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摘要：目前国外对发酵法生产乳清蛋白抗氧化肽进行了研究，而国内在这一领域的研究则未见报道。采用微生物法制备生物活性肽，微生物发酵过程中产生的蛋白酶可以降解蛋白质，将蛋白酶的发酵生产和乳蛋白肽的酶解生产结合在一起，大大降低了乳蛋白肽的生产成本，有更好的应用前景。
关键词：乳清抗氧化肽 氧自由基清除率 水解率
生物活性肽，是指对生物机体的生命活动有益或具有生理作用的肽类化合物，近年来，对乳源性生物活性肽构效关系方面的研究进展迅速，乳蛋白被裂解成小分子肽后具有特殊的生物学功能，研究发现乳清蛋白水解物也其有多种药理及活性功能，如降血压【1】、抗血栓【2】、降胆固醇【3】，免疫调节【4】等。
一、制备材料与方法
1.1制备材料
脱盐乳清粉，脱脂奶粉，茚三酮、果糖、三氯乙酸、氯化纳、琼脂、酵母粉、葡萄糖、醋酸钠、硫酸镁、硫酸锰、茚三酮、果糖、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、甘氨酸等试剂均为国产。
1.2菌株
植物乳杆菌A9，东北农业大学食品学院提供；保加利亚杆菌L6、嗜热链球菌S21、嗜热链球菌S1、保加利亚杆菌L34.5、嗜热链球菌SP1.1，哈尔滨工业大学食品科学与工程学院提供。
1.3培养基
MRS培养基；牛肉膏10g/L，蛋白10g/L，酵母粉5g/L，，葡萄糖20g/L，，醋酸钠5g/L，柠檬酸二铵2g/L，吐温80 0.1g/L，硫酸镁0.58g/L，硫酸锰0.28g/L（均为质量浓度），PH值为6.2-6.4。
脱脂乳培养基为脱脂奶粉（质量浓度为11g/L）。
1.4方法
1.4.1菌种活化
A9接入MRS液体培养基，37℃静止培养36h活化；L34.5、L6、SP1.1、S1、S21接入脱脂乳培养基，37℃静止培养10h活化。
1.4.2乳清蛋白的酶法水解工艺流程
乳清粉一复原（100%）—105℃灭菌15min—接菌—静止培养—沸水浴加热10 min钝化酶—测水解度—400rpm，20min离心取上清液—测抗氧化活性
1.4.3乳清的发酵实验
乳清粉按10%复原后，在105℃下灭菌15min，冷却后接入菌种，置于培养箱中静止发酵，研究菌种、菌种比、发酵温度、发酵时间、接种量、初始pH值对乳清发酵生产抗氧化肽的影响，并优化发酵工艺。
1.4.4乳清多肽抗氧化活性测定
采用邻苯三酚自氧化法测定【5】。在试管中依次加入4.5ml 0.1mol/L（pH8.2，内含2mmol/L EDTA）缓冲溶液，4.2mL双蒸水，于25℃恒温20min后加入25℃预热过的0.33mL 3mmoL/L邻苯三酚溶液（以10mmoL/L HCL配置，对照管用10mmoL/L盐酸代替），迅速摇匀，立即倾入比色皿中，在波长325nm处每30s测定一次吸光值A，计算线性范围内每分钟A的增值，此即为邻苯三酚的自氧化速率A0。乳清抗氧化肽活性测定按上述操作，加入邻苯三酚前，先加入一定量样液，并减少同体积双蒸水，其它操作均与上述相同，所测吸光度为A1。清除率/%=A0-A1/A0*100%
1.4.5水解度（DH）的测定 茚三酮显色法
（1）标准曲线的绘制。采用茚三嗣法进行测定绘制标准曲线【6】。
茚三酮显色剂的配制：茚三酮0.5g，果糖0.3g，Na2HP04·1OH20 10g，KH2PO4 6g，定容至100mL。
（2）水解蛋白液中-NH2基的测定
取离心液0.5mL定容至50mL，取0.4mL稀释液于试管中并加入1.6mL蒸馏水、1mL显色剂，混匀后置沸水浴中加热15min，同时作空白实验，以后操作同标准曲线。利用标准曲线计算水解蛋白液中-NH2的浓度（mmol/L）。DH/%=（水解后-NH2含量-水解前-NH2含量）/6.25*100%。式中：htot为每克蛋白质的肽键毫摩尔数，查得乳清蛋白htot=8.8（mmol/g）；6.25N为水解底物蛋白质质量浓度（g/L）测得为11.66。
1.4.6肽含量测定
