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摘 要：通过单因素试验和正交试验对超声波提取辅酶Q10的工艺条件进行了优化，确定了类球红细菌辅酶Q10的最佳提取条件为：输出功率为55%、每次辐射时间为3s、工作总时间为6min、菌液浓度OD为23.4，条件优化后辅酶Q10单位细胞产量达到11.86mg/L。
关键词：类球红细菌；辅酶Q10；单位细胞产量
中图分类号 Q939.97 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2014）06-23-03
辅酶Q10，又称癸烯醌、泛醌（商品名：Coenzyme Q10，简称CoQ10），是一种存在于革兰氏阴性细菌、植物细胞和动物肝脏中的脂溶性醌类化合物，是细胞呼吸传递链上的重要递氢体[1]。辅酶Q10作为一种生理活性物质，具有保健、改善作用，因此被广泛应用于药业、化妆和食品产业[2]。辅酶Q10参与细胞的代谢活动，并且可以用来治疗心脏病、高胆固醇、高血压、老年痴呆症、帕金森症等疾病[3]。
目前制备生产辅酶Q10的方法有微生物发酵法、化学合成法和动植物组织提取法[4]，其中微生物发酵法被认为是最有发展前景的[5-7]，辅酶Q10存在菌体细胞线粒体内膜上，属于细胞内产物。所以辅酶Q10的提取和检测首先涉及到如何充分地破坏细胞使其细胞内的辅酶Q10尽量的释放出来而被检测。而辅酶Q10的侧链存在着不饱和双键，使辅酶Q10的在提取过程中容易受到氧化剂、紫外线等因素的影响，这是由于辅酶Q10的侧链存在着不饱和双键易受到这些因素影响而发生氧化和加成反应，使其散失原有的生物活性，甚至会形成对人体有害的物质，因此研究提取因素对辅酶Q10的影响具有重要的应用价值。
为了能够得到和检测辅酶Q10，首先必须对菌体进行破壁，使其体内辅酶Q10能够释放出来，而常见的细胞破壁方法有非机械法和机械法，本研究选择了机械法中的超声波破壁法，对超声波输出功率、每次辐射时间、工作总时间和菌液浓度条件进行了优化，以确定辅酶Q10的最佳提取条件。
1 材料与方法
1.1 材料 菌株 Rhodobacter sphaeroate EIM，由福建师范大学工业微生物教育部工程研究中心保藏。
1.2 主要试剂和仪器 无水乙醇、电热恒温水浴锅（DK-80）、超声波破碎仪（BIOMETRA）、高速冷冻离心机（AllegraTMX-22R Centrifuge）、超高效液相色谱仪（Acquity UPLC）等。
1.3 实验方法
1.3.1 发酵液的预处理 辅酶Q10是类维生素脂溶性物质，且属于胞内产物，因此提取辅酶Q10包括以下2步：进行细胞的破碎和辅酶Q10的溶解分离。取5mL发酵液在8 000r/min的条件下离心10min，弃去上清液，无水乙醇洗涤1～2次，并用无水乙醇制成悬浊液，定容至20mL，利用超声波破碎仪进行破碎细胞。
1.3.2 菌体干重的测定 发酵液经过8 000r/min离心10min，去上清液并用蒸馏水洗涤后，放置100℃烘箱中烘干至恒重后称量。
1.3.3 发酵液中辅酶Q10的测定 取1mL发酵液置于10mL的棕色容量瓶中，滴加20μL的6mol/L的HCl，加入1mL的丙酮，摇匀，加1mL的30%过氧化氢，摇匀，再加入无水乙醇2mL，摇匀，预超声1min去除气泡，最后用无水乙醇定容至10mL，超声45min，超声结束后摇匀静止30min，用0.22μm的有机膜过滤即可得到辅酶Q10样品，再用WATERS-Acquity UPLC进行分析测定。
2 结果与讨论
2.1 超声波输出功率对辅酶Q10提取的影响 用超声波每次辐射/间歇时间为5s/6s、总工作时间为5min、菌液OD为22.3对处理后的发酵液进行超声波处理，考察超声波输出功率对辅酶Q10提取的影响（图1）。
由图1可知当超声波的输出功率过小时，对菌体细胞的破碎程度不够强烈，导致细胞不能被破碎，使细胞内的辅酶Q10无法溶解在乙醇中。输出功率的提高有利于液体中空穴的形成，从而形成更多的空化泡产生空化效应，有利于细胞的破碎。当继续提高超声波功率，发现超声波输出功率在55%时辅酶Q10提取量最高，但是超声波输出功率超过55%后，辅酶Q10提取量呈现下降趋势，分析原因是超声过程中产生的空化作用对细胞产生了局部的高温高压，使得溶液中产生了H·和OH·等自由基[8]，这些强氧化性的自由基会氧化和降解溶液中的辅酶Q10，从而使辅酶Q10提取量下降。因而确定超声波的最佳输出功率为55%。
