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[摘要]目的：研究复方中药软膏在猪断层皮创面愈合中的作用。方法：制备猪断层皮创面模型，创面深度至真皮深层，深度达真皮厚度约3/4。实验分为复方中药软膏组（A组）、斯丽凯纳米银抗菌凝胶组（B组），空白对照组（C组），创面分别用复方中药软膏、斯丽凯纳米银抗菌凝胶、生理盐水纱布覆盖，创面定量涂抹上述药物。每天一次观察三组创面的愈合时间及不同时间点愈合情况。伤后每隔5天取上述三组创面组织，测定猪皮肤转化生长因子β（TGF-β）含量、过氧化氢酶（SOD）、丙二醛（MDA），并取创面组织行HE染色，观察表皮及真皮变化。 结果： ①动物实验显示，A组、B组、C组，愈合时间依次为（13.17±1.75）天、（18.42±1.93）天、（24.67±2.64）天，P<0.05；② 各组创面TGF-β含量的比较，在伤后第5天，A组（196.36±1.53）pg/ml、B组（160.52±1.43）pg/ml、C组（150.65±3.60）pg/ml，A组高于B组和C组，P<0.05；伤后第9天比较，A组（183.39±1.73）pg/ml、B组（157.19±3.58）pg/ml、 C组166.68±6.50，A组高于B组和C组，P<0.05；其它时间点A组低于B组和C组；③各组创面中SOD含量的比较，伤后第5、第9、第14，A组高于B组和C组，P<0.05；伤前一天和伤后第29天，P>0.05；④各组创面中MDA含量的比较，在伤后第5至第24天，A组低于B组和C组，P<0.05；伤前一天和伤后第29天，P>0.05。结论：制备猪断层皮缺损创面模型可靠稳定 复方中药软膏在猪断层皮创面愈合过程中，可缩短创面愈合时间，提高创面愈合速率，升高创面组织中TGF-β含量，促进创面愈合复方中药软膏可提高创面组织中SOD含量，加强药物抗氧化能力；降低创面组织中MDA含量，减轻细胞毒性损伤。可减轻皮肤损伤造成的局部或全身炎症反应，发挥抗炎作用.复方中药软膏减少创面组织中渗出液，体现抗渗出功能。
[关键词]杜洛克猪；创面修复；转化生长因子β；过氧化氢酶；丙二醛
[中图分类号]R622 [文献标识码]A [文章编号]1008-6455（2014）22-1890-06
The experimental studies on the effect about Compound Chinese medicine ointment on porcine split-thickness skin wound's healing
SHI Xun，CUI Zheng-jun，XIAO Jing，WANG Chang-yin，ZHU Lei，ZOU Shi-bo，HAN Zhao-feng，GUO Peng-fei
（Department of Burn and Repair reconstruction surgery，the First Affiliated Hospital of Zhengzhou University，Zhengzhou 450052，Henan，China）
Abstract： Objective To study the effect of compound traditional Chinese medicine ointment in porcine split-thickness skin wound healing. Methods Prepared the porcine split-thickness skin wound model，and the depth of the wound is to the deep dermis，a depth of about 3/4 of the dermal thickness. The experiments were separated into compound traditional Chinese medicine ointment group （group A），Silikai nanometer silver antibacterial gel group （group B），blank control group （group C），treated respectively with compound Chinese medicine ointment，Silikai nanometer silver antibacterial gel， normal saline gauze， and quantitative greased.Everyday observe the wound healing time and the healing degree on different time of the three groups. Every 5 days after injury obtained the wound tissue of three groups， and tested the porcine skin transforming growth factor beta （TGF-β） content， catalase （SOD）， malondialdehyde （MDA）.The samples were stained by HE， observed the change of epidermal and dermal. Results ①In the animal experiments， the healing time of A group， B group and C group， were respectively 13.17 ± 1.75d， 18.42 ± 1.93d， 24.67 ± 2.64d， P < 0.05. ②In comparison of TGF- β content on 5-day after injury， group A was 196.36 ± 1.53pg/ml， 160.52 ± 1.43pg/ml in B group， and 150.65 ± 3.60pg/ml in C group. A group was higher than B group and C group， P< 0.05. On 9-day after injury， A group was 183.39 ± 1.73pg/ml， 157.19 ± 3.58pg/ml in B group，166.68 ± 6.50 pg/ml in C group.A group was higher than B group and C group， P < 0.05. On other time points A group was lower than B group and C group.③In comparison of SOD content in each group on 5-days， 9-day，14-day after injury， A group was higher than B group and C group， P<0.05.But on 1day before injury and 29-day after injury， P > 0.05.④In comparison of MDA content in each group on 5-day to 24-day after injury，the A group was lower than that of B group and C group， P<0.05. But on 1day before injury and 29-day after injury， P > 0.05. Conclusions Preparation of porcine split-thickness skin wound model is reliable and stable. Compound traditional Chinese medicine ointment in porcine split-thickness skin wound healing process， can shorten the wound healing time， raise the rate of wound healing， and increased the content of TGF-β in wound tissues， promote wound healing.Compound traditional Chinese medicine ointment can improve the SOD content in the wound tissue， enhance antioxidant capacity of drug； reduce the content of MDA in the wound tissue， reduce the cell toxicity. Local or systemic inflammatory response caused by reducing skin damage，anti-inflammatory action.4 Compound traditional Chinese medicine ointment reduce exudate in wound tissues， embody the exudation function. Key words：Duroc pig；wound repair；TGF-β；catalase；MDA
创面愈合是指外伤或其他疾病过程中，造成组织缺损后局部组织通过增生或再生方式进行修补的一系列复杂的病理生理过程[1]。断层皮创面愈合模型是利用取皮刀或取皮鼓切取一定厚度的皮肤，形成创面供修复研究之用，与治疗烧伤创面取皮的供皮区一致，其特点是创面大小与深度可以人为控制[2]。外用中药对创面愈合的作用是多方面、多环节的，是一个复杂的过程。本文对复方中药软膏能否促进猪皮肤创伤创面的愈合进行了初步研究。
1 材料和方法
