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【摘 要】 目的：研究并比较MTA及iRoot BP Plus对人牙髓干细胞（human dental pulp stem cells， hDPSCs）增殖活性的影响。方法：将MTA及iRoot BP Plus制备成浓度稀释比例为0、0.001、0.01、0.1、0.2、1的条件浸取液，检测培养1、3、7天时细胞的增殖活性及3、7天时的碱性磷酸酶（alkaline phosphatase， AKP）表达量。结果：使用不同浓度的MTA及iRoot BP Plus浸取液培养hDPSCs时，随着培养时间的增加，细胞数量显著增多（p <0.05）。但高浓度（稀释比例为1）MTA浸取液存在明显的细胞毒性作用。在相同培养时间下，iRoot BP Plus比相同稀释比例的MTA更能促进hDPSCs的增殖且高浓度培养无细胞毒性。使用不同浓度的MTA及iRoot BP Plus浸取液培养hDPSCs时，随着培养时间的增加，AKP表达量显著增高（p <0.05）。但在高浓度iRoot BP Plus组中，hDPSCs的AKP表达量随时间明显下降。在相同浓度下，iRoot BP Plus组的第3天AKP表达量普遍高于MTA组;但低浓度（稀释比例0.001）AKP表达量低于MTA组（p <0.05）。在低浓度下（比例为0.001及0.01），iRoot BP Plus组第7天的AKP表达量普遍高于MTA组（p <0.05）;但高浓度（比例为0.1、0.2和1）的AKP水平低于MTA组（p <0.05）。结论： MTA对hDPSCs的促矿化能力较强，但高浓度下存在一定的细胞毒性作用。iRoot BP Plus相较MTA具有更好的生物相容性，不会抑制hDPSCs增殖分化。但两者均对细胞的AKP表达量具有一定的抑制作用，且随着培养时间的增加，高浓度时iRoot BP Plus的抑制作用更为显著。
【关键词】牙髓干细胞;MTA;iRoot BP Plus;碱性磷酸酶;细胞活性
【中图分类号】R181.3+2 【文献标识码】A 【文章编号】1004-7484（2019）10-0184-03
牙髓干细胞（Dental Pulp Stem Cells，DPSCs）是位于牙髓内的成体干细胞，由神经嵴发育而来[1，2]。DPSCs广泛存在于成熟及年轻恒牙根尖底部，可以定植在根管壁上，进而分化为成骨细胞，能形成牙本质- 牙髓样结构，在牙髓再生术中发挥着重要作用[3，4]。
生物陶瓷材料MTA（Mineral Trioxide Aggregate）及iRoot BP plus作为新兴的髓腔修补及盖髓材料，相较传统修复材料具有更好的生物相容性、稳定性、抗菌性和细胞安全性。MTA可诱导细胞成骨、硬组织形成[5-7]，但同时也存在着操作不便、着色等问题[8]。iRoot BP plus相较MTA具备更好的生物相容性和促进牙本质形成钙化桥的能力[8，9]，且无着色问题。
本实验拟探讨iRoot BP Plus相较MTA对hDPSC的增殖及促成骨能力的影响，以期为临床决策作一定的参考。
1 材料与方法
1.1 实验材料 PROROOT MTA （Dentsply，美国），iRoot BP Plus （Innovative Bioceramic Inc. 加拿大）;CCK-8试剂盒（BestBio，中国），碱性磷酸酶测试盒（南京建成生物）
1.1 DPSCs的分离、提纯和鉴定 选取在浙江大学附属口腔医院12～24岁的患者，因正畸或阻生拔除的完整恒牙（无牙周及牙体疾病）。拔除前后牙齿表面充分消毒，置入4℃含青霉素及链霉素的磷酸盐缓冲液（phosphate-buffered saline，PBS）中转运至实验室进行取样（所有操作均经患者及其监护人同意）。分离牙冠后用改良组织块酶消化法[10]行原代培养，培养至P3代备用，并进行成脂成骨诱导能力的鉴定。