2.2 超声波每次辐射时间对辅酶Q10提取的影响 用超声波功率55%、总工作时间为5min、菌液OD为22.3对处理后的发酵液进行超声波处理，考察超声波每次辐射时间对辅酶Q10提取的影响（图2）。
结果表明，在超声条件相同的情况下，每次辐射时间为4s效果最好，此时提取的辅酶Q10量最高。超声波破碎细胞的过程：超声波使溶液形成空穴，从而产生空化泡，然后再由空化泡进行震动、膨胀、压缩和崩溃闭合的过程，这一过程由短暂的时间来完成的，短时多次的工作方式有利于超声波产生更多的空化泡，有更多的机会完成膨胀和爆炸的过程，因此有利于细胞的破碎[9]。不过当每次辐射时间过短时，辅酶Q10提取量反而下降，这可能是由于辐射时间过短导致超声波空化作用起不到对细胞爆裂破壁作用所致。当每次辐射时间达到4s时，辅酶Q10提取量最大，当继续提高每次辐射时间辅酶Q10提取量却下降了，这可能是由于辐射时间越长使得超声波产生的空化作用越强，导致产生的活性氧也越多，辅酶Q10被氧化降解，提取量下降。因此，选择4s作为超声波的最佳辐射时间。
2.3 超声波工作总时间对辅酶Q10提取的影响 用超声波功率55%、超声波每次辐射/间歇时间为4s/6s、菌液OD为22.3对处理后的发酵液进行超声波处理，考察超声波工作总时间对辅酶Q10提取的影响（图3）。 在超声波其他条件都固定的前提下，随着工作总时间的提高，辅酶Q10提取量也随着增加，这是由于工作时间充分，细胞破碎充分，辅酶Q10从细胞中被提取的量也增多，但是随着工作总时间进一步提高，辅酶Q10的提取量反而下降，这是由于辅酶Q10对光敏感，见光易分解，长时间暴露在空气中，易被氧化。所以适当提高工作总时间可以提高辅酶Q10提取量，但时间不宜过长，最佳总工作时间为4min。
2.4 菌液浓度对辅酶Q10提取的影响 用超声波功率55%、超声波每次辐射/间歇时间为4s/6s、工作总时间为4min，对处理后的发酵液进行超声波处理，考察菌液浓度对辅酶Q10提取的影响（图4）。
从图中4可以看出随着菌液浓度的增加，辅酶Q10的提取量呈现先增加后减少的趋势。原因是当菌液浓度很稀时，超声波在溶液中传递的能量损失很大，表现出来的破碎细胞效果也很差，随着菌液浓度的进一步提高，超声波传递过程的能量进一步减少，辅酶Q10的提取量也增多，但是菌液浓度过稠时，却不利于超声波过程中空化泡的形成及膨胀和爆炸，导致细胞的破碎效果不好[10]。
2.5 正交试验确定最佳提取条件 根据单因素试验的结果，以超声波输出功率、每次辐射时间、工作总时间、菌液浓度为主要因素，确定步长和方向，进行4因素3水平的正交试验（表1），结果见表2，方差分析结果见表3。
由表3可知，超声波输出功率、每次辐射时间、工作总时间对提取效果均有极显著的影响，菌液浓度对辅酶Q10提取效果影响不显著。根据R值比较了各个因素对辅酶Q10提取效果的影响程度依次为超声波输出功率>工作总时间>每次辐射时间>菌液浓度，综合各个因素的k值比较可得A2B1C3D2为最佳破碎条件，即超声波输出功率为55%、每次辐射时间为3s、工作总时间为6min、菌液浓度为23.4。在此条件下，辅酶Q10的提取量达到11.86mg/L。
3 小结
通过单因素试验和正交试验优化了超声波破碎仪提取辅酶Q10的工艺条件。确定了辅酶Q10最佳提取条件为：超声波输出功率为55%、每次辐射时间为3s、工作总时间为6min、菌液浓度OD为23.4。
采用超声波破碎细胞过程要在冰浴条件下进行，从而降低超声过程中产生的热对辅酶Q10的破坏，而且提取辅酶Q10过程应该尽量避光，这是由于辅酶Q10见光易分解。
参考文献
[1]Lenaz G，Fato R，Formiggini G，et a1.The role of coenzyme Q in mitochondrial electron transport[J].Mitochondrion，2007，7：8-33.
