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摘 要 通过对Lactobacillus casei LK-1发酵火龙果进行研究，结果表明：该菌株发酵的生长特性，在16 h可达到发酵稳定期，发酵过程中可利用葡萄糖、果糖等作为代谢底物，代谢产生的是乳酸，而不是乙酸。火龙果在发酵18 h后，感官评价可接受程度最佳。
关键词 Lactobacillus casei LK-1 ；发酵 ；火龙果
中图分类号 Q939
Abstract This paper study fermentation of pitaya by Lactobacillus casei LK-1，reveals the growth characteristic of the strain fermentation，the fermentation in 16 h can achieve the fermentation stable phrase，the fermentation process in the use of glucose，fructose，etc as metabolic substrate metabolism to produce lactic acid，and does not produce acetic acid. After fermentation pitaya in fermentation 18 h，sensory evaluation get best result. This study will lay the foundation for the production of fermented fruit use probiotics.
Key words Lactobacillus casei LK-1 ； fermentation ； pitaya
益生菌是一大類对食用者身体健康能发挥有益作用的活菌。随着研究的深入，人们越来越清晰地认识到益生菌的功效，在健康人体肠道中，益生菌占肠道菌群的比例在25 %以上[1]。目前，已被证实的益生菌功能主要有促进消化、缓解压力、合成维生素、降低胆固醇水平、调节激素、提高免疫力、增强抗感染能力等功能[2]。现实生活中，有些因素会导致人体肠道的益生菌比例发生变化，导致菌群失衡，如饮食、工作压力、抗生素滥用等，造成体内益生菌大量减少。因此，人体应及时补充益生菌，为肠道创造一个适宜的环境，以便保持肠道益生菌群在正常水平[3]。
益生菌在发酵果蔬中的应用可追溯到20世纪60年代[4]。Pederson等[5]在1961年率先将纯种发酵接种技术应用于泡菜研究。随后，加拿大考德威尔生物发酵股份有限公司（Caldwell Bio FermentationCanadalnc）在1998年获得了复合菌种接种发酵蔬菜的专利技术。笔者以火龙果为材料，利用益生菌Lactobacillus casei LK-1进行发酵，研究其发酵特性及相关代谢变化，为火龙果的深加工开拓新方向。
1 材料与方法
1.1 材料
火龙果（市场购买）；Lactobacillus casei LK-1菌种（中国热带农业科学院农产品加工研究所保藏）；乳酸标品（sigma公司）；乙酸标品（sigma公司）；葡萄糖标品（sigma公司）；果糖标品（sigma公司）。打浆机（美的）；高压蒸汽灭菌锅（日本hirayama）；发酵罐（瑞士比欧）；无菌操作台；恒温培养箱；高效液相色谱（日本岛津）。
1.2 方法
1.2.1 发酵工艺流程
将新鲜火龙果去皮、打浆，加入10 %葡萄糖，105 ℃灭菌15 min，冷却后接入Lactobacillus casei LK-1发酵剂，接种量为万分之一，混匀后，于37 ℃恒温培养进行发酵。
1.2.2 生长特性研究
将打浆后的火龙果灭菌、接种，37 ℃恒温培养，每2 h取样测定发酵过程中活菌数、酸度和pH值的变化，共测定56 h。
1.2.3 发酵底物变化
将打浆后的火龙果灭菌、接种，37 ℃恒温培养，每2 h取样，利用HPLC检测发酵过程中蔗糖、葡萄糖、果糖的变化，重复3次。检测方法：将发酵液以12 000 r/min离心10 min，取上清经0.22 μm水系滤膜过滤，得到的滤液用于高效液相色谱分析。色谱条件：进样量20 μL，流动相为6 mmol/L硫酸溶液，流速为0.5 mL/min，柱温45 ℃，检测器为示差检测器。
1.2.4 发酵产物变化
将打浆后的火龙果灭菌、接种，37 ℃恒温培养，每2 h取样，利用HPLC检测发酵过程中乳酸、乙酸的变化趋势，重复3次。检测方法：将发酵液以12 000 r/min离心10 min，取上清经0.22 μm水系滤膜过滤，得到的滤液用于高效液相色谱分析。色谱条件：进样量20 μL，流动相为6 mmol/L硫酸溶液，流速为0.5 mL/min，柱温45 ℃，紫外检测器，检测波长205 nm。
