论文部分内容阅读
摘要：以艾纳香为原料、艾纳香总黄酮得率为指标，采用超声辅助乙醇-硫酸铵双水相体系对艾纳香总黄酮提取工艺进行单因素及Box-Behnken响应曲面试验优化，并用羟自由基清除力、DPPH自由基清除力以及还原力与一般回流提取所得的总黄酮的抗氧化能力进行比较研究。结果表明，艾纳香总黄酮超声辅助双水相提取的最佳工艺条件为超声时间31 min、（NH4）2SO4用量0.4 g/mL、液料比为32 mL ∶1 g，此条件下提取的艾纳香总黄酮得率为（13.31±021）%。对DPPH自由基、羟自由基有较强的清除能力以及较高的还原力，且超声辅助双水相提取的艾纳香总黄酮抗氧化能力显著高于一般回流提取。
关键词：艾纳香总黄酮；超声提取；双水相；Box-Behnken响应曲面试验；抗氧化
中图分类号： R284.2文献标志码： A
文章编号：1002-1302（2017）15-0153-04
艾纳香，别称大风叶、大风艾等，为菊科艾纳香属植物艾纳香[Blumea balsamifera （L.） DC]新鲜或干燥地上部分，在我国主要分布于广西、贵州等长江以南地区。其性味辛温，具有温中活血、祛风除湿、杀菌止痒、消炎镇痛等功效。现代临床主要应用于抗菌、杀虫、保肝及降血压、扩张血管、抑制交感神经等[1-2]。主要含有黄酮类、挥发油等成分，其中艾纳香黄酮类成分有抗肿瘤活性、抗氧化活性、抗酪氨酸激酶活性，开发潜力大，市场前景广阔[3]。近年来“绿色化学”“环境友好型”提取工艺备受青睐[4]。超声辅助提取是利用超声波技术强化提取分离过程，能有效地缩短提取时间，提高产品的得率，还可以减少化学与物理危害，提高产品质量[5]。双水相提取是基于乙醇、异丙醇等有机物与无机盐形成的新型双水相体系与传统的双水相体系，根据被分离物质在不同相中分配系数的不同从而实现分离的方法[6-7]。目前醇-盐双水相体系已经被广泛用于提取分离天然小分子化合物，成本低，萃取相不含黏度大、难处理的聚合物，有利于醇类的回收和具有良好的分离性能[8-9]。因此本研究以艾纳香总黄酮提取率为指标，通过单因素及Box-Behnken响应曲面试验进行优化超声辅助双水相提取工艺条件，并用羟自由基清除力、DPPH自由基清除力以及还原力对抗氧化能力进行研究，以期为艾纳香黄酮的药用和食用研究提供一定的参考。
1材料与方法
1.1材料与试剂
1.1.1材料艾纳香叶采自贵州省罗甸艾纳香种植基地。
1.1.2试剂无水乙醇、（NH4）2SO4、铁氰化钾、无水Na2CO3等试剂均为分析纯（国药集团化学试剂有限公司），芸香苷标准品（含量≥98%，西安汇林生物科技有限公司）。
1.1.3仪器数控超声清洗器（KQ5200DE，昆山市超声仪器有限公司）；电子天平（FA1004B，上海越平科学仪器有限公司）；旋转蒸发器（上海上天精密仪器有限公司）；紫外-可见分光光度计（UV-2550型，梅特勒-托利多国际股份有限公司）。
1.3试验方法
1.3.1双水相体系的确定及超声辅助双水相提取艾纳香总黄酮的工艺
准确称取一定量艾纳香叶，经40 ℃干燥后粉碎装入三角烧瓶中。加入适量的乙醇-硫酸铵溶液，按试验要求在超声辅助条件下提取艾纳香总黄酮。浸提后以 3 000 r/min 冷冻高速离心20 min。取上清液于40 ℃下真空旋轉蒸发回收溶剂，所得浓缩液真空冷冻干燥，得艾纳香总黄酮提取物。据前期预试验可知，当乙醇体积分数为40%时，（NH4）2SO4用量在0.2～0.6 g /mL 能形成较稳定的双水相体系。因此本试验固定乙醇体积分数为40%进行其他工艺参数的考察。
1.3.2标准曲线的绘制
精确称取芸香苷标准品，40%乙醇配制得135.0 mg/L的芸香苷储备液。精确吸取0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL芸香苷储备液，依次加入40%乙醇4.0 mL、5%亚硝酸钠溶液0.5 mL、10%硝酸铝溶液0.5 mL，摇匀，静置 5 min，最后加入4%氢氧化钠溶液3 mL，乙醇定容至 10 mL。充分摇匀，静置15 min后，509 nm下测定吸光度。得吸光度Y与浓度X（mg/L）的标准回归方程Y=0.101 2X-0000 5，r2=0.999 2。
