【摘 要】
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目的: 构建重组人NKG2D真核表达载体并在CHO细胞表达重组人NKG2D.方法: 用RT-PCR方法从NK-92细胞中调取NKG2D基因片段,克隆到pGEM-T Easy载体并对克隆的DNA片段进行序列分析.
【机 构】
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山东省医学科学院基础医学研究所,山东,济南,250062山东大学第二医院,山东,济南,250033;
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目的: 构建重组人NKG2D真核表达载体并在CHO细胞表达重组人NKG2D.方法: 用RT-PCR方法从NK-92细胞中调取NKG2D基因片段,克隆到pGEM-T Easy载体并对克隆的DNA片段进行序列分析.用限制内切酶EcoR I和BamH I消化pGEM-T Easy/NKG2D重组质粒,分离NKG2D片段,并插入真核表达质粒pEGFP-N1的相应限制酶位点,酶谱分析鉴定重组表达载体pEGFP-N1/NKG2D.然后经脂质体介导转染CHO细胞.应用荧光显微镜观测、Western blot方法和免疫组化染色对转染细胞内pEGFP-N1/NKG2D的表达进行鉴定.结果: RT-PCR扩增获得650 bp基因片段,经DNA序列分析证明所获得的DNA序列与文献报道的NKG2D序列一致.转染的CHO细胞在荧光显微镜下发出强绿色荧光,Western blot分析显示重组蛋白能特异地与抗人NKG2D单克隆抗体结合;免疫组化检测显示,转染的CHO中有棕色颗粒,证明所构建的NKG2D真核表达载体可以在细胞中表达.结论: 构建了人NKG2D的哺乳动物细胞表达载体,并成功地在CHO细胞中获得重组人NKG2D的表达.
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