用三氯乙酸可溶性氮含量来反映肽的含量。取10mL发酵后的离心上清液于离心管中，加入lOmL 20%的TCA溶液，混匀后400rpm离心20min，取上清液用考马斯亮蓝法测定蛋白含量【3.15】。
二、实验结果与分析
2.1水解度（DH）计算
2.1.1标准曲线的确定
本研究采用水和茚三酮法测定水解蛋白质的水解度，按照标准曲线绘制的方法制，结果如图2-l所示。
图2-1 不同质量浓度甘氨酸溶液A-C关系曲线
2.2乳清发酵菌种的选择
2.2.1单菌培养对乳清蛋白水解度和发酵产物氧自由基清除率的影响
图2-2单菌发酵产物氧自由基清除率和水解度比较
将A9、L6、L34.5、S21、SP1.1和S1分别接入经过灭菌的乳清复原液中，由图2-2可知，单一菌株发酵以SP1.1为最好，其他菌株的发酵产物对氧自由基清除率都有不同程度降低。
2.2.2混菌培养对乳清蛋白水解度和发酵产物氧自由基清除率的影响
本实验中将保加利亚乳杆菌与嗜热链球菌混合以1：1的比例接入乳清培养基中，接种量为4%，自然pH值（6.4），37℃静止培养24h，结束后测定发酵产物抗氧化活性和水解度，如图2-3。
图2-3 混菌发酵产物氧自由基清除率和水解度比较
由图2-3可知，与单菌培养相比，混菌培养后乳清蛋白水解度有明显提高，一些组合产生的发酵产物氧自由基的清除率也有一定提高。 2.3乳清抗氧化肽发酵条件的优化
2.3.1接种量对乳清发酵产物氧自由基清除率的影响
图2-4接种量对氧自由基清除率的影响
接种量的大小会直接影响发酵周期，增加接种量可以缩短发酵周期，减少染菌的机会。如图2-4所示，当接种量在4%时接入的种子量基本达到饱和。
2.3.2菌种比对乳清发酵产物氧自由基清除率的影响
固定接种量4%，发酵温度37℃，发酵时间24h，乳清初始pH值为6.4，研究产物氧自由基清除率随菌种比的变化情况，结果如图2-5所示。
图2-5菌种比对乳清发酵产物氧自由基清除率的影响
由图2-5看出，当保加利亚杆菌L34.5，与嗜热链球菌S1菌种混合比例为1：1时，产物的氧自由基清除率较高。所以，在以后的发酵实验中，L34.5与S1菌种混合配比量均采用1：1。
2.3.3温度对乳清发酵产物氧自由基清除率的影响
图2-6 温度对氧自由基清除率的影响
培养温度影响乳酸茵的生长和混合生长的菌株的比例，从而影响着代谢产物的形成。如图2-6所示。产物氧自由基清除率随温度升高而逐步增加。当超过37℃后开始变得平缓，42℃时达到最高值36.07%。
2.3.4乳清初始pH值对乳清发酵产物氧自由基清除率的影响
pH值影响乳酸菌对营养物质的吸收以及胞内酶的活性从而影响着菌种的代谢。固定接种量4%，发酵时间24h，发酵温度42℃，菌种比l：l；研究产物氧自由基清除率随培养液初始pH值的变化情况，结果如图2-7所示。
图2-7 初始pH值对氧自由基清除率的影响
当初始pH值为5至6时，产物对超氧阴离子的抑制率逐渐升高。当pH值超过6以后，产物对氧自由基的清除率呈下降趋势，因此选择pH值6为发酵液的初始值。
2.3.5发酵时间对乳清发酵产物氧自由基清除率的影响
菌体的生长繁殖、产酶及代谢随培养时间而变化，要获得最大的抗氧化活性，必须控制培养时间。发酵时间影响见图2-8。
图2-8 时间对氧自由基清除率的影响
在开始阶段，产物的氧自由基清除率活性快速升高，发酵16h后其抑制率增长放缓，维持在一个恒定的水平，因此选择16h为一个发酵周期。
2.3.6正交实验
在筛选乳酸菌菌种基础上固定发酵时间16h，选取接种量、发酵温度和pH值三个因素通过L9（33）正交表进行培养优化实验，以期得到最佳的发酵培养条件。实验设计及正交实验结果见表2-l和表2-2。
表2-1极差分析的结果显示各因素对乳清发酵的影响程度依次为初始PH值>发酵温度>接种量，乳清发酵最佳工艺条件为接种量5%、发酵湿度37℃和初始pH值6.4。表2-2是该正交实验方案下乳清蛋白水解度结果的比较，极差分析表明初始PH值是影响乳清蛋白水解度的主要因素，各因素对乳清发酵的影响程度依次为初始pH值>接种量>发酵温度，两者的结果不尽一致，可能与产物中肽、氨基酸的组成和含量有关。