1.3.3单因素考察超声提取工艺
本试验针对超声时间（10、20、30、40、50 min）、（NH4）2SO4用量（0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 g/mL）液料比[20 ∶1、25 ∶1、30 ∶1、35 ∶1、40 ∶1（mL ∶g）]3个因素，保持其中2个变量固定不变，对另一个变量进行单因素试验，以艾纳香总黄酮提取率为指标[10-11]，以确定Box-Behnken响应曲面设计所需的水平范围。
1.3.4Box-Behnken响应曲面法优选艾纳香总黄酮提取工艺
在单因素试验的基础上，选取微波功率、提取时间、液料比3个对艾纳香总黄酮提取率影响较大的因素，采用 Design-Expert 8.0.6 提供的Box-Behnken试验，以艾纳香总黄酮提取率为指标优化提取工艺参数，试验设计如表1、表2所示。
1.3.5DPPH 自由基清除能力测定
以无水乙醇为溶剂，将总黄酮配制成0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/mL 的溶液备用。精确吸取上述不同浓度的溶液300 μL，与2 mL 0.004% DPPH溶液充分混合后室温下静置20 min，在517 nm处测其吸光度（D1）。以不加提取液的DPPH 为空白对照，测定溶液在517 nm处的吸光度（D0）。精确吸取上述不同质量浓度总黄酮溶液300 μL，分别与2 mL无水乙醇混合均匀后，以无水乙醇为对照，测定各溶液在517 nm处的吸光度（D2）[12]。同法对回流提取得到的总黄酮的DPPH自由基清除能力进行测定。计算公式为： [JZ]DPPH自由基清除率=（1-[SX（]D1-D2D0[SX）]）×100%。
1.3.6铁氰化钾还原法测定还原力
配制不同浓度的总黄酮样品溶液，取1.5 mL样品，加入 1.5 mL、pH值6.6的磷酸盐缓冲液和1.5 mL六氰合铁酸钾溶液，混匀后于50 ℃恒温20 min，快速冷却后加入1 mL 10% 三氯乙酸溶液，于 3 000 r/min 下离心10 min，取上清液1 mL再加入1 mL蒸馏水和1 mL 0.1% 三氯化铁溶液，充分混匀静置后，于 700 nm 处测定吸光度，以吸光度表示还原能力[13]。同法对回流提取得到的总黄酮还原力进行测定。
1.3.7羟自由基清除率
配制不同浓度的总黄酮样品溶液，取1.5 mL样品，分别加入1.0 mL 2.5 mmol/L的水杨酸溶液、1.0 mL 5 mmol/L的FeSO4溶液和2.0 mL蒸馏水，充分混匀，加入1.0 mL 5 mmol/L的H2O2，置于37 ℃恒温水浴锅中反应30 min，再置于510 nm处测定其吸光度，以蒸馏水作空白参比[14]。同法对回流提取得到的总黄酮羟自由基清除率进行测定。
[JZ]羟自由基清除率=[JB（[][SX（]D0-（D2-D1）D0[SX）][JB）]]×100%。
式中：D0为空白对照吸光度；D2为加H2O2样品溶液吸光度；D1为不加H2O2样品溶液吸光度。
2结果与分析
2.1单因素考察艾纳香总黄酮超声辅助提取工艺
2.1.1超声时间对艾纳香总黄酮提取率的影响
由图1-a可知，随着超声时间的增加，艾纳香总黄酮提取率呈现先上升后下降再保持稳定状态的趋势。当超声时间为30 min时，艾纳香总黄酮提取率为12.98%，继续延长超声时间，总黄酮提取率维持在12.40%左右波动。这主要是由于超声波破坏了某些黄酮类成分的结构而有所损失，造成提取率下降。因此选定20～30 min为超声时间所需的水平范围。
2.1.2（NH4）2SO4用量对艾纳香总黄酮提取率的影响
由图1-b可知，随着（NH4）2SO4用量的增加，艾纳香总黄酮提取率先上升后稳定在一定水平。当（NH4）2SO4用量大于 0.4 g/mL 时，提取率稳定在12.78%左右波动，当继续增加（NH4）2SO4[CM（20*2/3]用量时总黄酮提取率并没有显著增加。这主要
是由于（NH4）2SO4用量增加会与乙醇争夺体系中的水，使总黄酮在乙醇相的含量减少，导致提取率下降。因此选定 0.3～0.5 g/mL为响应面设计（NH4）2SO4用量的水平范围。
2.1.3液料比对艾纳香总黄酮提取率的影响
