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摘要：目的 分析七方胃痛颗粒对人胃癌细胞凋亡的干预效果，并初步探讨其可能的作用机理。方法 对正常培养的人胃癌细胞采用梯度稀释的七方胃痛颗粒进行处理，通过四甲基偶氮唑蓝法（MTT）测定胃癌细胞增长情况，采用流式细胞术（Flow Cytometry，FCM）检测细胞周期变化情况，并通过检测细胞中三叶因子1和增殖细胞核抗原表达量来初步探讨七方胃痛颗粒对胃癌细胞凋亡的干预可能途径。结果 七方胃痛颗粒对胃癌细胞凋亡的干预与给药剂量和处理时间呈现正相关，其能使胃癌细胞停滞在G0/G1期，从而使胃癌细胞的死亡率显著增加（P<0.05）。流式分析结果表明给药后胃癌细胞中三叶因子1的表达量显著上调，差异显著（P<0.05），而增殖细胞核抗原的表达量显著下降，差异显著（P<0.05）。结论 七方胃痛颗粒中的活性成分能有效促进胃癌细胞的凋亡，其药效与剂量和作用时间呈正相关，其可能的作用机理与调控胃癌细胞中三叶因子1和增殖细胞核抗原的表达有关。
关键词：胃癌细胞；七方胃痛颗粒；流式细胞术；三叶因子1；增殖细胞核抗原
世界卫生组织报告表明，癌症的临床发病率在世界各国均表现出明显的逐年升高的趋势，较高的发病率和较高的病死率正严重威胁着人类的生命健康并且严重扰乱社会的安定。胃癌患者人数在目前临床癌症患者群体中占据了很大的比例，也是临床上消化科常见的恶性肿瘤之一，该病的临床发病率以及其病死率均较高，给人类的生命健康造成了十分严重的危害[1]。本研究通过细胞实验分析七方胃痛颗粒对人胃癌细胞凋亡的干预效果，并初步探讨其可能的作用机理。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 药物与细胞
七方胃痛颗粒为本课题组制备，主要由丹参、黄芪、白术、茯苓、甘草等中草药组成，原材料均由四川国康药业有限公司提供。胃癌细胞购自ATCC。
1.1.2 试剂与设备
RPMI 1640培养基、0.25%胰酶、胎牛血清（Hyclon公司），MTT、FITC酶标二抗（Sigma公司），小鼠抗人三叶因子1单克隆抗体、小鼠抗人增殖细胞核抗原单克隆抗体（Abcam公司），FACSCanto II型流式细胞仪（BD Biosciences公司），超净工作台、37℃孵箱（TherFisher公司）。
1.2 方法
1.2.1 细胞培养
胃癌细胞采用含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基进行培养，同时采用10%胎牛血清的RPMI 1640培养基将七方胃痛颗粒稀释成2g/mL、1 g/mL、0.5 g/mL三个浓度，在胃癌细胞汇合度达到80%时换成含不同浓度七方胃痛颗粒的10%胎牛血清的RPMI 1640培养基。
1.2.2 MTT检测细胞增殖情况
按照上述方法将胃癌细胞铺96孔板，汇合度达到80%换成含不同浓度七方胃痛颗粒的培养基（每个浓度重复4个孔），分别在处理后24、48、72h进行测定，测定前加入浓度为5mg/mL的MTT溶液20微升，37℃ 5%CO2孵箱孵育4h，之后弃去上清加入150微升的二甲基亚砜（DMSO）37℃孵育10min后，通过酶标仪测定OD490，细胞生长抑制率公式为（1-不同浓度组平均值/阴性对照组平均值）×100.00%。
1.2.3 细胞周期及蛋白表达量检测
将七方胃痛颗粒处理过的细胞在汇合度达到90%时，采用0.025%的胰酶消化成单细胞悬液，1000rpm离心5min，0.01M pH7.4的PBS吹打细胞两次，最后用PBS重悬，加入50μg/mL
碘化丙啶对核酸进行染色，之后上流式细胞仪，检测细胞周期。同样将不同浓度七方胃痛颗粒处理过的胃癌细胞汇合度达到70%时换培养液，分别在培养液中加入1：100稀释的小鼠抗人三叶因子1单克隆抗体和小鼠抗人增殖细胞核抗原单克隆抗体，过夜后去除培养上清，采用PBS洗涤5次，加入1：1000稀释的FITC酶标二抗，之后上流式细胞仪进行分析。
1.3 统计学方法
本研究中的实验数据均采用SPSS 20.0统计软件对数据进行处理分析，计量资料采用均数±标准差（ ±s）来表示，组间比较采用t检验，P<0.05认为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 不同浓度药物的细胞抑制率及细胞周期的影响