1.2 材料浸取液的制备 MTA及iRoot BP Plus调拌后37℃硬化48h后取出，5ml 含10%FBS的α-MEM培养液浸取培养48h后过滤，制备成不稀释、1：5、1：10、1：100及1：1000比例稀释的条件浸取液备用。
1.3 CCK-8测定不同浓度MTA及iRoot BP Plus对hDPSCs细胞增殖活性的影响 取生长良好的P3代hDPSCs，充分消化计数后以每孔50个细胞接种，培养24h后换成上述不同稀释比例的MTA及iRoot BP的浸取培养液。10%FBS的α-MEM培养液作阴性对照，隔天换液。分别在培养1d、3d、7d时用酶标仪于450nm处测量吸光值。
1.4 不同浓度MTA及iRoot BP Plus对hDPSCs碱性磷酸酶表达量的影响 取生长良好的P3代hDPSCs，充分消化计数后以105 /ml接种，培养24h后更换不同浓度的MTA及iRoot BP培养基。10% α-MEM培养液作对照，隔天换液。分别在培养3d、7d时酶标仪于520nm处测量吸光值，562nm处测定蛋白含量，校准AKP测定值误差。
1.5 数据统计与分析 所测数据用SPSS 24.0（IBM） 进行统计分析。结果用±s表示，计数资料使用单因素方差分析和t检验。使用Graphpad Prism 5 绘制统计图。p <0.05视为具有统计学意义。
2 结果
2.1 不同浓度MTA及iRoot BP Plus对hDPSCs细胞增殖活性的影响
不同浓度的MTA及iRoot BP Plus条件浸取液培养hDPSCs，随着培养时间的增加，细胞数量显著增高（p <0.05）。未经稀释的MTA浸取液（比例为1）在培养7天后对细胞活性存在明显的抑制作用（p <0.05）（图1.1A）。不同培养时间，iRoot BP Plus對细胞增殖活性的影响存在一浓度依赖的正态分布曲线，且当比例为0.1～0.2时对hDPSCs的促进作用最强（图1.1B）。 在相同培养时间下，iRoot BP Plus比相同比例的MTA更能促进hDPSCs的增殖，且长时间培养时，在高浓度区段（稀释比例为0.1/0.2/1）未产生细胞抑制（p<0.05）（图1.2）
2.2 不同浓度MTA及iRoot BP Plus对hDPSCs碱性磷酸酶表达量的影响 不同浓度的MTA及iRoot BP Plus条件浸取液处理hDPSCs，随着培养时间的增长，AKP表达量显著升高（p<0.05）（图2.1）。
培养3天后，稀释比例为0.001的MTA组AKP表达量高于对照组，其余组低于对照组（p<0.05），且随着浓度的增加，表达量越低;iRoot BP Plus组不同浓度浸取液对hDPSCs的AKP表達量影响较对照组无统计学差异（图2.2A）。培养7天后，MTA组稀释比例为0.001及1时， AKP表达量显著低于对照组（p <0.05），其余组较对照组无差异（图2.2B）;iRoot BP Plus组的AKP表达量较对照组显著下降（p<0.05）且在高浓度区段（0.1/0.2/1），随着浓度的增加，AKP表达量越少。但比例为0.01的处理组， hDPSCs的AKP表达随时间增加（p<0.05）。
相同稀释比例的浸取液培养hDPSCs，培养3天时，iRoot BP Plus组AKP表达量普遍高于MTA组，但稀释比例为0.001时，表达量低于MTA组（p<0.05）（图2.2A）。培养7天后，低浓度（0.001/0.01）的iRoot BP Plus组AKP表达量普遍高于MTA组，仅0.01组具有统计学差异;高浓度（0.1/0.2/1），表达量较低（图2.2B）。
3 讨论