由图1-c可知，随着液料比的增加，艾纳香总黄酮提取率先上升后稳定在一定水平，没有显著性增加。当液料比超过35 mL ∶1 g时，总黄酮提取率稳定在12.89%左右波动。主要是因为提取液的增加可使艾纳香叶与提取溶剂充分接触，有利于总黄酮的浸出，当液料比超过35 mL ∶1 g时，总黄酮的提取基本达到饱和状态。因此选定（25～35） mL ∶1 g为响应面设计的水平。
2.2Box-Behnken响应曲面设计优化艾纳香总黄酮微波辅助提取工艺
采用Design-Expert 8.0.6 提供的Box-Behnken試验，对各因素进行拟合，得到多元回归方程为：
R提取率=2.841 0 0.349 4A 21.267 5B 0.030 2C-0122 5AB 2.750 0×10-3AC-0.090 0BC-6.260 0×10-3A2-18.350 0B2-9.400 0×10-4C2。
对艾纳香总黄酮提取率的回归模型进行方差及显著性分析，结果见表3。该模型方程有显著性影响（P<0.000 1），失拟项不显著（P=0.202 1>0.05），说明在本试验条件下，该回归模型所考察的因素足以反映试验中各提取工艺参数对总黄酮提取率的影响。判定系数R2=0.986 8，R2adj=0.969 9，说明回归模型与试验值拟合均较好，可用于艾纳香总黄酮提取率的理论推测和分析，各因素影响大小依次为液料比>超声时间>（NH4）2SO4用量。由F检验可知，一次项中液料比对总黄酮的提取率具有极显著影响（P<0.01），超声时间对总黄酮的提取率具有显著影响（P<0.05）；交互项中超声时间与（NH4）2SO4用量、超声时间与料液比之间的交互作用对总黄酮提取率具有极显著影响（P<0.01）；在二次项中超声时间、（NH4）2SO4用量对总黄酮提取率具有极显著影响（P<001）；其他因素之间不显著（P>0.05），这与图2中3D效应面图反映出的各因素间的交互作用相吻合。
由Design-Expert 8.0.6软件得出艾纳香总黄酮提取的最佳工艺参数是超声时间30.92 min、（NH4）2SO4用量 0.4 g/mL、液料比为32.25 mL ∶1 g，总黄酮提取率的预测值为13.29%。为便于生产试验需求，定为超声时间31 min、
（NH4）2SO4用量0.4 g/mL、液料比为32 mL ∶1 g，进一步验证试验，得出的总黄酮提取率为（13.31±0.21）%。该值与预测值比较接近，因此选取此为超声辅助双水相体系提取艾纳香总黄酮的工艺参数。
2.3不同提取工艺提取的艾纳香总黄酮抗氧化活性
2.3.1DPPH自由基清除能力测定结果
由图3可知，回流提取与超声辅助双水相提取得到的艾纳香总黄酮对DPPH自由基均有较强的清除能力。浓度与DPPH自由基清除率存在正相关关系，且超声辅助双水相提取的清除能力显著高于一般回流提取（P<0.05）。当浓度为0.5 mg/mL时，超声辅助双水相提取法提取的艾纳香总黄酮对DPPH自由基清除率为78.8%，而回流提取的为73.9%。 2.3.2还原力测定结果
吸光度与样品的还原力具有正相关关系，吸光度越大，样品的还原力越强。由图4可知，回流提取与超声辅助双水相得到的艾纳香总黄酮均具有较强的还原能力，说明不同提取法也均具有较强的抗氧化能力。在测定的质量浓度范围内，艾纳香总黄酮的还原力随着浓度的升高而增强，且超声辅助双水相提取的艾纳香总黄酮还原力显著高于一般回流提取（P<0.05）。当浓度为0.5 mg/mL时，超声辅助双水相提取的吸光度D700 nm为1.35 。
2.3.3羟自由基清除率
由图5可知，回流提取与超声辅助双水相提取得到的艾纳香总黄酮对羟自由基均有较强的清除能力。随着总黄酮浓度的增加清除率也随之提高，且超声辅助双水相提取的清除能力显著高于一般回流提取（P<005）。当浓度为0.5 mg/mL时，超声辅助提取法的清除率为75.9%，而回流提取为69.1%。
3结论