[2]Kawamukai M.Biosynthesis，bioproduction and novel roles of ubiquinone[J].Journal of Bioscience and Bioengineering，2002，94（6）：511-517.
[3]Wyman M， Leonard M，Morledge T.Coenzyme Q10：a therapy for hypertension and statin-induced myalgia[J].Cleveland Clinic journal of medicine，2010，77（7）：435-442.
[4]李英华.烟草细胞培养生产辅酶Q10 的研究[D].沈阳：沈阳农业大学，2009.
[5]HY，YK，KO，et al. Production of ubiquinone 10 using bacteria[J].J Gen Appl Microbial，1998，44（1）：19-26.
[6]吴祖芳，翁佩芳，陈坚.辅酶Q10 的功能研究进展[J].宁波大学学报（理工版），2001（2）：85-88.
[7]赵树全，刘悦才，江国托.酿酒酵母菌体中辅酶Q10 的提取及测定方法[J].酿酒科技，2008（11）：114-116.
[8]欧阳琴，陈兴才，黄亚治.雨生红球藻提取虾青素不同机械破壁方法的研究[J].福州大学学报：自然科学版，2005，33（1）：111-115.
[9]吴克刚，杨连生，黄通旺.超声波破碎Thraustochyt rium 提取脂质的研究[J].郑州工程学院学报，2001，22（4）：31-34.
[10]傅绍军，李微，朱利民.瑞士乳酸杆菌摇瓶发酵条件及产酶条件优化[J].药物生物技术，2005（6）：361-365. （责编：施婷婷）
关键词：类球红细菌；辅酶Q10；单位细胞产量
中图分类号 Q939.97 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2014）06-23-03
辅酶Q10，又称癸烯醌、泛醌（商品名：Coenzyme Q10，简称CoQ10），是一种存在于革兰氏阴性细菌、植物细胞和动物肝脏中的脂溶性醌类化合物，是细胞呼吸传递链上的重要递氢体[1]。辅酶Q10作为一种生理活性物质，具有保健、改善作用，因此被广泛应用于药业、化妆和食品产业[2]。辅酶Q10参与细胞的代谢活动，并且可以用来治疗心脏病、高胆固醇、高血压、老年痴呆症、帕金森症等疾病[3]。
目前制备生产辅酶Q10的方法有微生物发酵法、化学合成法和动植物组织提取法[4]，其中微生物发酵法被认为是最有发展前景的[5-7]，辅酶Q10存在菌体细胞线粒体内膜上，属于细胞内产物。所以辅酶Q10的提取和检测首先涉及到如何充分地破坏细胞使其细胞内的辅酶Q10尽量的释放出来而被检测。而辅酶Q10的侧链存在着不饱和双键，使辅酶Q10的在提取过程中容易受到氧化剂、紫外线等因素的影响，这是由于辅酶Q10的侧链存在着不饱和双键易受到这些因素影响而发生氧化和加成反应，使其散失原有的生物活性，甚至会形成对人体有害的物质，因此研究提取因素对辅酶Q10的影响具有重要的应用价值。
为了能够得到和检测辅酶Q10，首先必须对菌体进行破壁，使其体内辅酶Q10能够释放出来，而常见的细胞破壁方法有非机械法和机械法，本研究选择了机械法中的超声波破壁法，对超声波输出功率、每次辐射时间、工作总时间和菌液浓度条件进行了优化，以确定辅酶Q10的最佳提取条件。
1 材料与方法
1.1 材料 菌株 Rhodobacter sphaeroate EIM，由福建师范大学工业微生物教育部工程研究中心保藏。
1.2 主要试剂和仪器 无水乙醇、电热恒温水浴锅（DK-80）、超声波破碎仪（BIOMETRA）、高速冷冻离心机（AllegraTMX-22R Centrifuge）、超高效液相色谱仪（Acquity UPLC）等。