1.2.5 感官评定
将发酵不同时间的火龙果进行感官评价，以色泽、风味、口感等为指标进行评价，感官评价采用10人随机取样盲测，进行打分，各指标满分均为10分。
1.2.6 活菌计数
取1 g样品加入9 mL无菌生理盐水中，梯度稀释至适当浓度，均匀涂布于MRS固体平板上，置于37 ℃恒温培养48 h，进行菌落技术，每个样重复3次。
1.2.7 数据处理
数据均利用origin作图，每个实验重复3次取平均值±SD。
2 结果分析
2.1 生长特性
Lactobacillus casei LK-1发酵火龙果的生长曲线见图1。由图1可以看出，0-4 h处于发酵延滞期，4-16 h为发酵对数生长期，16-36 h为稳定期，36-56 h为衰亡期。Lactobacillus casei LK-1呈现标准的“S”形生长曲线[5]。图2为Lactobacillus casei LK-1发酵火龙果pH及酸度变化，从图2可以看出，在发酵对数期，发酵火龙果pH和酸度都发生急剧变化，稳定期以后，仍然继续发酵产酸，酸度继续增加，而pH值变化较小。 2.2 发酵底物变化
乳酸菌发酵主要利用物料中的糖作为代谢底物，干酪乳杆菌可以利用葡萄糖，也可以利用果糖，发酵过程中，添加葡萄糖作为发酵底物，以提高发酵性能[6]。由图3可知，发酵过程中，葡萄糖的量逐渐少，说明发酵过程中菌株以葡萄糖作为代谢底物。同时，火龙果中含有丰富的果糖，菌株可以利用果糖作为代谢底物，果糖的量在发酵对数生长期急剧减少，说明发酵过程中消耗了果糖。
2.3 发酵代谢产物变化
图4为Lactobacillus casei LK-1发酵火龙果过程中代谢产物的变化，由图4可知，在发酵过程中，乳酸的含量在不断积累，而乙酸在整个过程中未被检测到。说明Lactobacillus casei LK-1在利用葡萄糖及果糖作为代谢底物时，进行同型发酵，仅产生乳酸。
2.4 感官评价
发酵过程中由于乳酸菌代谢产生大量有机酸及风味物质，对发酵的物质感官有很大影响[7]，通过对Lactobacillus casei LK-1发酵火龙果过程中不同时间感官进行评价，以得到最佳发酵时间，感官评价结果见图5。由图5可知，发酵18 h时，所选5个评价指标评价的分均最高，说明Lactobacillus casei LK-1发酵火龙果发酵时间为18 h时，可接受程度最高。因此，应选18 h作为火龙果最佳发酵时间。
3 结论
通过对Lactobacillus casei LK-1发酵火龙果进行研究，揭示了该菌株发酵的生长特性，在16 h可达到发酵稳定期，发酵过程中可利用葡萄糖、果糖等作为代谢底物，代谢产生的是乳酸，而不是乙酸。发酵火龙果在发酵18 h后，感官评价可接受程度最佳。本研究可为Lactobacillus casei LK-1发酵火龙果及热带水果的发酵奠定理论基础。
参考文献
[1] Holzapfel W H，Haberer P，Snel J，et al. Overview of gut flora and probiotics[J]. International Journal of Food Microbiology，1998，41（2）：85-101.
[2] Salminen S，Ouwehand A C，Isolauri E. Clinical applications of probiotic bacteria[J]. International Dairy Journal，1998，8（98）：563-572.
[3] 謝明勇，熊 涛，关倩倩. 益生菌发酵果蔬关键技术研究进展[J]. 中国食品学报，2014，14（10）：1-9.
[4] 李幼筠，甘 萍，黄水泉，等. 泡菜乳酸菌种的选育（一）[J]. 中国调味品，1996（10）：6-10.
[5] Pederson C S，Albury M N. The effect of pure culture inoculation on fermentation of cucumbers[J]. Food Technology，1961，15：351-354.
[6] Gardner N J，Savard T，Obermeier P，et al. Selection and characterization of mixed starter cultures for lactic acid fermentation of carrot，cabbage，beet and onion vegetable mixtures[J]. International Journal of Food Microbiology，2001，64（3）：261-75.