超声波提取时间短、温度低、效率高，是高效、节能、环保式的提取方式[15-16]，结合乙醇-硫酸铵双水相体系操作，具有条件温和、处理量大、易于连续操作等优点，广泛应用于中药材提取、生物工程、药物分析和金属分离等方面。本研究以艾纳香为主要原料采用Box-Behnken响應曲面设计对其总黄酮超声辅助双水相提取工艺条件进行优化，并比较该法与传统回流提取所得的总黄酮进行抗氧化能力比较。结果表明，超声辅助双水相提取艾纳香总黄酮的最佳工艺条件为超声时间31 min、（NH4）2SO4的用量0.4 g/mL、液料比为 32 mL ∶1 g，此条件下提取的艾纳香总黄酮得率为（13.31±0.21）%。且对DPPH自由基、羟自由有较强的清除能力以及较高的还原力，且超声辅助双水相提取的艾纳香总黄酮抗氧化能力显著高于一般回流提取。
参考文献：
[1]师琴丽，覃军章，王用平，等. 贵州优势苗族药物艾纳香及其产品[J]. 中药材，2003，26（增刊1）：87-88.
[2]袁媛，庞玉新，王文全，等. 中国艾纳香属植物资源调查[J]. 热带生物学报，2011，2（1）：78-82.
[3]韦睿斌，庞玉新，杨全，等. 艾纳香黄酮类化学成分研究进展[J]. 广东药学院学报，2014，30（1）：123-127.
[4]Tabaraki R，Nateghi A. Optimization of ultrasonic-assisted extraction of natural antioxidants from rice bran using response surface methodology[J]. Ultrasonics Sonochemistry，2011，18（6）：1279-1286.
[5]Chemat F，Zill-e-Huma Z，Khan M K. Applications of ultrasound in food technology：processing，preservation and extraction[J]. Ultrasonics Sonochemistry，2011，18（4）：813-835.
[6]Zhi W B，Deng Q Y. Purification of salvianolic acid B from the crude extract of Salvia miltiorrhiza with hydrophilic organic/salt-containing aqueous twophase system by counter-current chromatography[J]. Journal of Chromatography，2006，16（11）：149-152.
[7]Shen S F，Chang Z D，Liu J，et al. Separation of glycyrrhizic acid and liquiritin from Glycyrrhiza uralensis Fisch extract by three-liquid phase extraction systems[J]. Separation and Purification Technology，2007，53（3）：216-223.[HJ1.75mm]
[8]王志华，马会民，马泉莉，等. 双水相萃取体系的研究[J]. 应用化学，2001，18（3）：173-175.
[9]林金清，董军芳，李夏兰. 乙醇/硫酸铵双水相体系萃取甘草酸钾的研究[J]. 精细化工，2004，21（3）：165-173.
[10]张艳霞，朱彩平，邓红，等. 超声辅助双水相提取石榴皮多酚[J]. 食品与发酵工业，2016，42（12）：150-156.
[11]徐春明，李婷，王英英，等. 微波辅助双水相提取苦荞麦粉中黄酮类化合物[J]. 食品科学技术学报，2014，32（6）：36-41.
[12]Kim D，Lee K W，Lee H J，et al. Vitamin C equivalent antioxidant capacity（VCEAC）of phenolic phytoche-micals[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry，2002，50（13）：3713-3717.
[13]陈美珍，余杰，郭慧敏，等. 大豆分离蛋白酶解物清除羟自由基作用的研究[J]. 食品科学，2002，23（1）：43-47.