本实验中，相同稀释比例的iRoot BP Plus比MTA更能促进细胞增殖，且高浓度时未出现细胞抑制。该结果表明iRoot BP Plus不会抑制细胞生长或增殖，且其生物相容性优于MTA。类似研究[12]将hDPSCs分别接种于MTA、iRoot BP Plus上，MTA存在明显的细胞毒性，而iRoot BP Plus在培养早期显著增加细胞活性，但随着培养时间增长，其细胞增殖活性下降。Zhang[13]等比较了MTA和iRoot BP Plus的体内外生物学活性，发现iRoot BP Plus相较MTA能组装更多羟基磷灰石，且可浓度依赖性促进牙髓干细胞的黏附及迁移，牙本质桥形成及牙源性蛋白（DSP/DMP1）及黏附相关分子（Vincullin/p-Paxillin）的表达。而Samyuktha[14]等的研究却发现iRoot BP 处理人成骨细胞及牙周膜细胞后，细胞毒性高于MTA。 MTA内含三氧化二铋，对细胞毒性影响较大[15]。其机制在于铋类化合物可直接作用DNA，下调Bcl-2等蛋白表达，诱导细胞凋亡[16]。iRoot BP Plus用氧化钽及氧化锆代替三氧化二铋，因此无细胞毒性。
AKP参与硬组织的矿化和形成，是检测细胞成骨分化的早期指标之一[17]。本实验中，低浓度（稀释比例为0.001～0.1）的MTA及iRoot BP Plus均能促进hDPSCs的AKP表达，表明iRoot BP Plus和MTA均有一定的促矿化作用。有研究表明[18，19]，MTA可通过NF-κB、ERK/p38通路诱导根尖牙乳头干细胞成牙及成骨分化。培养7天后，MTA及iRoot BP Plus中多组浓度的AKP表达量出现明显下降。这可能与细胞数量增多有关。镜下观察到细胞呈堆叠状生长，无法有效接触培养液，因此影响了生长代谢。加上高浓度MTA的细胞毒性作用，细胞数量明显下降，AKP代谢减少。高浓度MTA组的AKP表达量高于iRoot BP Plus组可能因为高浓度iRoot BP Plus虽会促进细胞增殖，但也会抑制胞内AKP代谢，这与一些研究结果类似。Dedeus G[20]等研究推测iRoot BP对细胞代谢水平的影响高于其对细胞密度层面的影响。Modareszadeh M R[21]等发现在不同培养时间下，iRoot BP Plus显著降低细胞AKP水平。
材料块及条件浸取液的制备过程可能是导致不同研究实验结果存在偏差的原因。Hakki[22]利用MTA的上清液研究其对成牙骨质细胞的作用，这一方法使得材料的浓度得以量化。而iRoot BP Plus作为预调膏剂可直接使用，两者虽浸取比例相同，但其真实浓度无法完全一致。在湿润环境下，iRoot BP Plus其内的硅酸钙可以水解生成硅酸钙水合物凝胶及氢氧化钙，后者与磷酸盐反应生成羟基磷灰石和水，水又可继续参与反应[23]。相较于根管内环境，本实验的iRoot BP Plus材料块固化过程中只有一底面接触湿润环境，其余面湿化不足，材料块内、外表面的固化程度存在差异[24]，造成浸取液浓度误差。另外iRoot BP Plus材料块在48h后体积膨胀明显，增加了其浸取表面积/浸取液体积比值，使浸取液浓度增高。Walsh RM[25]等研究结果证实了iRoot BP固化过程中的体积膨胀。而MTA固化后因水分蒸发，会出现一定的体积收缩，浸取表面积减小，使浸取浓度偏低。
4 结论
MTA对hDPSCs的促矿化能力较强，但高浓度下存在一定的细胞毒性作用。iRoot BP Plus相较MTA具有更好的生物相容性，不会抑制hDPSCs增殖分化。但两者均对细胞的AKP表达量具有一定的抑制作用，且随着培养时间的增加，高浓度时iRoot BP Plus的抑制作用更为显著。
参考文献
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浙江省医药卫生科技项目（基金号：2016KYA118）
【关键词】牙髓干细胞;MTA;iRoot BP Plus;碱性磷酸酶;细胞活性
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牙髓干细胞（Dental Pulp Stem Cells，DPSCs）是位于牙髓内的成体干细胞，由神经嵴发育而来[1，2]。DPSCs广泛存在于成熟及年轻恒牙根尖底部，可以定植在根管壁上，进而分化为成骨细胞，能形成牙本质- 牙髓样结构，在牙髓再生术中发挥着重要作用[3，4]。