1.1. 实验用动物及试剂：实验用4月龄美国杜洛克小型白猪，体重为30～35kg，8头猪均健康，雌雄不限，由河南科技大学实验动物中心提供。复方中药软膏由大黄50～200g，地榆50～200g，黄连50～200g，丹皮30～120g，五倍子50～200g，三七15～60g，赤石脂50～200g，炉甘石50～200g，乳香10～40g，没药10～40g，蜂蜡50～200g，冰片10～40g，麻油1000～4000g等组成，此配方由河南科技大学医学技术与工程学院提供。斯丽凯纳米银抗菌凝胶（深圳市源兴纳米医药科技有限公司，生产批号：111104008）。SOD及MDA试剂盒由（ 南京建成生物工程研究所）， 猪转化生长因子β测试盒（上海科兴商贸公司提供，源自美国R&D公司），氯胺酮注射液（福建古田药业有限公司，规格0.1g，产品批号：110302）。
1.2 实验用器材：WFJ7200型可见光分光光度计（上海尤尼柯仪器有限公司）。酶标仪（型号ELX800，美国伯腾仪器有限公司）， 数码照相机（尼康S8200），取皮鼓（上海手术器械六厂），数显恒温水浴锅（国华电器有限公司），旋涡振荡器QL-901（海门市其林贝尔仪器制造有限公司），离心机 Anke TGL-16C（上海安亭科学仪器厂），电子天平FA1004（上海良平仪器仪表有限公司），电热恒温培养箱（DHP-9082型，上海恒科学仪器有限公司）
2 方法
2.1 创伤模型的制作：实验前1天背部脊柱两侧备皮， 实验当天用氯胺酮注射液肌肉注射全身麻醉，剂量为10mg/kg，麻醉后用取皮鼓调整刻度后，在猪背部两侧切取实验所设计大小及深度的皮肤，用游标卡尺再次测量所切掉皮肤深度平均为1.2mm，达部分真皮层。每个创面大小为6cm×10cm，每个创面间距为8cm（见图1、2）。
2.2 致伤面积百分比和致伤深度：猪创伤面积/猪TBSA=S1/S。 S1=360㎝2，S=KW2/3 为动物总体表面积计算公式单位为㎝2，K为系数9.0，W为体重单位g。计算出创伤面积比S1/S=3.74%～4.14%。 预实验切取4月龄左右猪正常皮肤做病理切片，并在显微镜下测定表皮厚度在50～75μm，真皮厚度在1150～1350μm，表皮与真皮总厚度在1250～1480μm。现调节取皮鼓刻度，使致伤深度达真皮厚度3/4，约1200μm。
2.3 实验动物分组：每头猪6个创面，2个创面为一组，随机分三组，即复方中药软膏组（A组）、斯丽凯组（B组）及空白对照组（C组）。共8头猪48个创面。创面制作完成后采用固定吊养。（见图3、4）
2.4 创面用药：创面模型制作后，每组创面各进行定量给药，用药量电子天平称量后约为1.0g，均匀涂抹创面，每天换药一次，空白对照组每天碘伏擦洗，并用无菌纱布覆盖创面。
2.5 创面取材：每隔4天在每只猪固定创面用环钻取1cm×1cm组织，取材后进行组织粉碎，然后测试组织中转化生长因子β含量，SOD及MDA含量。创伤后每隔7天用环钻取材，用10%甲醛进行固定。取材后区域不计入愈合率。
2.6 创面检测指标
2.6.1 创面大体观察：伤后每天对创面一般情况观察，在创面完全上皮化时计算创面愈合时间。创面完全上皮化所需要的时间， 而上皮化依靠的肉眼观察确定[3]。
2.6.2 创面组织学观察：切取组织用10%甲醛保存固定做HE染色，观察表皮与真皮情况。
2.6.3 检测各组创面皮肤组织中TGF-β含量、SOD含量、MDA含量： 应用化学比色法测定上述三种含量。TGF-β含量按测试盒说明书检测，过程如下：标准品的稀释→加样→温育→配液→洗涤→加酶→温育→洗涤→显色→终止→测定。SOD含量按南京建成测试盒说明书检测，过程如下：样本前处理→操作表操作→计算公式计算数值等。MDA含量按南京建成测试盒说明书检测，过程如下：样本前处理→操作表操作→组织中MDA含量计算公式计算数值等。
2.7 统计学分析：用SPSS17.0软件实验数据均以x±s表示， 差异显著性分析采用方差分析和多重比较。检验水准a=0.05，P>0.05差异无统计学意义；P<0.05差异有统计学意义。
3 结果
3.1 一般状况：整个实验过程，实验动物营养状态良好，饮食睡眠均正常，未出现动物死亡现象。其中一头猪出现轻度脱肛现象，经处理后未再脱肛（图1～4）。
3.2 断层皮厚度测量：创面断层皮厚度统计数据显示为（1201.55±10.95）μm，断层皮厚度测量见（图24）。
3.3 猪皮肤创面镜下HE染色观察：复方中药软膏组（A组）、斯丽凯组（B组）、空白对照组（C），第5、第9、第14、第19、第24、第29天创面组织镜下观察（200×）。镜下可见复方中药组表皮结构形成较斯丽凯及空白组快，胶原纤维排列紧密，结果见图5～23。
3.4 各组创面愈合时间以及各组创面中TGF-β、SOD、MDA含量比较：见表1～4。从各组创面愈合时间显示，中药组所用时间为（13.17±1.75）天，空白组时间为（24.67±2.64）天见（表2），三组之间两两比较均为 P<0.05，差异具有统计学意义。 4 讨论
本实验研究复方中药软膏在猪皮肤缺损创面愈合的影响。观察创面愈合时间及创面皮肤组织学HE染色，猪皮肤中转化生长因子β含量的变化，药物对愈合皮肤中超氧化物歧化酶（SOD）和丙二醛（MDA）含量的影响。
实验过程中严格控制室温，确保环境适宜，便于动物生长，防止动物中暑。每天打扫室内卫生，防止实验创面感染，影响愈合。每日给实验猪测量体温，体温过高应用复方氨基比林。实验猪采用固定吊养，限制活动，避免擦伤创面影响愈合。同时便于观察创面、照相、换药、取材、测量体温等。创面之间相隔间距约8㎝，防止药物之间相互作用，否则容易造成数据混乱，测量不准确。