2g/mL、1 g/mL、0.5 g/mL三个浓度的七方胃痛颗粒分别在24、48、72h进行测定细胞抑制率结果表明七方胃痛颗粒对胃癌细胞凋亡的干预与给药剂量和处理时间呈现正相关。流式分析结果表明，胃癌细胞停滞在G0/G1期，从而使胃癌细胞的死亡率显著增加，具体数据
2.2 不同浓度药物对三叶因子1及增殖细胞核抗原表达量影响
流式分析结果表明给药后胃癌细胞中三叶因子1的表达量显著上调，差异显著（P<0.05），而增殖细胞核抗原的表达量显著下降，差异显著（P<0.05），具体数据。
3 讨论
正常生理状态下胃黏膜的完整性维持需要依靠胃黏膜上皮细胞增殖与自然凋亡，细胞凋亡（Cell apoptosis）又成为细胞程序性死亡是机体细胞在基因组遗传信息的调控下的有序的死亡，这一机制不仅在维持人类正常的机体生长发育和保持机体各个系统功能稳定中起到重要调节作用，并且与病理情况下肿瘤组织的发生和维持有着十分密切的联系[2]。研究表明[3]，肿瘤组织产生的机制与细胞过度增殖以及细胞凋亡不足有关。七方胃痛颗粒丹参、黄芪、白术、茯苓、甘草等中草药组成，现代中药药效学研究结果表明，丹参、黄芪等中药能够有效抑制肿瘤组织中细胞核酸的合成，同时还能调节机体在抗肿瘤免疫方面的能力，从而起到直接杀伤肿瘤细胞的效果[4]。本研究结果表明，七方胃痛颗粒对胃癌细胞凋亡的干预与给药剂量和处理时间呈现正相关，其能使胃癌细胞停滞在G0/G1期，从而使胃癌细胞的死亡率显著增加（P<0.05），0.2g/mL组72h抑制率能达到。流式分析结果表明给药后胃癌细胞中三叶因子1的表达量显著上调，差异显著（P<0.05），而增殖细胞核抗原的表达量显著下降，差异显著（P<0.05）。
综上所述，七方胃痛颗粒中的活性成分能有效促进胃癌细胞的凋亡，其药效与剂量和作用时间呈正相关，其可能的作用机理与调控胃癌细胞中三叶因子1和增殖细胞核抗原的表达有关。
参考文献：
[1]莫喜晶，曾光，陈国忠.七方胃痛颗粒对H.pylori感染的AGS细胞TFF1表达及ERK/NF-κB信号通路的影响[J].世界华人消化杂志，2012，34：3292-3298.
[2]莫喜晶，陈国忠，曾光，等.七方胃痛颗粒对人胃腺癌细胞增殖凋亡的影响[J].广西中医药，2013，01：45-47.
[3]唐梅文，黄勇华，陈国忠，等.七方胃痛颗粒对PU患者T淋巴细胞亚群与TNF-α的影响[J].广西医科大学学报，2010，01：90-91.
[4]谢少茹.黄芪多糖调控胃癌细胞COX-2表达和凋亡的研究[D].南京中医药大学，2007.
关键词：胃癌细胞；七方胃痛颗粒；流式细胞术；三叶因子1；增殖细胞核抗原
世界卫生组织报告表明，癌症的临床发病率在世界各国均表现出明显的逐年升高的趋势，较高的发病率和较高的病死率正严重威胁着人类的生命健康并且严重扰乱社会的安定。胃癌患者人数在目前临床癌症患者群体中占据了很大的比例，也是临床上消化科常见的恶性肿瘤之一，该病的临床发病率以及其病死率均较高，给人类的生命健康造成了十分严重的危害[1]。本研究通过细胞实验分析七方胃痛颗粒对人胃癌细胞凋亡的干预效果，并初步探讨其可能的作用机理。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 药物与细胞
七方胃痛颗粒为本课题组制备，主要由丹参、黄芪、白术、茯苓、甘草等中草药组成，原材料均由四川国康药业有限公司提供。胃癌细胞购自ATCC。
1.1.2 试剂与设备
RPMI 1640培养基、0.25%胰酶、胎牛血清（Hyclon公司），MTT、FITC酶标二抗（Sigma公司），小鼠抗人三叶因子1单克隆抗体、小鼠抗人增殖细胞核抗原单克隆抗体（Abcam公司），FACSCanto II型流式细胞仪（BD Biosciences公司），超净工作台、37℃孵箱（TherFisher公司）。
1.2 方法
1.2.1 细胞培养
胃癌细胞采用含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基进行培养，同时采用10%胎牛血清的RPMI 1640培养基将七方胃痛颗粒稀释成2g/mL、1 g/mL、0.5 g/mL三个浓度，在胃癌细胞汇合度达到80%时换成含不同浓度七方胃痛颗粒的10%胎牛血清的RPMI 1640培养基。