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本实验拟探讨iRoot BP Plus相较MTA对hDPSC的增殖及促成骨能力的影响，以期为临床决策作一定的参考。
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1.2 材料浸取液的制备 MTA及iRoot BP Plus调拌后37℃硬化48h后取出，5ml 含10%FBS的α-MEM培养液浸取培养48h后过滤，制备成不稀释、1：5、1：10、1：100及1：1000比例稀释的条件浸取液备用。
1.3 CCK-8测定不同浓度MTA及iRoot BP Plus对hDPSCs细胞增殖活性的影响 取生长良好的P3代hDPSCs，充分消化计数后以每孔50个细胞接种，培养24h后换成上述不同稀释比例的MTA及iRoot BP的浸取培养液。10%FBS的α-MEM培养液作阴性对照，隔天换液。分别在培养1d、3d、7d时用酶标仪于450nm处测量吸光值。
1.4 不同浓度MTA及iRoot BP Plus对hDPSCs碱性磷酸酶表达量的影响 取生长良好的P3代hDPSCs，充分消化计数后以105 /ml接种，培养24h后更换不同浓度的MTA及iRoot BP培养基。10% α-MEM培养液作对照，隔天换液。分别在培养3d、7d时酶标仪于520nm处测量吸光值，562nm处测定蛋白含量，校准AKP测定值误差。
1.5 数据统计与分析 所测数据用SPSS 24.0（IBM） 进行统计分析。结果用±s表示，计数资料使用单因素方差分析和t检验。使用Graphpad Prism 5 绘制统计图。p <0.05视为具有统计学意义。
2 结果
2.1 不同浓度MTA及iRoot BP Plus对hDPSCs细胞增殖活性的影响
不同浓度的MTA及iRoot BP Plus条件浸取液培养hDPSCs，随着培养时间的增加，细胞数量显著增高（p <0.05）。未经稀释的MTA浸取液（比例为1）在培养7天后对细胞活性存在明显的抑制作用（p <0.05）（图1.1A）。不同培养时间，iRoot BP Plus對细胞增殖活性的影响存在一浓度依赖的正态分布曲线，且当比例为0.1～0.2时对hDPSCs的促进作用最强（图1.1B）。 在相同培养时间下，iRoot BP Plus比相同比例的MTA更能促进hDPSCs的增殖，且长时间培养时，在高浓度区段（稀释比例为0.1/0.2/1）未产生细胞抑制（p<0.05）（图1.2）
2.2 不同浓度MTA及iRoot BP Plus对hDPSCs碱性磷酸酶表达量的影响 不同浓度的MTA及iRoot BP Plus条件浸取液处理hDPSCs，随着培养时间的增长，AKP表达量显著升高（p<0.05）（图2.1）。
培养3天后，稀释比例为0.001的MTA组AKP表达量高于对照组，其余组低于对照组（p<0.05），且随着浓度的增加，表达量越低;iRoot BP Plus组不同浓度浸取液对hDPSCs的AKP表達量影响较对照组无统计学差异（图2.2A）。培养7天后，MTA组稀释比例为0.001及1时， AKP表达量显著低于对照组（p <0.05），其余组较对照组无差异（图2.2B）;iRoot BP Plus组的AKP表达量较对照组显著下降（p<0.05）且在高浓度区段（0.1/0.2/1），随着浓度的增加，AKP表达量越少。但比例为0.01的处理组， hDPSCs的AKP表达随时间增加（p<0.05）。
相同稀释比例的浸取液培养hDPSCs，培养3天时，iRoot BP Plus组AKP表达量普遍高于MTA组，但稀释比例为0.001时，表达量低于MTA组（p<0.05）（图2.2A）。培养7天后，低浓度（0.001/0.01）的iRoot BP Plus组AKP表达量普遍高于MTA组，仅0.01组具有统计学差异;高浓度（0.1/0.2/1），表达量较低（图2.2B）。