1.3 实验方法
1.3.1 发酵液的预处理 辅酶Q10是类维生素脂溶性物质，且属于胞内产物，因此提取辅酶Q10包括以下2步：进行细胞的破碎和辅酶Q10的溶解分离。取5mL发酵液在8 000r/min的条件下离心10min，弃去上清液，无水乙醇洗涤1～2次，并用无水乙醇制成悬浊液，定容至20mL，利用超声波破碎仪进行破碎细胞。
1.3.2 菌体干重的测定 发酵液经过8 000r/min离心10min，去上清液并用蒸馏水洗涤后，放置100℃烘箱中烘干至恒重后称量。
1.3.3 发酵液中辅酶Q10的测定 取1mL发酵液置于10mL的棕色容量瓶中，滴加20μL的6mol/L的HCl，加入1mL的丙酮，摇匀，加1mL的30%过氧化氢，摇匀，再加入无水乙醇2mL，摇匀，预超声1min去除气泡，最后用无水乙醇定容至10mL，超声45min，超声结束后摇匀静止30min，用0.22μm的有机膜过滤即可得到辅酶Q10样品，再用WATERS-Acquity UPLC进行分析测定。
2 结果与讨论
2.1 超声波输出功率对辅酶Q10提取的影响 用超声波每次辐射/间歇时间为5s/6s、总工作时间为5min、菌液OD为22.3对处理后的发酵液进行超声波处理，考察超声波输出功率对辅酶Q10提取的影响（图1）。
由图1可知当超声波的输出功率过小时，对菌体细胞的破碎程度不够强烈，导致细胞不能被破碎，使细胞内的辅酶Q10无法溶解在乙醇中。输出功率的提高有利于液体中空穴的形成，从而形成更多的空化泡产生空化效应，有利于细胞的破碎。当继续提高超声波功率，发现超声波输出功率在55%时辅酶Q10提取量最高，但是超声波输出功率超过55%后，辅酶Q10提取量呈现下降趋势，分析原因是超声过程中产生的空化作用对细胞产生了局部的高温高压，使得溶液中产生了H·和OH·等自由基[8]，这些强氧化性的自由基会氧化和降解溶液中的辅酶Q10，从而使辅酶Q10提取量下降。因而确定超声波的最佳输出功率为55%。
2.2 超声波每次辐射时间对辅酶Q10提取的影响 用超声波功率55%、总工作时间为5min、菌液OD为22.3对处理后的发酵液进行超声波处理，考察超声波每次辐射时间对辅酶Q10提取的影响（图2）。
结果表明，在超声条件相同的情况下，每次辐射时间为4s效果最好，此时提取的辅酶Q10量最高。超声波破碎细胞的过程：超声波使溶液形成空穴，从而产生空化泡，然后再由空化泡进行震动、膨胀、压缩和崩溃闭合的过程，这一过程由短暂的时间来完成的，短时多次的工作方式有利于超声波产生更多的空化泡，有更多的机会完成膨胀和爆炸的过程，因此有利于细胞的破碎[9]。不过当每次辐射时间过短时，辅酶Q10提取量反而下降，这可能是由于辐射时间过短导致超声波空化作用起不到对细胞爆裂破壁作用所致。当每次辐射时间达到4s时，辅酶Q10提取量最大，当继续提高每次辐射时间辅酶Q10提取量却下降了，这可能是由于辐射时间越长使得超声波产生的空化作用越强，导致产生的活性氧也越多，辅酶Q10被氧化降解，提取量下降。因此，选择4s作为超声波的最佳辐射时间。
2.3 超声波工作总时间对辅酶Q10提取的影响 用超声波功率55%、超声波每次辐射/间歇时间为4s/6s、菌液OD为22.3对处理后的发酵液进行超声波处理，考察超声波工作总时间对辅酶Q10提取的影响（图3）。 在超声波其他条件都固定的前提下，随着工作总时间的提高，辅酶Q10提取量也随着增加，这是由于工作时间充分，细胞破碎充分，辅酶Q10从细胞中被提取的量也增多，但是随着工作总时间进一步提高，辅酶Q10的提取量反而下降，这是由于辅酶Q10对光敏感，见光易分解，长时间暴露在空气中，易被氧化。所以适当提高工作总时间可以提高辅酶Q10提取量，但时间不宜过长，最佳总工作时间为4min。