[14]刘水英，李新生，党娅，等. 响应面法优化紫山药花青苷提取工艺及其抗氧化活性[J]. 食品科学，2014，35（22）：84-91.
[15]蓝峻峰，张春艳. 超声波辅助热提艾蒿黄酮工艺优化[J]. 江苏农业科学，2015，43（8）：267-269.
[16]刘彬，楚冬海. 超声波提取明日叶总黄酮的工艺研究[J]. 江苏农业科学，2016，44（2）：338-339.
关键词：艾纳香总黄酮；超声提取；双水相；Box-Behnken响应曲面试验；抗氧化
中图分类号： R284.2文献标志码： A
文章编号：1002-1302（2017）15-0153-04
艾纳香，别称大风叶、大风艾等，为菊科艾纳香属植物艾纳香[Blumea balsamifera （L.） DC]新鲜或干燥地上部分，在我国主要分布于广西、贵州等长江以南地区。其性味辛温，具有温中活血、祛风除湿、杀菌止痒、消炎镇痛等功效。现代临床主要应用于抗菌、杀虫、保肝及降血压、扩张血管、抑制交感神经等[1-2]。主要含有黄酮类、挥发油等成分，其中艾纳香黄酮类成分有抗肿瘤活性、抗氧化活性、抗酪氨酸激酶活性，开发潜力大，市场前景广阔[3]。近年来“绿色化学”“环境友好型”提取工艺备受青睐[4]。超声辅助提取是利用超声波技术强化提取分离过程，能有效地缩短提取时间，提高产品的得率，还可以减少化学与物理危害，提高产品质量[5]。双水相提取是基于乙醇、异丙醇等有机物与无机盐形成的新型双水相体系与传统的双水相体系，根据被分离物质在不同相中分配系数的不同从而实现分离的方法[6-7]。目前醇-盐双水相体系已经被广泛用于提取分离天然小分子化合物，成本低，萃取相不含黏度大、难处理的聚合物，有利于醇类的回收和具有良好的分离性能[8-9]。因此本研究以艾纳香总黄酮提取率为指标，通过单因素及Box-Behnken响应曲面试验进行优化超声辅助双水相提取工艺条件，并用羟自由基清除力、DPPH自由基清除力以及还原力对抗氧化能力进行研究，以期为艾纳香黄酮的药用和食用研究提供一定的参考。
1材料与方法
1.1材料与试剂
1.1.1材料艾纳香叶采自贵州省罗甸艾纳香种植基地。
1.1.2试剂无水乙醇、（NH4）2SO4、铁氰化钾、无水Na2CO3等试剂均为分析纯（国药集团化学试剂有限公司），芸香苷标准品（含量≥98%，西安汇林生物科技有限公司）。
1.1.3仪器数控超声清洗器（KQ5200DE，昆山市超声仪器有限公司）；电子天平（FA1004B，上海越平科学仪器有限公司）；旋转蒸发器（上海上天精密仪器有限公司）；紫外-可见分光光度计（UV-2550型，梅特勒-托利多国际股份有限公司）。
1.3试验方法
1.3.1双水相体系的确定及超声辅助双水相提取艾纳香总黄酮的工艺
准确称取一定量艾纳香叶，经40 ℃干燥后粉碎装入三角烧瓶中。加入适量的乙醇-硫酸铵溶液，按试验要求在超声辅助条件下提取艾纳香总黄酮。浸提后以 3 000 r/min 冷冻高速离心20 min。取上清液于40 ℃下真空旋轉蒸发回收溶剂，所得浓缩液真空冷冻干燥，得艾纳香总黄酮提取物。据前期预试验可知，当乙醇体积分数为40%时，（NH4）2SO4用量在0.2～0.6 g /mL 能形成较稳定的双水相体系。因此本试验固定乙醇体积分数为40%进行其他工艺参数的考察。
1.3.2标准曲线的绘制
精确称取芸香苷标准品，40%乙醇配制得135.0 mg/L的芸香苷储备液。精确吸取0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL芸香苷储备液，依次加入40%乙醇4.0 mL、5%亚硝酸钠溶液0.5 mL、10%硝酸铝溶液0.5 mL，摇匀，静置 5 min，最后加入4%氢氧化钠溶液3 mL，乙醇定容至 10 mL。充分摇匀，静置15 min后，509 nm下测定吸光度。得吸光度Y与浓度X（mg/L）的标准回归方程Y=0.101 2X-0000 5，r2=0.999 2。
1.3.3单因素考察超声提取工艺
本试验针对超声时间（10、20、30、40、50 min）、（NH4）2SO4用量（0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 g/mL）液料比[20 ∶1、25 ∶1、30 ∶1、35 ∶1、40 ∶1（mL ∶g）]3个因素，保持其中2个变量固定不变，对另一个变量进行单因素试验，以艾纳香总黄酮提取率为指标[10-11]，以确定Box-Behnken响应曲面设计所需的水平范围。
