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[摘要] 目的 观察miR-20a-5p对肾小管上皮细胞增殖的影响，并验证其对细胞周期蛋白D1（cyclin D1）的靶向调控作用。 方法 使用LipofectamineTM2000脂质体将微小RNA（miRNA）转染入人肾小管上皮细胞HK-2，实验分为3组，miR-20a-5p组转染miR-20a-5p，对照组转染阴性对照miRNA，空白组未做任何转染。CCK-8实验检测转染后各组细胞的吸光度值，流式细胞术检测各组的细胞周期变化。Western blot检测各组细胞cyclin D1的蛋白表达情况。构建荧光素酶报告基因，内含cyclin D1的3’端非翻译区（3’UTR），双荧光素酶报告基因实验验证miR-20a-5p对3’UTR的直接结合作用。 结果 MiR-20a-5p组在转染后48～120 h的吸光度值均低于对照组和空白组（P<0.05），另外两组差异无统计学意义（P>0.05）。转染后72 h，miR-20a-5p组处于G1期的比例为（63.89±3.61）%，高于另外两组（P<0.05），而另外两组差异无统计学意义（P>0.05）。转染后48 h，miR-20a-5p组的cyclin D1蛋白表达减少（P<0.05）。与阴性对照miRNA相比，miR-20a-5p能抑制荧光素酶的活性（P<0.05）。 结论 miR-20a-5p能抑制肾小管上皮细胞的增殖，并将细胞阻滞在G1期，其可能机制是miR-20a-5p抑制cyclin D1的表达，cyclin D1是miR-20a-5p的直接靶基因。
[关键词] 细胞周期蛋白D1；细胞增殖；肾小管；微RNAs
[中图分类号] R737.11 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2016）20-0001-05
[Abstract] Objective To observe the effect of miR-20a-5p’s on the proliferation of human renal tubular epithelial cells and to verify its targeted regulation of cyclin D1. Methods miRNAs were transfected into HK-2 cells（human renal tubular epithelial cell） by LipofectamineTM2000. Cells were divided into three groups， the miR-20a-5p group transfected with miR-20a-5p， the negative control group transfected with negative control miRNA and the blank control group transfected with no miRNAs. The absorbances of cells in each group after transfection were evaluated by Cell Counting Kit-8（CCK-8）， the cell cycles of each group were assayed by flow cytometry. The protein expression of cyclin D1 in each group after transfection was detected via Western blot. A firefly luciferase reporter vector containing 3’UTR of cyclin D1 was created and the Dual-Luciferase Reporter Assay System was used to test the direct combination of miR-20a-5p and 3’UTR. Results The absorbances of miR-20a-5p group were lower than those of negative control group and blank control group at 48-120 h after transfection（P<0.05）， and there was no statistical difference between the other two groups（P>0.05）. The percentage of G1 stage in miR-20a-5p group was（63.89±3.61）% at 72 h after transfection， higher than those of the other two groups（P<0.05）， and there was no statistical difference between the other two groups（P>0.05）. The protein expression of cyclin D1 in miR-20a-5p group was lower than that of the other two groups at 48 h after transfection（P<0.05）. Compared with negative control miRNA， miR-20a-5p repressed the luciferase activity（P<0.05）. Conclusion miR-20a-5p can inhibit the proliferation of human renal tubular epithelial cells and cause a delay in the G1-stage. The mechanism may be miR-20a-5p can repress expression of cyclin D1 and cyclin D1 is the direct target gene of miR-20a-5p. [Key words] Cyclin D1； Cell proliferation； Kidney tubules； microRNAs