2.4 菌液浓度对辅酶Q10提取的影响 用超声波功率55%、超声波每次辐射/间歇时间为4s/6s、工作总时间为4min，对处理后的发酵液进行超声波处理，考察菌液浓度对辅酶Q10提取的影响（图4）。
从图中4可以看出随着菌液浓度的增加，辅酶Q10的提取量呈现先增加后减少的趋势。原因是当菌液浓度很稀时，超声波在溶液中传递的能量损失很大，表现出来的破碎细胞效果也很差，随着菌液浓度的进一步提高，超声波传递过程的能量进一步减少，辅酶Q10的提取量也增多，但是菌液浓度过稠时，却不利于超声波过程中空化泡的形成及膨胀和爆炸，导致细胞的破碎效果不好[10]。
2.5 正交试验确定最佳提取条件 根据单因素试验的结果，以超声波输出功率、每次辐射时间、工作总时间、菌液浓度为主要因素，确定步长和方向，进行4因素3水平的正交试验（表1），结果见表2，方差分析结果见表3。
由表3可知，超声波输出功率、每次辐射时间、工作总时间对提取效果均有极显著的影响，菌液浓度对辅酶Q10提取效果影响不显著。根据R值比较了各个因素对辅酶Q10提取效果的影响程度依次为超声波输出功率>工作总时间>每次辐射时间>菌液浓度，综合各个因素的k值比较可得A2B1C3D2为最佳破碎条件，即超声波输出功率为55%、每次辐射时间为3s、工作总时间为6min、菌液浓度为23.4。在此条件下，辅酶Q10的提取量达到11.86mg/L。
3 小结
通过单因素试验和正交试验优化了超声波破碎仪提取辅酶Q10的工艺条件。确定了辅酶Q10最佳提取条件为：超声波输出功率为55%、每次辐射时间为3s、工作总时间为6min、菌液浓度OD为23.4。
采用超声波破碎细胞过程要在冰浴条件下进行，从而降低超声过程中产生的热对辅酶Q10的破坏，而且提取辅酶Q10过程应该尽量避光，这是由于辅酶Q10见光易分解。
参考文献
[1]Lenaz G，Fato R，Formiggini G，et a1.The role of coenzyme Q in mitochondrial electron transport[J].Mitochondrion，2007，7：8-33.
[2]Kawamukai M.Biosynthesis，bioproduction and novel roles of ubiquinone[J].Journal of Bioscience and Bioengineering，2002，94（6）：511-517.
[3]Wyman M， Leonard M，Morledge T.Coenzyme Q10：a therapy for hypertension and statin-induced myalgia[J].Cleveland Clinic journal of medicine，2010，77（7）：435-442.
[4]李英华.烟草细胞培养生产辅酶Q10 的研究[D].沈阳：沈阳农业大学，2009.
[5]HY，YK，KO，et al. Production of ubiquinone 10 using bacteria[J].J Gen Appl Microbial，1998，44（1）：19-26.
[6]吴祖芳，翁佩芳，陈坚.辅酶Q10 的功能研究进展[J].宁波大学学报（理工版），2001（2）：85-88.
[7]赵树全，刘悦才，江国托.酿酒酵母菌体中辅酶Q10 的提取及测定方法[J].酿酒科技，2008（11）：114-116.
[8]欧阳琴，陈兴才，黄亚治.雨生红球藻提取虾青素不同机械破壁方法的研究[J].福州大学学报：自然科学版，2005，33（1）：111-115.
[9]吴克刚，杨连生，黄通旺.超声波破碎Thraustochyt rium 提取脂质的研究[J].郑州工程学院学报，2001，22（4）：31-34.
[10]傅绍军，李微，朱利民.瑞士乳酸杆菌摇瓶发酵条件及产酶条件优化[J].药物生物技术，2005（6）：361-365. （责编：施婷婷）