动物实验分组解释，中药组、斯丽凯组及空白组分在同一个动物个体，用来观察愈合时间，检测创面组织中SOD、MDA、TGF-β等，目的将实验误差降到最小。
实验模型制备，用取皮鼓切取皮片后，再用游标卡尺测量皮片厚度，可精确取皮厚度，保证实验模型可靠。创伤模型创面深度选择在平均1.2mm，预实验切取4月龄左右正常皮肤做病理切片，并在显微镜下测定表皮厚度为50～75μm，真皮厚度为1150～1350μm，表皮与真皮总厚度1250～1480μm。用滚轴植皮刀在每头猪背部两侧取皮制备8个6㎝×6㎝中厚断层皮肤损伤创面，然后用游标卡尺和光学显微镜检测切取片厚度，即创面的深度[4]。Meyer等测量发现，猪皮肤表皮厚度为70～140μm，人类皮肤表皮厚度为50～120μm，两种皮肤中表皮厚度很相似[5]，但是猪在不同月龄及不同品种，皮肤表皮厚度差别不一样。两种皮肤非常相似，因此所选择深度可达部分真皮层。
复方中药软膏由大黄、黄连、地榆、蜂蜡、冰片、赤石脂、炉甘石、丹皮、五倍子、三七、乳香、没药、麻油等组分组成。上述配方中大黄、地榆、五倍子、三七具有清热解毒、凉血止血、收敛、生肌止痛的功效，具吸湿抗渗出、减轻疼痛、防止伤口感染的作用。黄连有清热、解毒、燥湿的功效，有较强的抗菌作用，能够较为明显地抑制绿脓杆菌和葡萄球菌的生长，加强抗感染作用。丹皮、乳香、没药具有活血，化疲止痛的作用。赤石脂、炉甘石、冰片清热解毒，止痛，防腐止痒，收敛，可吸收创面的分泌物，保持创面的干燥，又有预防感染，促进伤口愈合的作用。蜂蜡、麻油可以减轻疼痛，保护伤口。上述原料药相互组合、共同作用，对烧伤或疮疡具有很好的疗效[6]。大体观察各组创面过程中，中药组创面渗出比斯丽凯组和空白组少，而空白组渗出最多。可能是药物中赤石脂、炉甘石、冰片发挥较好作用。
实验中斯丽凯纳米银凝胶，有效成分是纳米银。银离子的杀菌机制不同于化学合成的抗菌剂，是通过重金属离子对细菌蛋白质的变性发生作用，因此具有广谱杀菌及不易耐药的特点，纳米银能使创面上皮再生的速度加快，从而促进创面愈合。实验中发现斯丽凯组创面第一天有大量渗出液，以后观察点未见大量渗出性液和脓性分泌物，创面周围未见红肿，创面始终保持干燥，促进上皮化速度明显，促进表皮生长速度比空白组快，可见斯丽凯在治疗创面具有较好的疗效作用。
组织学观察皮肤愈合过程中，中药组表皮再生速率快于其它两组，表皮中结构层次分明。可见表皮结构中角质层、透明层、颗粒层、棘细胞层、基底层等。上皮细胞再生机理，首先是创面边缘健存的基底细胞开始增生，并向中心部位移行。基底细胞的增殖刺激创面基底部毛细血管和结缔组织的反应性增生。当创面被新生的上皮细胞覆盖后，创面外观呈粉红色。基底细胞的增生刺激肉芽组织的生长，同时巨噬细胞释放的生长因子如PDGF，TGF-β和TGF-α等，加速肉芽组织的形成。随着肉芽组织的不断形成，缺失的创面组织被填充，上皮细胞便从创面边缘向中心移动，最终使创面完全被再生的上皮细胞覆盖。
TGF-β是一种多功能细胞因子，在创面修复中起着至关重要的作用，主要介导了细胞的迁徙、增殖、分化与凋亡，胶原、细胞外基质的合成与降解，调节细胞与组织对损伤的反应[8]。
在创伤愈合过程中，测得复方中药软膏组，TGF-β含量在伤后14天内明显高于其它两组，14天以后斯丽凯组中TGF-β含量稍高于空白对照组。 TGF-β促进创面愈合，主要是通过促进成纤维细胞趋化，产生胶原纤维和细胞外基质，还可减少胶原酶的合成，增加金属蛋白酶抑制剂的产生，从而减少伤口中的酶解作用，促进伤口愈合。个人认为，实验中猪皮肤组织中TGF-β升高因素，是由外用药物干预直接促进升高，导致中药组愈合速度高于其它两组。
MDA是体内自由基作用于生物膜多价不饱和脂肪酸，发生脂质过氧化反应生成的终产物，具有细胞毒性。测定MDA的量可反映机体内脂质过氧化的程度，间接反映出细胞损伤的程度。已普遍用作检测机体组织中自由基水平的指标。SOD 是人体防御内外环境中活性氧损伤的重要酶，与过氧化氢酶或谷胱甘肽过氧化氢酶共同组成体内有效清除活性氧的重要体系。创面局部药物，伤后检测药物对皮肤组织中SOD及MDA含量影响，目前国内外较少研究。外用药物对创伤创面的愈合效果，药物的抗氧化能力主要是靠组织创面中SOD含量的高低来衡量。在芦荟汁对烫伤大鼠皮肤的愈合及SOD、MDA及GSH-PX的影响中，发现芦荟汁组中SOD含量越高及MDA含量越低，创面愈合越快，证实了芦荟的抗氧化功能，通过清除自由基，保护细胞免受损害，从而有利于提高机体的解毒功能[9]。本实验也证实复方中药软膏组组织中SOD含量高于其它两组，MDA含量则低于其它两组，说明药物的抗氧化能力越强，创面愈合越快。复方中药软膏组创面完全上皮化时间快于其它两组。由此可见MDA含量的多少反映了局部脂质过氧化反应的强弱，而SOD含量的增高是对清除吞噬细胞生成超氧阴离子，减轻炎症反应对组织的损害是有益处的[10]，这可能是高浓度SOD和低浓度MDA是加速创面愈合的原因之一。
由此可见，复方中药软膏在治疗创伤创面研究中有较高的临床应用价值，包括促进创面快速愈合，以及较强的抗菌、抗氧化、抗渗出作用。
[参考文献]
[1]盛志勇，郭振荣.烧伤学临床新视野[M].北京：清华大学出版社，2005：227.