急性肾损伤（acute kidney injury，AKI）是重症患者中的一种常见合并症，在ICU中的发病率约20%～60%，住院死亡率常超过25%，死亡率较高[1，2]。根据改善全球肾脏病预后组织（KDIGO）2012年临床实践指南[3]，AKI的定义为：48 h内血清肌酐上升≥26.5 μmol/L；或7 d内血清肌酐上升至≥1.5倍基线水平；或连续6 h尿量<0.5 mL/（kg·h）。AKI的病理生理过程中，肾小管上皮细胞损伤是重要的病理性变化。细胞损伤后必然会带来细胞周期的激活和自身细胞的增殖修复。近年来，针对AKI的肾小管细胞损伤修复及细胞周期变化的研究是一大热点[4-7]。miRNA是一类负性调控信使RNA翻译的小RNA，其与包括AKI在内的几乎所有疾病的发生发展均有密切关系。本研究旨在探讨miR-20a-5p对肾小管上皮细胞增殖及细胞周期的影响，并揭示其对cyclin D1的靶向调控作用。现报道如下。
1 材料与方法
1.1 一般材料
所用miRNA均由美国Dharmacon公司合成：hsa-miR-20a-5p（5’-UAAAGUGCUUAUAGUGCAGGUAG-3’），阴性对照miRNA（5’-UCACAACCUCCUAGAAAGAGUAGA-3’）。人肾小管上皮细胞HK-2及人胚胎肾细胞293T购自美国模式培养物集存库（ATCC）。LipofectamineTM2000脂质体购自美国Invitrogen公司。细胞计数CCK-8（Cell Counting Kit-8）试剂盒购自日本同仁化学研究所。细胞周期检测试剂盒（内含碘化丙啶染色液、RNA酶）购自中国碧云天生物技术研究所。小鼠抗人cyclin D1抗体（sc-20044）购自美国Santa Cruz公司。SDS-PAGE电泳凝胶配制试剂盒购自中国碧云天生物技术研究所。荧光素酶报告基因载体pMIR-REPORT购自美国Ambion公司。双荧光素酶报告基因检测试剂盒购自美国Promega公司。
1.2 方法
1.2.1 细胞培养 HK-2、293T细胞培养于含10%胎牛血清的高糖DMEM培养液中，培养条件为37℃、5%CO2的培养箱。每1～2天予以常规换液，待细胞长满80%培养瓶时予胰酶消化传代。取对数生长期的细胞进行实验。
1.2.2 细胞转染 将HK-2细胞以5×105个/孔接种于6孔板中，整个转染过程按照LipofectamineTM2000脂质体说明书进行。实验设3组，转染miR-20a-5p的细胞为miR-20a-5p组，转染阴性对照miRNA的细胞为对照组，不转染miRNA的细胞为空白组。将脂质体与miRNA充分混合于无血清DMEM培养液，最终加入细胞孔后的miRNA浓度为50 nmol/L。转染6 h后PBS清洗细胞，于常规培养液条件下继续培养。
1.2.3 CCK-8实验 将HK-2细胞以2000个/孔接种于96孔板，每孔使用100 μL培养液。按照前述方法进行转染，分组情况相同。分别于转染后24 h、48 h、72 h、96 h、120 h进行检测实验。检测时每孔加入10 μL CCK-8溶液，摇匀后继续在培养箱内培养1 h，在酶联免疫检测仪于450 nm波长处检测吸光度值。以加入相同量细胞培养液和CCK-8溶液但没有细胞的孔作为校正参考。
1.2.4 流式细胞术观察转染后的细胞周期差异 将HK-2细胞接种于6孔板中，转染方法及分组同前。转染后72 h用胰酶将各孔细胞消化下来，转移到离心管中。1000 rpm离心5 min，去除上清培养液，以预冷PBS清洗后再次离心，每管加入预冷70%乙醇，于4℃固定12 h。再次清洗离心后去除上清液，每管加入碘化丙啶和RNA酶混合液混匀，37℃避光温浴30 min，后于流式细胞仪488 nm激发波长处检测红色荧光。使用流式仪自带软件分析DNA含量。
1.2.5 Western blot检测转染后cyclin D1蛋白表达情况 6孔板接种HK-2细胞，分组及转染方式同前。转染后48 h，使用RIPA裂解细胞，离心后移除上清液，BCA法测定蛋白浓度。根据SDS-PAGE凝胶试剂盒说明书配好分离胶及浓缩胶。将测好浓度的蛋白与上样缓冲液混合后煮沸变性5 min，以每孔道20 μg蛋白于12%SDS-PAGE凝胶中电泳。电泳条件为60 V恒压下30 min，后100 V恒压下至溴酚蓝到达分离胶底部。湿转法将蛋白转入PVDF膜，转膜条件为350 mA 2 h。封闭液在室温下对PVDF膜封闭1 h，洗膜后加入cyclin D1抗体或β-actin抗体，4℃震荡摇匀过夜。洗膜后与辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠抗体室温孵育2 h，再次洗膜后加入ECL试剂，在Bio-Rad凝胶成像仪下检测发光情况。用Quantity-one软件进行灰度分析，与内参（β-actin）的发光情况比较，得出cyclin D1蛋白的相对表达量。