3 讨论
本实验中，相同稀释比例的iRoot BP Plus比MTA更能促进细胞增殖，且高浓度时未出现细胞抑制。该结果表明iRoot BP Plus不会抑制细胞生长或增殖，且其生物相容性优于MTA。类似研究[12]将hDPSCs分别接种于MTA、iRoot BP Plus上，MTA存在明显的细胞毒性，而iRoot BP Plus在培养早期显著增加细胞活性，但随着培养时间增长，其细胞增殖活性下降。Zhang[13]等比较了MTA和iRoot BP Plus的体内外生物学活性，发现iRoot BP Plus相较MTA能组装更多羟基磷灰石，且可浓度依赖性促进牙髓干细胞的黏附及迁移，牙本质桥形成及牙源性蛋白（DSP/DMP1）及黏附相关分子（Vincullin/p-Paxillin）的表达。而Samyuktha[14]等的研究却发现iRoot BP 处理人成骨细胞及牙周膜细胞后，细胞毒性高于MTA。 MTA内含三氧化二铋，对细胞毒性影响较大[15]。其机制在于铋类化合物可直接作用DNA，下调Bcl-2等蛋白表达，诱导细胞凋亡[16]。iRoot BP Plus用氧化钽及氧化锆代替三氧化二铋，因此无细胞毒性。
AKP参与硬组织的矿化和形成，是检测细胞成骨分化的早期指标之一[17]。本实验中，低浓度（稀释比例为0.001～0.1）的MTA及iRoot BP Plus均能促进hDPSCs的AKP表达，表明iRoot BP Plus和MTA均有一定的促矿化作用。有研究表明[18，19]，MTA可通过NF-κB、ERK/p38通路诱导根尖牙乳头干细胞成牙及成骨分化。培养7天后，MTA及iRoot BP Plus中多组浓度的AKP表达量出现明显下降。这可能与细胞数量增多有关。镜下观察到细胞呈堆叠状生长，无法有效接触培养液，因此影响了生长代谢。加上高浓度MTA的细胞毒性作用，细胞数量明显下降，AKP代谢减少。高浓度MTA组的AKP表达量高于iRoot BP Plus组可能因为高浓度iRoot BP Plus虽会促进细胞增殖，但也会抑制胞内AKP代谢，这与一些研究结果类似。Dedeus G[20]等研究推测iRoot BP对细胞代谢水平的影响高于其对细胞密度层面的影响。Modareszadeh M R[21]等发现在不同培养时间下，iRoot BP Plus显著降低细胞AKP水平。
材料块及条件浸取液的制备过程可能是导致不同研究实验结果存在偏差的原因。Hakki[22]利用MTA的上清液研究其对成牙骨质细胞的作用，这一方法使得材料的浓度得以量化。而iRoot BP Plus作为预调膏剂可直接使用，两者虽浸取比例相同，但其真实浓度无法完全一致。在湿润环境下，iRoot BP Plus其内的硅酸钙可以水解生成硅酸钙水合物凝胶及氢氧化钙，后者与磷酸盐反应生成羟基磷灰石和水，水又可继续参与反应[23]。相较于根管内环境，本实验的iRoot BP Plus材料块固化过程中只有一底面接触湿润环境，其余面湿化不足，材料块内、外表面的固化程度存在差异[24]，造成浸取液浓度误差。另外iRoot BP Plus材料块在48h后体积膨胀明显，增加了其浸取表面积/浸取液体积比值，使浸取液浓度增高。Walsh RM[25]等研究结果证实了iRoot BP固化过程中的体积膨胀。而MTA固化后因水分蒸发，会出现一定的体积收缩，浸取表面积减小，使浸取浓度偏低。
4 结论
MTA对hDPSCs的促矿化能力较强，但高浓度下存在一定的细胞毒性作用。iRoot BP Plus相较MTA具有更好的生物相容性，不会抑制hDPSCs增殖分化。但两者均对细胞的AKP表达量具有一定的抑制作用，且随着培养时间的增加，高浓度时iRoot BP Plus的抑制作用更为显著。
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浙江省医药卫生科技项目（基金号：2016KYA118）