在乳清发酵液氧自由基清除率最佳的工艺条件下，即接种量5%、发酵温度37℃，初始PH值6.4，我们进行了验证实验，结果见2-3，测的乳清水解产物氧自由基清除率为39.45%，此时乳清蛋白水解度为9.75%，肽含量为2.62mg/mL。
本研究针对发酵法制备乳清抗氧化活性肽的研究作了初步的探讨，对乳酸菌发酵培养乳清溶液产生乳清抗氧化肽的条件进行了优化，最佳工艺条件为：发酵初始pH值6.4，发酵温度37℃，接种量5%，发酵时间为16h，在此条件下测得乳清水解产物O2除率为39.45%，水解度为9.75%，肽含量为2.62mg/mL。研究证实乳酸菌益生菌种属于蛋白水解能力较强的菌种，可
通过发酵水解乳清蛋白产生一些具有生物活性的小分子多肽，目前具有良好的发展趋势，可以为功能性食品的开发提供实验技术支持，同时也为乳清资源的利用奠定了基础。
参考文献
[1]I.M.P.L.V.O.Ferreira，O.Pinho，M.V.Mota，etal.Preparation of ingredients containing anACE-inhibitory pepide by tryptic hydrolysis of whey protein concentrates.International Dairy Journal，2007，17（5）：481-487
[2]Yuxing Guo，Daodong Pan，Masaru Tanokura.Optimisation of hydrolysis conditions for the production of the angiotensin-I converting enzyme（ACE） inhibitory peptides from whey protein usinggresponse surface methodology.Food Chemistry，2009，114：328-533
[3]任雁，赵丹，张烨等《乳清蛋白的功能成分及其主要应用》，《中国食品添加剂》，2007，1：145
[4]包怡红《功能性乳清的综合利用》，《食品与机械》，2001，1：11
[5]邹国林，桂兴芬等《一种SOD的测活方法》，《生物化学与生物物理进展》，1986，4：71-73
[6]赵新淮，冯志彪《大豆蛋白水解物水解度测定的研究》，《东北农业大学学报》，1995，26（2）：178-181
关键词：乳清抗氧化肽 氧自由基清除率 水解率
生物活性肽，是指对生物机体的生命活动有益或具有生理作用的肽类化合物，近年来，对乳源性生物活性肽构效关系方面的研究进展迅速，乳蛋白被裂解成小分子肽后具有特殊的生物学功能，研究发现乳清蛋白水解物也其有多种药理及活性功能，如降血压【1】、抗血栓【2】、降胆固醇【3】，免疫调节【4】等。
一、制备材料与方法
1.1制备材料
脱盐乳清粉，脱脂奶粉，茚三酮、果糖、三氯乙酸、氯化纳、琼脂、酵母粉、葡萄糖、醋酸钠、硫酸镁、硫酸锰、茚三酮、果糖、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、甘氨酸等试剂均为国产。
1.2菌株
植物乳杆菌A9，东北农业大学食品学院提供；保加利亚杆菌L6、嗜热链球菌S21、嗜热链球菌S1、保加利亚杆菌L34.5、嗜热链球菌SP1.1，哈尔滨工业大学食品科学与工程学院提供。
1.3培养基
MRS培养基；牛肉膏10g/L，蛋白10g/L，酵母粉5g/L，，葡萄糖20g/L，，醋酸钠5g/L，柠檬酸二铵2g/L，吐温80 0.1g/L，硫酸镁0.58g/L，硫酸锰0.28g/L（均为质量浓度），PH值为6.2-6.4。
脱脂乳培养基为脱脂奶粉（质量浓度为11g/L）。
1.4方法
1.4.1菌种活化
A9接入MRS液体培养基，37℃静止培养36h活化；L34.5、L6、SP1.1、S1、S21接入脱脂乳培养基，37℃静止培养10h活化。
1.4.2乳清蛋白的酶法水解工艺流程
乳清粉一复原（100%）—105℃灭菌15min—接菌—静止培养—沸水浴加热10 min钝化酶—测水解度—400rpm，20min离心取上清液—测抗氧化活性
1.4.3乳清的发酵实验