1.2.6 双荧光素酶报告基因实验 查找Targetscan、DIANA microT等网站，明确cyclin D1能与miR-20a-5p相结合的3’UTR，设计引物，内含Spe I及Mlu I酶切位点，进行PCR扩增，回收得目的片段。上游引物为5’-GGACTAGTCTGTTGTAAGAATAGGCATTAA-3’，下游引物为5’-CGACGCGTTCATCCTGGCAATGTGAGAAT-3’。设计合成一对与miR-20a-5p完全互补的引物，内含有Spe I及Mlu I酶切位点，经过退火程序后得到阳性片段。上游引物为5’-GGACTAGTCTACCTGCACTATAAGCACTTTA-3’，下游引物为5’-CGACGCGTTAAAGTGCTTATAGTGCAGGTAG-3’。将上述两种片段分别行纯化、双酶切后连接入pMIR-REPORT荧光素酶载体。将载体转化感受态大肠杆菌，提取质粒后将双酶切正确的质粒进行测序，最终得到含有3’UTR的荧光素酶报告基因和含有阳性序列的荧光素酶报告基因。 转染前将293T细胞以4×105个/孔接种于24孔板，将荧光素酶报告基因、海肾荧光素酶质粒pRL-TK、miRNA联合转染293T细胞，转染过程按照LipofectamineTM2000脂质体说明书进行。转染后48 h进行双荧光检测，用PLB裂解液裂解细胞，然后加入LAR II，于发光仪检测得到荧光值M1。加入Stop
[关键词] 细胞周期蛋白D1；细胞增殖；肾小管；微RNAs
[中图分类号] R737.11 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2016）20-0001-05
[Abstract] Objective To observe the effect of miR-20a-5p’s on the proliferation of human renal tubular epithelial cells and to verify its targeted regulation of cyclin D1. Methods miRNAs were transfected into HK-2 cells（human renal tubular epithelial cell） by LipofectamineTM2000. Cells were divided into three groups， the miR-20a-5p group transfected with miR-20a-5p， the negative control group transfected with negative control miRNA and the blank control group transfected with no miRNAs. The absorbances of cells in each group after transfection were evaluated by Cell Counting Kit-8（CCK-8）， the cell cycles of each group were assayed by flow cytometry. The protein expression of cyclin D1 in each group after transfection was detected via Western blot. A firefly luciferase reporter vector containing 3’UTR of cyclin D1 was created and the Dual-Luciferase Reporter Assay System was used to test the direct combination of miR-20a-5p and 3’UTR. Results The absorbances of miR-20a-5p group were lower than those of negative control group and blank control group at 48-120 h after transfection（P<0.05）， and there was no statistical difference between the other two groups（P>0.05）. The percentage of G1 stage in miR-20a-5p group was（63.89±3.61）% at 72 h after transfection， higher than those of the other two groups（P<0.05）， and there was no statistical difference between the other two groups（P>0.05）. The protein expression of cyclin D1 in miR-20a-5p group was lower than that of the other two groups at 48 h after transfection（P<0.05）. Compared with negative control miRNA， miR-20a-5p repressed the luciferase activity（P<0.05）. Conclusion miR-20a-5p can inhibit the proliferation of human renal tubular epithelial cells and cause a delay in the G1-stage. The mechanism may be miR-20a-5p can repress expression of cyclin D1 and cyclin D1 is the direct target gene of miR-20a-5p. [Key words] Cyclin D1； Cell proliferation； Kidney tubules； microRNAs
