，贮存，识别，显示与自动控制系统检测，在几秒钟内即可检测出来[16]。Litzcow[17]设计与发展了具有1个或几个听诊器探头的工具，通过探测昆虫响声而确定商品柑桔、坚果、谷粒是否受害虫侵染。邱友德等[18]通过对芒果内桔小实蝇幼虫为害声波进行测试录音，将这些录音虫声进行频谱分比较，从已得出的蜜柑大实蝇幼虫为害声2个样本频谱分析显示出一定的模式。邱友德初步试验表明，应用探测器可探测到芒果中海地西印度实蝇与德州墨西哥实蝇幼虫的取食声，并能准确地用来探测各种实蝇幼虫在芒果中取食的颤动声。
声波检测中关于器械灵敏度与抗外界噪声干扰的矛盾问题，一直成为该技术发展的一个瓶颈。在灵敏度太高时，稍有声音传入，感应可很快显示，各种干扰信号也同时输入，从指示器上很难区别干扰信号与害虫声波之间的差异；而如果灵敏度太低，又不利于检测目标物的信号[19]。幼虫混合振动信号具有较大的随机性和变异性，规律性不强，采用常规示波技术难以进行比较和得出定量的结论[20]。由于诸多因素，该技术后来一直没有广泛推广应用。
3.3 分子检测
害虫的分子鉴定具有快速、准确、客观和对样品要求低等诸多特点，可对形态鉴定起补充作用。分子检测鉴定实蝇类害虫的方法很多，各有千秋[21]。从20世纪80年代开始，分子生物学的飞速发展使分子遗传标记（molecular genetic marker）技术层出不穷。同时，PCR（DNA聚合酶链反应）技术的发展以及用于分析遗传数据的相关计算机应用软件和统计方法的开发应用，大大推动了分子遗传标记技术在昆虫分类学、遗传学、系统学、生态学等多学科多领域的应用，同时也促进了害虫分子鉴定的发展。
分子检测周期短速度快，尤其不受靶标的形态、性状、大小等方面的影响，如在昆虫鉴定中不受虫态、数量、个体间性状差异及材料完整度的限制（如个体的残缺）等因素的限制[21]，如Muraji等[23]从实蝇的腿节和很少的个体残肢中提取DNA，成功地进行PCR扩增反应，通过基因序列分析，保存了实蝇材料的完整。
关于桔小实蝇分子的鉴定检测，国内外学者也开展了许多研究。He等[24]曾对夏威夷和泰国两国的桔小实蝇种群进行了鉴别研究，他们利用2个室内种群和3个野生种群，运用PCR扩增技术和EPIC技术，针对不同种群个体间肌动蛋白基因内含子序列进行了分析检测，通过测序比对发现，3个等位基因在5个种群中存在频率不同，他们用限制酶切技术对不同种群的非等位基因也进行了分析研究。Lu-KH等[21]利用RAPD技术从实蝇类害虫中找出特异带，并对特异带进行筛选、纯化、测序，然后根据序列设计特异引物来区分桔小实蝇、瓜实蝇和南瓜实蝇等几类实蝇类害虫。张亮等[25]筛选得出的5个引物对桔小实蝇及其幼虫以及番石榴实蝇及其幼虫的基因组DNA扩增结果基本一致，所建立的指纹图谱可以作为6个种各虫态的鉴定依据，试验结果稳定、可靠，可对6种实蝇近缘种类进行鉴定区分。孔秋莲等[26]利用特异性嵌套式PCR引物对桔小实蝇的rDNA基因片段进行扩增，通过进一步序列分析，确定该虫与其近缘种的关系，并能确定样本的种属关系，该试验建立的分子鉴定体系，可应用于口岸微量桔小实蝇卵快速、准确检验。张红梅等[27]用RAPD技术对陕西省常见的4种实蝇进行了研究，试验筛选出的5种RAPD引物S61、S107、S126、S275、S1142，可以对4种实蝇基因组DNA扩增出稳定清晰的多态性片段，其中RAPD引物S126可以把南瓜实蝇和具条实蝇、具条实蝇和三点棍腹实蝇分开，利用UPGMA法聚类后构建的发育系统树与传统分类结果完全一致。以上研究结果对开发桔小实蝇快速可靠的分子检测新技术提供了很好的参考作用。
DNA条形码技术（DNA barcoding）是通过对标准目的基因DNA序列的分析来进行物种鉴定的技术[28]。2003年，加拿大动物学家Hebert[29]首次将DNA条形码概念引入了生物界。DNA条形码，也称DNA条形编码，其类似于超市商品包装上用于识别商品的粗细、间隔不同的黑白条纹图案，是一段长度约为650 bp的线粒体基因片段，线粒体细胞色素C氧化酶亚基I （Cytochrome C oxidase I， COI）的前部。它普遍存在于所有的有氧生物，参与生物的有氧呼吸和能量生产过程，其进化速率适中，因此被广泛应用于节肢动物包括大多数昆虫的分类鉴定[30-31]。为了弥补昆虫外部形态鉴定在检验检疫中的不足，近年来，DNA条形码技术成为快速鉴定检疫性害虫的重要手段之一，具有广泛的应用前景。目前国内尚未见到桔小实蝇DNA条形码鉴定的相关报道，然而这方面的研究目前已有许多科学家着手进行，相信不久将来就能取得很好的结果。 4 展望
当前，国内外经济贸易快速发展，为适应时局，快速、准确确认检疫对象的疫情并有效保护农作物生产任重道远，如水果的进出口发展越来越快，进一步开展对桔小实蝇的检测鉴定新技术研究对于快速通关等具有重要的意义。如何采用先进的分子技术手段研究桔小实蝇地理种群间的遗传分化和种群亲缘关系，掌握了解该虫的生态适应规律及机制、扩散途径及机制、可持续控制措施等，成为当前倍受关注的主要热点问题，今后加快这些领域的研究对于可持续防控桔小实蝇也具有重要意义。
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