[2]付小兵，孙同柱，盛志勇.几种用于创伤修复研究的动物模型[J].中华实验外科杂志，1999，5（16）：479-480.
[3]黄康，陈玉林.创面愈合评价指标进展[J].中国修复重建外科杂志，2001，15（2）：126-129.
[4]吴志谷，付小兵.rhEGF对猪断层皮肤创面表皮和真皮修复的影响[J].北京军区医药，2000，12（6）：401-403.
[5]Meyer W，Schwarz R，Neurand K.The skin of domestic mammals as a model for the human skin， with special reference to the domestic pig[J].Current Problems in Dermatology，1978，7：39-52.
[6]雷万军，李军，宗小郁，等.用于治疗烧伤或疮疡的中药软膏及其制备方法[P].中华人民共和国国家知识产权局，2011年12月7日，专利号 ZL200910227272.4.
[7]Gunasekaran T，Nigusse T，Dhanaraju MD.Silver nanoparticles as real topical bullets for Wound healing[J].J Am College Certified Wound Specialists，2011，3（4）：82-96.
[8]王琪，付晋凤.转化生长因子β在创面修复中的研究进展[J].中华损伤与修复杂志，2011，6（5）：821-825.
[9]叶俊毅，朱佳荣.芦荟汁对烫伤大鼠皮肤的愈合及SOD、MDA及GSH-PX的影响[J].中国医师杂志，2010，12（4）：459-461.
[10]徐仁宝.体内抗炎机制及其意义[J].生理科学进展，1994，（4） ：305-308.
[收稿日期]2014-09-16 [修回日期]2014-10-30
编辑/张惠娟
[关键词]杜洛克猪；创面修复；转化生长因子β；过氧化氢酶；丙二醛
[中图分类号]R622 [文献标识码]A [文章编号]1008-6455（2014）22-1890-06
The experimental studies on the effect about Compound Chinese medicine ointment on porcine split-thickness skin wound's healing
SHI Xun，CUI Zheng-jun，XIAO Jing，WANG Chang-yin，ZHU Lei，ZOU Shi-bo，HAN Zhao-feng，GUO Peng-fei
（Department of Burn and Repair reconstruction surgery，the First Affiliated Hospital of Zhengzhou University，Zhengzhou 450052，Henan，China）
Abstract： Objective To study the effect of compound traditional Chinese medicine ointment in porcine split-thickness skin wound healing. Methods Prepared the porcine split-thickness skin wound model，and the depth of the wound is to the deep dermis，a depth of about 3/4 of the dermal thickness. The experiments were separated into compound traditional Chinese medicine ointment group （group A），Silikai nanometer silver antibacterial gel group （group B），blank control group （group C），treated respectively with compound Chinese medicine ointment，Silikai nanometer silver antibacterial gel， normal saline gauze， and quantitative greased.Everyday observe the wound healing time and the healing degree on different time of the three groups. Every 5 days after injury obtained the wound tissue of three groups， and tested the porcine skin transforming growth factor beta （TGF-β） content， catalase （SOD）， malondialdehyde （MDA）.The samples were stained by HE， observed the change of epidermal and dermal. Results ①In