急性肾损伤（acute kidney injury，AKI）是重症患者中的一种常见合并症，在ICU中的发病率约20%～60%，住院死亡率常超过25%，死亡率较高[1，2]。根据改善全球肾脏病预后组织（KDIGO）2012年临床实践指南[3]，AKI的定义为：48 h内血清肌酐上升≥26.5 μmol/L；或7 d内血清肌酐上升至≥1.5倍基线水平；或连续6 h尿量<0.5 mL/（kg·h）。AKI的病理生理过程中，肾小管上皮细胞损伤是重要的病理性变化。细胞损伤后必然会带来细胞周期的激活和自身细胞的增殖修复。近年来，针对AKI的肾小管细胞损伤修复及细胞周期变化的研究是一大热点[4-7]。miRNA是一类负性调控信使RNA翻译的小RNA，其与包括AKI在内的几乎所有疾病的发生发展均有密切关系。本研究旨在探讨miR-20a-5p对肾小管上皮细胞增殖及细胞周期的影响，并揭示其对cyclin D1的靶向调控作用。现报道如下。
1 材料与方法
1.1 一般材料
所用miRNA均由美国Dharmacon公司合成：hsa-miR-20a-5p（5’-UAAAGUGCUUAUAGUGCAGGUAG-3’），阴性对照miRNA（5’-UCACAACCUCCUAGAAAGAGUAGA-3’）。人肾小管上皮细胞HK-2及人胚胎肾细胞293T购自美国模式培养物集存库（ATCC）。LipofectamineTM2000脂质体购自美国Invitrogen公司。细胞计数CCK-8（Cell Counting Kit-8）试剂盒购自日本同仁化学研究所。细胞周期检测试剂盒（内含碘化丙啶染色液、RNA酶）购自中国碧云天生物技术研究所。小鼠抗人cyclin D1抗体（sc-20044）购自美国Santa Cruz公司。SDS-PAGE电泳凝胶配制试剂盒购自中国碧云天生物技术研究所。荧光素酶报告基因载体pMIR-REPORT购自美国Ambion公司。双荧光素酶报告基因检测试剂盒购自美国Promega公司。
1.2 方法
1.2.1 细胞培养 HK-2、293T细胞培养于含10%胎牛血清的高糖DMEM培养液中，培养条件为37℃、5%CO2的培养箱。每1～2天予以常规换液，待细胞长满80%培养瓶时予胰酶消化传代。取对数生长期的细胞进行实验。
1.2.2 细胞转染 将HK-2细胞以5×105个/孔接种于6孔板中，整个转染过程按照LipofectamineTM2000脂质体说明书进行。实验设3组，转染miR-20a-5p的细胞为miR-20a-5p组，转染阴性对照miRNA的细胞为对照组，不转染miRNA的细胞为空白组。将脂质体与miRNA充分混合于无血清DMEM培养液，最终加入细胞孔后的miRNA浓度为50 nmol/L。转染6 h后PBS清洗细胞，于常规培养液条件下继续培养。
1.2.3 CCK-8实验 将HK-2细胞以2000个/孔接种于96孔板，每孔使用100 μL培养液。按照前述方法进行转染，分组情况相同。分别于转染后24 h、48 h、72 h、96 h、120 h进行检测实验。检测时每孔加入10 μL CCK-8溶液，摇匀后继续在培养箱内培养1 h，在酶联免疫检测仪于450 nm波长处检测吸光度值。以加入相同量细胞培养液和CCK-8溶液但没有细胞的孔作为校正参考。
1.2.4 流式细胞术观察转染后的细胞周期差异 将HK-2细胞接种于6孔板中，转染方法及分组同前。转染后72 h用胰酶将各孔细胞消化下来，转移到离心管中。1000 rpm离心5 min，去除上清培养液，以预冷PBS清洗后再次离心，每管加入预冷70%乙醇，于4℃固定12 h。再次清洗离心后去除上清液，每管加入碘化丙啶和RNA酶混合液混匀，37℃避光温浴30 min，后于流式细胞仪488 nm激发波长处检测红色荧光。使用流式仪自带软件分析DNA含量。
1.2.5 Western blot检测转染后cyclin D1蛋白表达情况 6孔板接种HK-2细胞，分组及转染方式同前。转染后48 h，使用RIPA裂解细胞，离心后移除上清液，BCA法测定蛋白浓度。根据SDS-PAGE凝胶试剂盒说明书配好分离胶及浓缩胶。将测好浓度的蛋白与上样缓冲液混合后煮沸变性5 min，以每孔道20 μg蛋白于12%SDS-PAGE凝胶中电泳。电泳条件为60 V恒压下30 min，后100 V恒压下至溴酚蓝到达分离胶底部。湿转法将蛋白转入PVDF膜，转膜条件为350 mA 2 h。封闭液在室温下对PVDF膜封闭1 h，洗膜后加入cyclin D1抗体或β-actin抗体，4℃震荡摇匀过夜。洗膜后与辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠抗体室温孵育2 h，再次洗膜后加入ECL试剂，在Bio-Rad凝胶成像仪下检测发光情况。用Quantity-one软件进行灰度分析，与内参（β-actin）的发光情况比较，得出cyclin D1蛋白的相对表达量。
1.2.6 双荧光素酶报告基因实验 查找Targetscan、DIANA microT等网站，明确cyclin D1能与miR-20a-5p相结合的3’UTR，设计引物，内含Spe I及Mlu I酶切位点，进行PCR扩增，回收得目的片段。上游引物为5’-GGACTAGTCTGTTGTAAGAATAGGCATTAA-3’，下游引物为5’-CGACGCGTTCATCCTGGCAATGTGAGAAT-3’。设计合成一对与miR-20a-5p完全互补的引物，内含有Spe I及Mlu I酶切位点，经过退火程序后得到阳性片段。上游引物为5’-GGACTAGTCTACCTGCACTATAAGCACTTTA-3’，下游引物为5’-CGACGCGTTAAAGTGCTTATAGTGCAGGTAG-3’。将上述两种片段分别行纯化、双酶切后连接入pMIR-REPORT荧光素酶载体。将载体转化感受态大肠杆菌，提取质粒后将双酶切正确的质粒进行测序，最终得到含有3’UTR的荧光素酶报告基因和含有阳性序列的荧光素酶报告基因。 转染前将293T细胞以4×105个/孔接种于24孔板，将荧光素酶报告基因、海肾荧光素酶质粒pRL-TK、miRNA联合转染293T细胞，转染过程按照LipofectamineTM2000脂质体说明书进行。转染后48 h进行双荧光检测，用PLB裂解液裂解细胞，然后加入LAR II，于发光仪检测得到荧光值M1。加入Stop