乳清粉按10%复原后，在105℃下灭菌15min，冷却后接入菌种，置于培养箱中静止发酵，研究菌种、菌种比、发酵温度、发酵时间、接种量、初始pH值对乳清发酵生产抗氧化肽的影响，并优化发酵工艺。
1.4.4乳清多肽抗氧化活性测定
采用邻苯三酚自氧化法测定【5】。在试管中依次加入4.5ml 0.1mol/L（pH8.2，内含2mmol/L EDTA）缓冲溶液，4.2mL双蒸水，于25℃恒温20min后加入25℃预热过的0.33mL 3mmoL/L邻苯三酚溶液（以10mmoL/L HCL配置，对照管用10mmoL/L盐酸代替），迅速摇匀，立即倾入比色皿中，在波长325nm处每30s测定一次吸光值A，计算线性范围内每分钟A的增值，此即为邻苯三酚的自氧化速率A0。乳清抗氧化肽活性测定按上述操作，加入邻苯三酚前，先加入一定量样液，并减少同体积双蒸水，其它操作均与上述相同，所测吸光度为A1。清除率/%=A0-A1/A0*100%
1.4.5水解度（DH）的测定 茚三酮显色法
（1）标准曲线的绘制。采用茚三嗣法进行测定绘制标准曲线【6】。
茚三酮显色剂的配制：茚三酮0.5g，果糖0.3g，Na2HP04·1OH20 10g，KH2PO4 6g，定容至100mL。
（2）水解蛋白液中-NH2基的测定
取离心液0.5mL定容至50mL，取0.4mL稀释液于试管中并加入1.6mL蒸馏水、1mL显色剂，混匀后置沸水浴中加热15min，同时作空白实验，以后操作同标准曲线。利用标准曲线计算水解蛋白液中-NH2的浓度（mmol/L）。DH/%=（水解后-NH2含量-水解前-NH2含量）/6.25*100%。式中：htot为每克蛋白质的肽键毫摩尔数，查得乳清蛋白htot=8.8（mmol/g）；6.25N为水解底物蛋白质质量浓度（g/L）测得为11.66。
1.4.6肽含量测定
用三氯乙酸可溶性氮含量来反映肽的含量。取10mL发酵后的离心上清液于离心管中，加入lOmL 20%的TCA溶液，混匀后400rpm离心20min，取上清液用考马斯亮蓝法测定蛋白含量【3.15】。
二、实验结果与分析
2.1水解度（DH）计算
2.1.1标准曲线的确定
本研究采用水和茚三酮法测定水解蛋白质的水解度，按照标准曲线绘制的方法制，结果如图2-l所示。
图2-1 不同质量浓度甘氨酸溶液A-C关系曲线
2.2乳清发酵菌种的选择
2.2.1单菌培养对乳清蛋白水解度和发酵产物氧自由基清除率的影响
图2-2单菌发酵产物氧自由基清除率和水解度比较
将A9、L6、L34.5、S21、SP1.1和S1分别接入经过灭菌的乳清复原液中，由图2-2可知，单一菌株发酵以SP1.1为最好，其他菌株的发酵产物对氧自由基清除率都有不同程度降低。
2.2.2混菌培养对乳清蛋白水解度和发酵产物氧自由基清除率的影响
本实验中将保加利亚乳杆菌与嗜热链球菌混合以1：1的比例接入乳清培养基中，接种量为4%，自然pH值（6.4），37℃静止培养24h，结束后测定发酵产物抗氧化活性和水解度，如图2-3。
图2-3 混菌发酵产物氧自由基清除率和水解度比较
由图2-3可知，与单菌培养相比，混菌培养后乳清蛋白水解度有明显提高，一些组合产生的发酵产物氧自由基的清除率也有一定提高。 2.3乳清抗氧化肽发酵条件的优化
2.3.1接种量对乳清发酵产物氧自由基清除率的影响
图2-4接种量对氧自由基清除率的影响
接种量的大小会直接影响发酵周期，增加接种量可以缩短发酵周期，减少染菌的机会。如图2-4所示，当接种量在4%时接入的种子量基本达到饱和。
2.3.2菌种比对乳清发酵产物氧自由基清除率的影响
固定接种量4%，发酵温度37℃，发酵时间24h，乳清初始pH值为6.4，研究产物氧自由基清除率随菌种比的变化情况，结果如图2-5所示。
图2-5菌种比对乳清发酵产物氧自由基清除率的影响
由图2-5看出，当保加利亚杆菌L34.5，与嗜热链球菌S1菌种混合比例为1：1时，产物的氧自由基清除率较高。所以，在以后的发酵实验中，L34.5与S1菌种混合配比量均采用1：1。
2.3.3温度对乳清发酵产物氧自由基清除率的影响
图2-6 温度对氧自由基清除率的影响
培养温度影响乳酸茵的生长和混合生长的菌株的比例，从而影响着代谢产物的形成。如图2-6所示。产物氧自由基清除率随温度升高而逐步增加。当超过37℃后开始变得平缓，42℃时达到最高值36.07%。