[7] Rodríguez-Gómez F，Romero-Gil V，Bautista-Gallego J，et al. Production of potential probiotic Spanish-style green table olives at pilot plant scale using multifunctional starters[J]. Food Microbiology，2014，44（6）：278-287.
关键词 Lactobacillus casei LK-1 ；发酵 ；火龙果
中图分类号 Q939
Abstract This paper study fermentation of pitaya by Lactobacillus casei LK-1，reveals the growth characteristic of the strain fermentation，the fermentation in 16 h can achieve the fermentation stable phrase，the fermentation process in the use of glucose，fructose，etc as metabolic substrate metabolism to produce lactic acid，and does not produce acetic acid. After fermentation pitaya in fermentation 18 h，sensory evaluation get best result. This study will lay the foundation for the production of fermented fruit use probiotics.
Key words Lactobacillus casei LK-1 ； fermentation ； pitaya
益生菌是一大類对食用者身体健康能发挥有益作用的活菌。随着研究的深入，人们越来越清晰地认识到益生菌的功效，在健康人体肠道中，益生菌占肠道菌群的比例在25 %以上[1]。目前，已被证实的益生菌功能主要有促进消化、缓解压力、合成维生素、降低胆固醇水平、调节激素、提高免疫力、增强抗感染能力等功能[2]。现实生活中，有些因素会导致人体肠道的益生菌比例发生变化，导致菌群失衡，如饮食、工作压力、抗生素滥用等，造成体内益生菌大量减少。因此，人体应及时补充益生菌，为肠道创造一个适宜的环境，以便保持肠道益生菌群在正常水平[3]。
益生菌在发酵果蔬中的应用可追溯到20世纪60年代[4]。Pederson等[5]在1961年率先将纯种发酵接种技术应用于泡菜研究。随后，加拿大考德威尔生物发酵股份有限公司（Caldwell Bio FermentationCanadalnc）在1998年获得了复合菌种接种发酵蔬菜的专利技术。笔者以火龙果为材料，利用益生菌Lactobacillus casei LK-1进行发酵，研究其发酵特性及相关代谢变化，为火龙果的深加工开拓新方向。
1 材料与方法
1.1 材料
火龙果（市场购买）；Lactobacillus casei LK-1菌种（中国热带农业科学院农产品加工研究所保藏）；乳酸标品（sigma公司）；乙酸标品（sigma公司）；葡萄糖标品（sigma公司）；果糖标品（sigma公司）。打浆机（美的）；高压蒸汽灭菌锅（日本hirayama）；发酵罐（瑞士比欧）；无菌操作台；恒温培养箱；高效液相色谱（日本岛津）。
1.2 方法
1.2.1 发酵工艺流程
将新鲜火龙果去皮、打浆，加入10 %葡萄糖，105 ℃灭菌15 min，冷却后接入Lactobacillus casei LK-1发酵剂，接种量为万分之一，混匀后，于37 ℃恒温培养进行发酵。
1.2.2 生长特性研究
将打浆后的火龙果灭菌、接种，37 ℃恒温培养，每2 h取样测定发酵过程中活菌数、酸度和pH值的变化，共测定56 h。
1.2.3 发酵底物变化
将打浆后的火龙果灭菌、接种，37 ℃恒温培养，每2 h取样，利用HPLC检测发酵过程中蔗糖、葡萄糖、果糖的变化，重复3次。检测方法：将发酵液以12 000 r/min离心10 min，取上清经0.22 μm水系滤膜过滤，得到的滤液用于高效液相色谱分析。色谱条件：进样量20 μL，流动相为6 mmol/L硫酸溶液，流速为0.5 mL/min，柱温45 ℃，检测器为示差检测器。
1.2.4 发酵产物变化
将打浆后的火龙果灭菌、接种，37 ℃恒温培养，每2 h取样，利用HPLC检测发酵过程中乳酸、乙酸的变化趋势，重复3次。检测方法：将发酵液以12 000 r/min离心10 min，取上清经0.22 μm水系滤膜过滤，得到的滤液用于高效液相色谱分析。色谱条件：进样量20 μL，流动相为6 mmol/L硫酸溶液，流速为0.5 mL/min，柱温45 ℃，紫外检测器，检测波长205 nm。
1.2.5 感官评定