1.3.4Box-Behnken响应曲面法优选艾纳香总黄酮提取工艺
在单因素试验的基础上，选取微波功率、提取时间、液料比3个对艾纳香总黄酮提取率影响较大的因素，采用 Design-Expert 8.0.6 提供的Box-Behnken试验，以艾纳香总黄酮提取率为指标优化提取工艺参数，试验设计如表1、表2所示。
1.3.5DPPH 自由基清除能力测定
以无水乙醇为溶剂，将总黄酮配制成0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/mL 的溶液备用。精确吸取上述不同浓度的溶液300 μL，与2 mL 0.004% DPPH溶液充分混合后室温下静置20 min，在517 nm处测其吸光度（D1）。以不加提取液的DPPH 为空白对照，测定溶液在517 nm处的吸光度（D0）。精确吸取上述不同质量浓度总黄酮溶液300 μL，分别与2 mL无水乙醇混合均匀后，以无水乙醇为对照，测定各溶液在517 nm处的吸光度（D2）[12]。同法对回流提取得到的总黄酮的DPPH自由基清除能力进行测定。计算公式为： [JZ]DPPH自由基清除率=（1-[SX（]D1-D2D0[SX）]）×100%。
1.3.6铁氰化钾还原法测定还原力
配制不同浓度的总黄酮样品溶液，取1.5 mL样品，加入 1.5 mL、pH值6.6的磷酸盐缓冲液和1.5 mL六氰合铁酸钾溶液，混匀后于50 ℃恒温20 min，快速冷却后加入1 mL 10% 三氯乙酸溶液，于 3 000 r/min 下离心10 min，取上清液1 mL再加入1 mL蒸馏水和1 mL 0.1% 三氯化铁溶液，充分混匀静置后，于 700 nm 处测定吸光度，以吸光度表示还原能力[13]。同法对回流提取得到的总黄酮还原力进行测定。
1.3.7羟自由基清除率
配制不同浓度的总黄酮样品溶液，取1.5 mL样品，分别加入1.0 mL 2.5 mmol/L的水杨酸溶液、1.0 mL 5 mmol/L的FeSO4溶液和2.0 mL蒸馏水，充分混匀，加入1.0 mL 5 mmol/L的H2O2，置于37 ℃恒温水浴锅中反应30 min，再置于510 nm处测定其吸光度，以蒸馏水作空白参比[14]。同法对回流提取得到的总黄酮羟自由基清除率进行测定。
[JZ]羟自由基清除率=[JB（[][SX（]D0-（D2-D1）D0[SX）][JB）]]×100%。
式中：D0为空白对照吸光度；D2为加H2O2样品溶液吸光度；D1为不加H2O2样品溶液吸光度。
2结果与分析
2.1单因素考察艾纳香总黄酮超声辅助提取工艺
2.1.1超声时间对艾纳香总黄酮提取率的影响
由图1-a可知，随着超声时间的增加，艾纳香总黄酮提取率呈现先上升后下降再保持稳定状态的趋势。当超声时间为30 min时，艾纳香总黄酮提取率为12.98%，继续延长超声时间，总黄酮提取率维持在12.40%左右波动。这主要是由于超声波破坏了某些黄酮类成分的结构而有所损失，造成提取率下降。因此选定20～30 min为超声时间所需的水平范围。
2.1.2（NH4）2SO4用量对艾纳香总黄酮提取率的影响
由图1-b可知，随着（NH4）2SO4用量的增加，艾纳香总黄酮提取率先上升后稳定在一定水平。当（NH4）2SO4用量大于 0.4 g/mL 时，提取率稳定在12.78%左右波动，当继续增加（NH4）2SO4[CM（20*2/3]用量时总黄酮提取率并没有显著增加。这主要
是由于（NH4）2SO4用量增加会与乙醇争夺体系中的水，使总黄酮在乙醇相的含量减少，导致提取率下降。因此选定 0.3～0.5 g/mL为响应面设计（NH4）2SO4用量的水平范围。
2.1.3液料比对艾纳香总黄酮提取率的影响
由图1-c可知，随着液料比的增加，艾纳香总黄酮提取率先上升后稳定在一定水平，没有显著性增加。当液料比超过35 mL ∶1 g时，总黄酮提取率稳定在12.89%左右波动。主要是因为提取液的增加可使艾纳香叶与提取溶剂充分接触，有利于总黄酮的浸出，当液料比超过35 mL ∶1 g时，总黄酮的提取基本达到饱和状态。因此选定（25～35） mL ∶1 g为响应面设计的水平。