2.3.4乳清初始pH值对乳清发酵产物氧自由基清除率的影响
pH值影响乳酸菌对营养物质的吸收以及胞内酶的活性从而影响着菌种的代谢。固定接种量4%，发酵时间24h，发酵温度42℃，菌种比l：l；研究产物氧自由基清除率随培养液初始pH值的变化情况，结果如图2-7所示。
图2-7 初始pH值对氧自由基清除率的影响
当初始pH值为5至6时，产物对超氧阴离子的抑制率逐渐升高。当pH值超过6以后，产物对氧自由基的清除率呈下降趋势，因此选择pH值6为发酵液的初始值。
2.3.5发酵时间对乳清发酵产物氧自由基清除率的影响
菌体的生长繁殖、产酶及代谢随培养时间而变化，要获得最大的抗氧化活性，必须控制培养时间。发酵时间影响见图2-8。
图2-8 时间对氧自由基清除率的影响
在开始阶段，产物的氧自由基清除率活性快速升高，发酵16h后其抑制率增长放缓，维持在一个恒定的水平，因此选择16h为一个发酵周期。
2.3.6正交实验
在筛选乳酸菌菌种基础上固定发酵时间16h，选取接种量、发酵温度和pH值三个因素通过L9（33）正交表进行培养优化实验，以期得到最佳的发酵培养条件。实验设计及正交实验结果见表2-l和表2-2。
表2-1极差分析的结果显示各因素对乳清发酵的影响程度依次为初始PH值>发酵温度>接种量，乳清发酵最佳工艺条件为接种量5%、发酵湿度37℃和初始pH值6.4。表2-2是该正交实验方案下乳清蛋白水解度结果的比较，极差分析表明初始PH值是影响乳清蛋白水解度的主要因素，各因素对乳清发酵的影响程度依次为初始pH值>接种量>发酵温度，两者的结果不尽一致，可能与产物中肽、氨基酸的组成和含量有关。
在乳清发酵液氧自由基清除率最佳的工艺条件下，即接种量5%、发酵温度37℃，初始PH值6.4，我们进行了验证实验，结果见2-3，测的乳清水解产物氧自由基清除率为39.45%，此时乳清蛋白水解度为9.75%，肽含量为2.62mg/mL。
本研究针对发酵法制备乳清抗氧化活性肽的研究作了初步的探讨，对乳酸菌发酵培养乳清溶液产生乳清抗氧化肽的条件进行了优化，最佳工艺条件为：发酵初始pH值6.4，发酵温度37℃，接种量5%，发酵时间为16h，在此条件下测得乳清水解产物O2除率为39.45%，水解度为9.75%，肽含量为2.62mg/mL。研究证实乳酸菌益生菌种属于蛋白水解能力较强的菌种，可
通过发酵水解乳清蛋白产生一些具有生物活性的小分子多肽，目前具有良好的发展趋势，可以为功能性食品的开发提供实验技术支持，同时也为乳清资源的利用奠定了基础。
参考文献
[1]I.M.P.L.V.O.Ferreira，O.Pinho，M.V.Mota，etal.Preparation of ingredients containing anACE-inhibitory pepide by tryptic hydrolysis of whey protein concentrates.International Dairy Journal，2007，17（5）：481-487
[2]Yuxing Guo，Daodong Pan，Masaru Tanokura.Optimisation of hydrolysis conditions for the production of the angiotensin-I converting enzyme（ACE） inhibitory peptides from whey protein usinggresponse surface methodology.Food Chemistry，2009，114：328-533
[3]任雁，赵丹，张烨等《乳清蛋白的功能成分及其主要应用》，《中国食品添加剂》，2007，1：145
[4]包怡红《功能性乳清的综合利用》，《食品与机械》，2001，1：11
[5]邹国林，桂兴芬等《一种SOD的测活方法》，《生物化学与生物物理进展》，1986，4：71-73
[6]赵新淮，冯志彪《大豆蛋白水解物水解度测定的研究》，《东北农业大学学报》，1995，26（2）：178-181