the animal experiments， the healing time of A group， B group and C group， were respectively 13.17 ± 1.75d， 18.42 ± 1.93d， 24.67 ± 2.64d， P < 0.05. ②In comparison of TGF- β content on 5-day after injury， group A was 196.36 ± 1.53pg/ml， 160.52 ± 1.43pg/ml in B group， and 150.65 ± 3.60pg/ml in C group. A group was higher than B group and C group， P< 0.05. On 9-day after injury， A group was 183.39 ± 1.73pg/ml， 157.19 ± 3.58pg/ml in B group，166.68 ± 6.50 pg/ml in C group.A group was higher than B group and C group， P < 0.05. On other time points A group was lower than B group and C group.③In comparison of SOD content in each group on 5-days， 9-day，14-day after injury， A group was higher than B group and C group， P<0.05.But on 1day before injury and 29-day after injury， P > 0.05.④In comparison of MDA content in each group on 5-day to 24-day after injury，the A group was lower than that of B group and C group， P<0.05. But on 1day before injury and 29-day after injury， P > 0.05. Conclusions Preparation of porcine split-thickness skin wound model is reliable and stable. Compound traditional Chinese medicine ointment in porcine split-thickness skin wound healing process， can shorten the wound healing time， raise the rate of wound healing， and increased the content of TGF-β in wound tissues， promote wound healing.Compound traditional Chinese medicine ointment can improve the SOD content in the wound tissue， enhance antioxidant capacity of drug； reduce the content of MDA in the wound tissue， reduce the cell toxicity. Local or systemic inflammatory response caused by reducing skin damage，anti-inflammatory action.4 Compound traditional Chinese medicine ointment reduce exudate in wound tissues， embody the exudation function. Key words：Duroc pig；wound repair；TGF-β；catalase；MDA
创面愈合是指外伤或其他疾病过程中，造成组织缺损后局部组织通过增生或再生方式进行修补的一系列复杂的病理生理过程[1]。断层皮创面愈合模型是利用取皮刀或取皮鼓切取一定厚度的皮肤，形成创面供修复研究之用，与治疗烧伤创面取皮的供皮区一致，其特点是创面大小与深度可以人为控制[2]。外用中药对创面愈合的作用是多方面、多环节的，是一个复杂的过程。本文对复方中药软膏能否促进猪皮肤创伤创面的愈合进行了初步研究。
1 材料和方法
1.1. 实验用动物及试剂：实验用4月龄美国杜洛克小型白猪，体重为30～35kg，8头猪均健康，雌雄不限，由河南科技大学实验动物中心提供。复方中药软膏由大黄50～200g，地榆50～200g，黄连50～200g，丹皮30～120g，五倍子50～200g，三七15～60g，赤石脂50～200g，炉甘石50～200g，乳香10～40g，没药10～40g，蜂蜡50～200g，冰片10～40g，麻油1000～4000g等组成，此配方由河南科技大学医学技术与工程学院提供。斯丽凯纳米银抗菌凝胶（深圳市源兴纳米医药科技有限公司，生产批号：111104008）。SOD及MDA试剂盒由（ 南京建成生物工程研究所）， 猪转化生长因子β测试盒（上海科兴商贸公司提供，源自美国R&D公司），氯胺酮注射液（福建古田药业有限公司，规格0.1g，产品批号：110302）。