2.2Box-Behnken响应曲面设计优化艾纳香总黄酮微波辅助提取工艺
采用Design-Expert 8.0.6 提供的Box-Behnken試验，对各因素进行拟合，得到多元回归方程为：
R提取率=2.841 0 0.349 4A 21.267 5B 0.030 2C-0122 5AB 2.750 0×10-3AC-0.090 0BC-6.260 0×10-3A2-18.350 0B2-9.400 0×10-4C2。
对艾纳香总黄酮提取率的回归模型进行方差及显著性分析，结果见表3。该模型方程有显著性影响（P<0.000 1），失拟项不显著（P=0.202 1>0.05），说明在本试验条件下，该回归模型所考察的因素足以反映试验中各提取工艺参数对总黄酮提取率的影响。判定系数R2=0.986 8，R2adj=0.969 9，说明回归模型与试验值拟合均较好，可用于艾纳香总黄酮提取率的理论推测和分析，各因素影响大小依次为液料比>超声时间>（NH4）2SO4用量。由F检验可知，一次项中液料比对总黄酮的提取率具有极显著影响（P<0.01），超声时间对总黄酮的提取率具有显著影响（P<0.05）；交互项中超声时间与（NH4）2SO4用量、超声时间与料液比之间的交互作用对总黄酮提取率具有极显著影响（P<0.01）；在二次项中超声时间、（NH4）2SO4用量对总黄酮提取率具有极显著影响（P<001）；其他因素之间不显著（P>0.05），这与图2中3D效应面图反映出的各因素间的交互作用相吻合。
由Design-Expert 8.0.6软件得出艾纳香总黄酮提取的最佳工艺参数是超声时间30.92 min、（NH4）2SO4用量 0.4 g/mL、液料比为32.25 mL ∶1 g，总黄酮提取率的预测值为13.29%。为便于生产试验需求，定为超声时间31 min、
（NH4）2SO4用量0.4 g/mL、液料比为32 mL ∶1 g，进一步验证试验，得出的总黄酮提取率为（13.31±0.21）%。该值与预测值比较接近，因此选取此为超声辅助双水相体系提取艾纳香总黄酮的工艺参数。
2.3不同提取工艺提取的艾纳香总黄酮抗氧化活性
2.3.1DPPH自由基清除能力测定结果
由图3可知，回流提取与超声辅助双水相提取得到的艾纳香总黄酮对DPPH自由基均有较强的清除能力。浓度与DPPH自由基清除率存在正相关关系，且超声辅助双水相提取的清除能力显著高于一般回流提取（P<0.05）。当浓度为0.5 mg/mL时，超声辅助双水相提取法提取的艾纳香总黄酮对DPPH自由基清除率为78.8%，而回流提取的为73.9%。 2.3.2还原力测定结果
吸光度与样品的还原力具有正相关关系，吸光度越大，样品的还原力越强。由图4可知，回流提取与超声辅助双水相得到的艾纳香总黄酮均具有较强的还原能力，说明不同提取法也均具有较强的抗氧化能力。在测定的质量浓度范围内，艾纳香总黄酮的还原力随着浓度的升高而增强，且超声辅助双水相提取的艾纳香总黄酮还原力显著高于一般回流提取（P<0.05）。当浓度为0.5 mg/mL时，超声辅助双水相提取的吸光度D700 nm为1.35 。
2.3.3羟自由基清除率
由图5可知，回流提取与超声辅助双水相提取得到的艾纳香总黄酮对羟自由基均有较强的清除能力。随着总黄酮浓度的增加清除率也随之提高，且超声辅助双水相提取的清除能力显著高于一般回流提取（P<005）。当浓度为0.5 mg/mL时，超声辅助提取法的清除率为75.9%，而回流提取为69.1%。
3结论
超声波提取时间短、温度低、效率高，是高效、节能、环保式的提取方式[15-16]，结合乙醇-硫酸铵双水相体系操作，具有条件温和、处理量大、易于连续操作等优点，广泛应用于中药材提取、生物工程、药物分析和金属分离等方面。本研究以艾纳香为主要原料采用Box-Behnken响應曲面设计对其总黄酮超声辅助双水相提取工艺条件进行优化，并比较该法与传统回流提取所得的总黄酮进行抗氧化能力比较。结果表明，超声辅助双水相提取艾纳香总黄酮的最佳工艺条件为超声时间31 min、（NH4）2SO4的用量0.4 g/mL、液料比为 32 mL ∶1 g，此条件下提取的艾纳香总黄酮得率为（13.31±0.21）%。且对DPPH自由基、羟自由有较强的清除能力以及较高的还原力，且超声辅助双水相提取的艾纳香总黄酮抗氧化能力显著高于一般回流提取。