1.2.2 MTT检测细胞增殖情况
按照上述方法将胃癌细胞铺96孔板，汇合度达到80%换成含不同浓度七方胃痛颗粒的培养基（每个浓度重复4个孔），分别在处理后24、48、72h进行测定，测定前加入浓度为5mg/mL的MTT溶液20微升，37℃ 5%CO2孵箱孵育4h，之后弃去上清加入150微升的二甲基亚砜（DMSO）37℃孵育10min后，通过酶标仪测定OD490，细胞生长抑制率公式为（1-不同浓度组平均值/阴性对照组平均值）×100.00%。
1.2.3 细胞周期及蛋白表达量检测
将七方胃痛颗粒处理过的细胞在汇合度达到90%时，采用0.025%的胰酶消化成单细胞悬液，1000rpm离心5min，0.01M pH7.4的PBS吹打细胞两次，最后用PBS重悬，加入50μg/mL
碘化丙啶对核酸进行染色，之后上流式细胞仪，检测细胞周期。同样将不同浓度七方胃痛颗粒处理过的胃癌细胞汇合度达到70%时换培养液，分别在培养液中加入1：100稀释的小鼠抗人三叶因子1单克隆抗体和小鼠抗人增殖细胞核抗原单克隆抗体，过夜后去除培养上清，采用PBS洗涤5次，加入1：1000稀释的FITC酶标二抗，之后上流式细胞仪进行分析。
1.3 统计学方法
本研究中的实验数据均采用SPSS 20.0统计软件对数据进行处理分析，计量资料采用均数±标准差（ ±s）来表示，组间比较采用t检验，P<0.05认为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 不同浓度药物的细胞抑制率及细胞周期的影响
2g/mL、1 g/mL、0.5 g/mL三个浓度的七方胃痛颗粒分别在24、48、72h进行测定细胞抑制率结果表明七方胃痛颗粒对胃癌细胞凋亡的干预与给药剂量和处理时间呈现正相关。流式分析结果表明，胃癌细胞停滞在G0/G1期，从而使胃癌细胞的死亡率显著增加，具体数据
2.2 不同浓度药物对三叶因子1及增殖细胞核抗原表达量影响
流式分析结果表明给药后胃癌细胞中三叶因子1的表达量显著上调，差异显著（P<0.05），而增殖细胞核抗原的表达量显著下降，差异显著（P<0.05），具体数据。
3 讨论
正常生理状态下胃黏膜的完整性维持需要依靠胃黏膜上皮细胞增殖与自然凋亡，细胞凋亡（Cell apoptosis）又成为细胞程序性死亡是机体细胞在基因组遗传信息的调控下的有序的死亡，这一机制不仅在维持人类正常的机体生长发育和保持机体各个系统功能稳定中起到重要调节作用，并且与病理情况下肿瘤组织的发生和维持有着十分密切的联系[2]。研究表明[3]，肿瘤组织产生的机制与细胞过度增殖以及细胞凋亡不足有关。七方胃痛颗粒丹参、黄芪、白术、茯苓、甘草等中草药组成，现代中药药效学研究结果表明，丹参、黄芪等中药能够有效抑制肿瘤组织中细胞核酸的合成，同时还能调节机体在抗肿瘤免疫方面的能力，从而起到直接杀伤肿瘤细胞的效果[4]。本研究结果表明，七方胃痛颗粒对胃癌细胞凋亡的干预与给药剂量和处理时间呈现正相关，其能使胃癌细胞停滞在G0/G1期，从而使胃癌细胞的死亡率显著增加（P<0.05），0.2g/mL组72h抑制率能达到。流式分析结果表明给药后胃癌细胞中三叶因子1的表达量显著上调，差异显著（P<0.05），而增殖细胞核抗原的表达量显著下降，差异显著（P<0.05）。
综上所述，七方胃痛颗粒中的活性成分能有效促进胃癌细胞的凋亡，其药效与剂量和作用时间呈正相关，其可能的作用机理与调控胃癌细胞中三叶因子1和增殖细胞核抗原的表达有关。
参考文献：
[1]莫喜晶，曾光，陈国忠.七方胃痛颗粒对H.pylori感染的AGS细胞TFF1表达及ERK/NF-κB信号通路的影响[J].世界华人消化杂志，2012，34：3292-3298.
[2]莫喜晶，陈国忠，曾光，等.七方胃痛颗粒对人胃腺癌细胞增殖凋亡的影响[J].广西中医药，2013，01：45-47.
[3]唐梅文，黄勇华，陈国忠，等.七方胃痛颗粒对PU患者T淋巴细胞亚群与TNF-α的影响[J].广西医科大学学报，2010，01：90-91.
[4]谢少茹.黄芪多糖调控胃癌细胞COX-2表达和凋亡的研究[D].南京中医药大学，2007.