1.2 实验用器材：WFJ7200型可见光分光光度计（上海尤尼柯仪器有限公司）。酶标仪（型号ELX800，美国伯腾仪器有限公司）， 数码照相机（尼康S8200），取皮鼓（上海手术器械六厂），数显恒温水浴锅（国华电器有限公司），旋涡振荡器QL-901（海门市其林贝尔仪器制造有限公司），离心机 Anke TGL-16C（上海安亭科学仪器厂），电子天平FA1004（上海良平仪器仪表有限公司），电热恒温培养箱（DHP-9082型，上海恒科学仪器有限公司）
2 方法
2.1 创伤模型的制作：实验前1天背部脊柱两侧备皮， 实验当天用氯胺酮注射液肌肉注射全身麻醉，剂量为10mg/kg，麻醉后用取皮鼓调整刻度后，在猪背部两侧切取实验所设计大小及深度的皮肤，用游标卡尺再次测量所切掉皮肤深度平均为1.2mm，达部分真皮层。每个创面大小为6cm×10cm，每个创面间距为8cm（见图1、2）。
2.2 致伤面积百分比和致伤深度：猪创伤面积/猪TBSA=S1/S。 S1=360㎝2，S=KW2/3 为动物总体表面积计算公式单位为㎝2，K为系数9.0，W为体重单位g。计算出创伤面积比S1/S=3.74%～4.14%。 预实验切取4月龄左右猪正常皮肤做病理切片，并在显微镜下测定表皮厚度在50～75μm，真皮厚度在1150～1350μm，表皮与真皮总厚度在1250～1480μm。现调节取皮鼓刻度，使致伤深度达真皮厚度3/4，约1200μm。
2.3 实验动物分组：每头猪6个创面，2个创面为一组，随机分三组，即复方中药软膏组（A组）、斯丽凯组（B组）及空白对照组（C组）。共8头猪48个创面。创面制作完成后采用固定吊养。（见图3、4）
2.4 创面用药：创面模型制作后，每组创面各进行定量给药，用药量电子天平称量后约为1.0g，均匀涂抹创面，每天换药一次，空白对照组每天碘伏擦洗，并用无菌纱布覆盖创面。
2.5 创面取材：每隔4天在每只猪固定创面用环钻取1cm×1cm组织，取材后进行组织粉碎，然后测试组织中转化生长因子β含量，SOD及MDA含量。创伤后每隔7天用环钻取材，用10%甲醛进行固定。取材后区域不计入愈合率。
2.6 创面检测指标
2.6.1 创面大体观察：伤后每天对创面一般情况观察，在创面完全上皮化时计算创面愈合时间。创面完全上皮化所需要的时间， 而上皮化依靠的肉眼观察确定[3]。
2.6.2 创面组织学观察：切取组织用10%甲醛保存固定做HE染色，观察表皮与真皮情况。
2.6.3 检测各组创面皮肤组织中TGF-β含量、SOD含量、MDA含量： 应用化学比色法测定上述三种含量。TGF-β含量按测试盒说明书检测，过程如下：标准品的稀释→加样→温育→配液→洗涤→加酶→温育→洗涤→显色→终止→测定。SOD含量按南京建成测试盒说明书检测，过程如下：样本前处理→操作表操作→计算公式计算数值等。MDA含量按南京建成测试盒说明书检测，过程如下：样本前处理→操作表操作→组织中MDA含量计算公式计算数值等。
2.7 统计学分析：用SPSS17.0软件实验数据均以x±s表示， 差异显著性分析采用方差分析和多重比较。检验水准a=0.05，P>0.05差异无统计学意义；P<0.05差异有统计学意义。
3 结果
3.1 一般状况：整个实验过程，实验动物营养状态良好，饮食睡眠均正常，未出现动物死亡现象。其中一头猪出现轻度脱肛现象，经处理后未再脱肛（图1～4）。
3.2 断层皮厚度测量：创面断层皮厚度统计数据显示为（1201.55±10.95）μm，断层皮厚度测量见（图24）。
3.3 猪皮肤创面镜下HE染色观察：复方中药软膏组（A组）、斯丽凯组（B组）、空白对照组（C），第5、第9、第14、第19、第24、第29天创面组织镜下观察（200×）。镜下可见复方中药组表皮结构形成较斯丽凯及空白组快，胶原纤维排列紧密，结果见图5～23。
3.4 各组创面愈合时间以及各组创面中TGF-β、SOD、MDA含量比较：见表1～4。从各组创面愈合时间显示，中药组所用时间为（13.17±1.75）天，空白组时间为（24.67±2.64）天见（表2），三组之间两两比较均为 P<0.05，差异具有统计学意义。 4 讨论
本实验研究复方中药软膏在猪皮肤缺损创面愈合的影响。观察创面愈合时间及创面皮肤组织学HE染色，猪皮肤中转化生长因子β含量的变化，药物对愈合皮肤中超氧化物歧化酶（SOD）和丙二醛（MDA）含量的影响。
实验过程中严格控制室温，确保环境适宜，便于动物生长，防止动物中暑。每天打扫室内卫生，防止实验创面感染，影响愈合。每日给实验猪测量体温，体温过高应用复方氨基比林。实验猪采用固定吊养，限制活动，避免擦伤创面影响愈合。同时便于观察创面、照相、换药、取材、测量体温等。创面之间相隔间距约8㎝，防止药物之间相互作用，否则容易造成数据混乱，测量不准确。
动物实验分组解释，中药组、斯丽凯组及空白组分在同一个动物个体，用来观察愈合时间，检测创面组织中SOD、MDA、TGF-β等，目的将实验误差降到最小。