参考文献：
[1]师琴丽，覃军章，王用平，等. 贵州优势苗族药物艾纳香及其产品[J]. 中药材，2003，26（增刊1）：87-88.
[2]袁媛，庞玉新，王文全，等. 中国艾纳香属植物资源调查[J]. 热带生物学报，2011，2（1）：78-82.
[3]韦睿斌，庞玉新，杨全，等. 艾纳香黄酮类化学成分研究进展[J]. 广东药学院学报，2014，30（1）：123-127.
[4]Tabaraki R，Nateghi A. Optimization of ultrasonic-assisted extraction of natural antioxidants from rice bran using response surface methodology[J]. Ultrasonics Sonochemistry，2011，18（6）：1279-1286.
[5]Chemat F，Zill-e-Huma Z，Khan M K. Applications of ultrasound in food technology：processing，preservation and extraction[J]. Ultrasonics Sonochemistry，2011，18（4）：813-835.
[6]Zhi W B，Deng Q Y. Purification of salvianolic acid B from the crude extract of Salvia miltiorrhiza with hydrophilic organic/salt-containing aqueous twophase system by counter-current chromatography[J]. Journal of Chromatography，2006，16（11）：149-152.
[7]Shen S F，Chang Z D，Liu J，et al. Separation of glycyrrhizic acid and liquiritin from Glycyrrhiza uralensis Fisch extract by three-liquid phase extraction systems[J]. Separation and Purification Technology，2007，53（3）：216-223.[HJ1.75mm]
[8]王志华，马会民，马泉莉，等. 双水相萃取体系的研究[J]. 应用化学，2001，18（3）：173-175.
[9]林金清，董军芳，李夏兰. 乙醇/硫酸铵双水相体系萃取甘草酸钾的研究[J]. 精细化工，2004，21（3）：165-173.
[10]张艳霞，朱彩平，邓红，等. 超声辅助双水相提取石榴皮多酚[J]. 食品与发酵工业，2016，42（12）：150-156.
[11]徐春明，李婷，王英英，等. 微波辅助双水相提取苦荞麦粉中黄酮类化合物[J]. 食品科学技术学报，2014，32（6）：36-41.
[12]Kim D，Lee K W，Lee H J，et al. Vitamin C equivalent antioxidant capacity（VCEAC）of phenolic phytoche-micals[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry，2002，50（13）：3713-3717.
[13]陈美珍，余杰，郭慧敏，等. 大豆分离蛋白酶解物清除羟自由基作用的研究[J]. 食品科学，2002，23（1）：43-47.
[14]刘水英，李新生，党娅，等. 响应面法优化紫山药花青苷提取工艺及其抗氧化活性[J]. 食品科学，2014，35（22）：84-91.
[15]蓝峻峰，张春艳. 超声波辅助热提艾蒿黄酮工艺优化[J]. 江苏农业科学，2015，43（8）：267-269.
[16]刘彬，楚冬海. 超声波提取明日叶总黄酮的工艺研究[J]. 江苏农业科学，2016，44（2）：338-339.