将发酵不同时间的火龙果进行感官评价，以色泽、风味、口感等为指标进行评价，感官评价采用10人随机取样盲测，进行打分，各指标满分均为10分。
1.2.6 活菌计数
取1 g样品加入9 mL无菌生理盐水中，梯度稀释至适当浓度，均匀涂布于MRS固体平板上，置于37 ℃恒温培养48 h，进行菌落技术，每个样重复3次。
1.2.7 数据处理
数据均利用origin作图，每个实验重复3次取平均值±SD。
2 结果分析
2.1 生长特性
Lactobacillus casei LK-1发酵火龙果的生长曲线见图1。由图1可以看出，0-4 h处于发酵延滞期，4-16 h为发酵对数生长期，16-36 h为稳定期，36-56 h为衰亡期。Lactobacillus casei LK-1呈现标准的“S”形生长曲线[5]。图2为Lactobacillus casei LK-1发酵火龙果pH及酸度变化，从图2可以看出，在发酵对数期，发酵火龙果pH和酸度都发生急剧变化，稳定期以后，仍然继续发酵产酸，酸度继续增加，而pH值变化较小。 2.2 发酵底物变化
乳酸菌发酵主要利用物料中的糖作为代谢底物，干酪乳杆菌可以利用葡萄糖，也可以利用果糖，发酵过程中，添加葡萄糖作为发酵底物，以提高发酵性能[6]。由图3可知，发酵过程中，葡萄糖的量逐渐少，说明发酵过程中菌株以葡萄糖作为代谢底物。同时，火龙果中含有丰富的果糖，菌株可以利用果糖作为代谢底物，果糖的量在发酵对数生长期急剧减少，说明发酵过程中消耗了果糖。
2.3 发酵代谢产物变化
图4为Lactobacillus casei LK-1发酵火龙果过程中代谢产物的变化，由图4可知，在发酵过程中，乳酸的含量在不断积累，而乙酸在整个过程中未被检测到。说明Lactobacillus casei LK-1在利用葡萄糖及果糖作为代谢底物时，进行同型发酵，仅产生乳酸。
2.4 感官评价
发酵过程中由于乳酸菌代谢产生大量有机酸及风味物质，对发酵的物质感官有很大影响[7]，通过对Lactobacillus casei LK-1发酵火龙果过程中不同时间感官进行评价，以得到最佳发酵时间，感官评价结果见图5。由图5可知，发酵18 h时，所选5个评价指标评价的分均最高，说明Lactobacillus casei LK-1发酵火龙果发酵时间为18 h时，可接受程度最高。因此，应选18 h作为火龙果最佳发酵时间。
3 结论
通过对Lactobacillus casei LK-1发酵火龙果进行研究，揭示了该菌株发酵的生长特性，在16 h可达到发酵稳定期，发酵过程中可利用葡萄糖、果糖等作为代谢底物，代谢产生的是乳酸，而不是乙酸。发酵火龙果在发酵18 h后，感官评价可接受程度最佳。本研究可为Lactobacillus casei LK-1发酵火龙果及热带水果的发酵奠定理论基础。
参考文献
[1] Holzapfel W H，Haberer P，Snel J，et al. Overview of gut flora and probiotics[J]. International Journal of Food Microbiology，1998，41（2）：85-101.
[2] Salminen S，Ouwehand A C，Isolauri E. Clinical applications of probiotic bacteria[J]. International Dairy Journal，1998，8（98）：563-572.
[3] 謝明勇，熊 涛，关倩倩. 益生菌发酵果蔬关键技术研究进展[J]. 中国食品学报，2014，14（10）：1-9.
[4] 李幼筠，甘 萍，黄水泉，等. 泡菜乳酸菌种的选育（一）[J]. 中国调味品，1996（10）：6-10.
[5] Pederson C S，Albury M N. The effect of pure culture inoculation on fermentation of cucumbers[J]. Food Technology，1961，15：351-354.
[6] Gardner N J，Savard T，Obermeier P，et al. Selection and characterization of mixed starter cultures for lactic acid fermentation of carrot，cabbage，beet and onion vegetable mixtures[J]. International Journal of Food Microbiology，2001，64（3）：261-75.
[7] Rodríguez-Gómez F，Romero-Gil V，Bautista-Gallego J，et al. Production of potential probiotic Spanish-style green table olives at pilot plant scale using multifunctional starters[J]. Food Microbiology，2014，44（6）：278-287.