实验模型制备，用取皮鼓切取皮片后，再用游标卡尺测量皮片厚度，可精确取皮厚度，保证实验模型可靠。创伤模型创面深度选择在平均1.2mm，预实验切取4月龄左右正常皮肤做病理切片，并在显微镜下测定表皮厚度为50～75μm，真皮厚度为1150～1350μm，表皮与真皮总厚度1250～1480μm。用滚轴植皮刀在每头猪背部两侧取皮制备8个6㎝×6㎝中厚断层皮肤损伤创面，然后用游标卡尺和光学显微镜检测切取片厚度，即创面的深度[4]。Meyer等测量发现，猪皮肤表皮厚度为70～140μm，人类皮肤表皮厚度为50～120μm，两种皮肤中表皮厚度很相似[5]，但是猪在不同月龄及不同品种，皮肤表皮厚度差别不一样。两种皮肤非常相似，因此所选择深度可达部分真皮层。
复方中药软膏由大黄、黄连、地榆、蜂蜡、冰片、赤石脂、炉甘石、丹皮、五倍子、三七、乳香、没药、麻油等组分组成。上述配方中大黄、地榆、五倍子、三七具有清热解毒、凉血止血、收敛、生肌止痛的功效，具吸湿抗渗出、减轻疼痛、防止伤口感染的作用。黄连有清热、解毒、燥湿的功效，有较强的抗菌作用，能够较为明显地抑制绿脓杆菌和葡萄球菌的生长，加强抗感染作用。丹皮、乳香、没药具有活血，化疲止痛的作用。赤石脂、炉甘石、冰片清热解毒，止痛，防腐止痒，收敛，可吸收创面的分泌物，保持创面的干燥，又有预防感染，促进伤口愈合的作用。蜂蜡、麻油可以减轻疼痛，保护伤口。上述原料药相互组合、共同作用，对烧伤或疮疡具有很好的疗效[6]。大体观察各组创面过程中，中药组创面渗出比斯丽凯组和空白组少，而空白组渗出最多。可能是药物中赤石脂、炉甘石、冰片发挥较好作用。
实验中斯丽凯纳米银凝胶，有效成分是纳米银。银离子的杀菌机制不同于化学合成的抗菌剂，是通过重金属离子对细菌蛋白质的变性发生作用，因此具有广谱杀菌及不易耐药的特点，纳米银能使创面上皮再生的速度加快，从而促进创面愈合。实验中发现斯丽凯组创面第一天有大量渗出液，以后观察点未见大量渗出性液和脓性分泌物，创面周围未见红肿，创面始终保持干燥，促进上皮化速度明显，促进表皮生长速度比空白组快，可见斯丽凯在治疗创面具有较好的疗效作用。
组织学观察皮肤愈合过程中，中药组表皮再生速率快于其它两组，表皮中结构层次分明。可见表皮结构中角质层、透明层、颗粒层、棘细胞层、基底层等。上皮细胞再生机理，首先是创面边缘健存的基底细胞开始增生，并向中心部位移行。基底细胞的增殖刺激创面基底部毛细血管和结缔组织的反应性增生。当创面被新生的上皮细胞覆盖后，创面外观呈粉红色。基底细胞的增生刺激肉芽组织的生长，同时巨噬细胞释放的生长因子如PDGF，TGF-β和TGF-α等，加速肉芽组织的形成。随着肉芽组织的不断形成，缺失的创面组织被填充，上皮细胞便从创面边缘向中心移动，最终使创面完全被再生的上皮细胞覆盖。
TGF-β是一种多功能细胞因子，在创面修复中起着至关重要的作用，主要介导了细胞的迁徙、增殖、分化与凋亡，胶原、细胞外基质的合成与降解，调节细胞与组织对损伤的反应[8]。
在创伤愈合过程中，测得复方中药软膏组，TGF-β含量在伤后14天内明显高于其它两组，14天以后斯丽凯组中TGF-β含量稍高于空白对照组。 TGF-β促进创面愈合，主要是通过促进成纤维细胞趋化，产生胶原纤维和细胞外基质，还可减少胶原酶的合成，增加金属蛋白酶抑制剂的产生，从而减少伤口中的酶解作用，促进伤口愈合。个人认为，实验中猪皮肤组织中TGF-β升高因素，是由外用药物干预直接促进升高，导致中药组愈合速度高于其它两组。
MDA是体内自由基作用于生物膜多价不饱和脂肪酸，发生脂质过氧化反应生成的终产物，具有细胞毒性。测定MDA的量可反映机体内脂质过氧化的程度，间接反映出细胞损伤的程度。已普遍用作检测机体组织中自由基水平的指标。SOD 是人体防御内外环境中活性氧损伤的重要酶，与过氧化氢酶或谷胱甘肽过氧化氢酶共同组成体内有效清除活性氧的重要体系。创面局部药物，伤后检测药物对皮肤组织中SOD及MDA含量影响，目前国内外较少研究。外用药物对创伤创面的愈合效果，药物的抗氧化能力主要是靠组织创面中SOD含量的高低来衡量。在芦荟汁对烫伤大鼠皮肤的愈合及SOD、MDA及GSH-PX的影响中，发现芦荟汁组中SOD含量越高及MDA含量越低，创面愈合越快，证实了芦荟的抗氧化功能，通过清除自由基，保护细胞免受损害，从而有利于提高机体的解毒功能[9]。本实验也证实复方中药软膏组组织中SOD含量高于其它两组，MDA含量则低于其它两组，说明药物的抗氧化能力越强，创面愈合越快。复方中药软膏组创面完全上皮化时间快于其它两组。由此可见MDA含量的多少反映了局部脂质过氧化反应的强弱，而SOD含量的增高是对清除吞噬细胞生成超氧阴离子，减轻炎症反应对组织的损害是有益处的[10]，这可能是高浓度SOD和低浓度MDA是加速创面愈合的原因之一。
由此可见，复方中药软膏在治疗创伤创面研究中有较高的临床应用价值，包括促进创面快速愈合，以及较强的抗菌、抗氧化、抗渗出作用。
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[4]吴志谷，付小兵.rhEGF对猪断层皮肤创面表皮和真皮修复的影响[J].北京军区医药，2000，12（6）：401-403.
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[9]叶俊毅，朱佳荣.芦荟汁对烫伤大鼠皮肤的愈合及SOD、MDA及GSH-PX的影响[J].中国医师杂志，2010，12（4）：459-461.
[10]徐仁宝.体内抗炎机制及其意义[J].生理科学进展，1994，（4） ：305-308.
[收稿日期]2014-09-16 [修回日期]2014-10-30
编辑/张惠娟